徐海明[1]2000年在《人基因组中DNA调节片段的快速富集与筛选》文中研究指明随着人类基因组测序工作的顺利进行，基因组功能的研究已显得越来越紧迫。基因组的功能主要包括基因转录产物的功能、基因表达调节的功能以及基因组自身组织和进化的功能。其中基因实现有序、协调表达以及基因组形成高级结构是通过DNA与蛋白质的相互作用来完成的。发展新的研究思路，建立有效的技术方法，筛选、鉴定基因组中的DNA调节片段，是筛选DNA结合蛋白、揭示基因表达调节和基因组自身组织规律的基础。 目前，绝大多数基因的转录调节机制研究尚未开展。这主要是由于已有的研究方法难以大量筛选、鉴定DNA调节元件，大多数基因的DNA调节区仍未被确定。另外，由于转录调节因子在细胞中的表达水平很低，利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质，目前已克隆的转录因子不多，对这些因子的表达模式和DNA-蛋白质相互作用规律尚缺乏足够的研究。利用现有的软件对DNA上的蛋白质结合位点进行分析，即使在体外实验证实没有蛋白质结合的DNA片段上，往往检索出大量的结合位点，难以获得有价值的信息。筛选、鉴定DNA调节片段和相应的转录调节因子，研究DNA与蛋白质相互作用的规律，仍然是当前转录调节研究的一个重要任务。 目前，已发展了多种方法筛选、鉴定DNA调节片段，主要包括以下几种。1) DNA连续删切分析：是最常用的方法，可初步确定DNA调节元件的大致位置、功能活性。但该方法对DNA片段进行连续删切时需要合适的限制性核酸内切酶位点。2) DNase Ⅰ敏感性分析：是初步确定体内重要调节区的常用方法，能较真实地反映体内调节机制，但该方法技术难度较大。另外，以上这两种方法不能克隆新的基因片段，只能对已经获得的基因片段进行分析：对于DNA
吕湘[2]2002年在《用改进的RERS方法富集与筛选Apo(a)-Plasminogen基因簇中的调节片段》文中指出面对气象万千的外部环境和自身分化、发育的需要，细胞中必然存在一个极为精密的表达调控网络，时刻监测外来和自身因素的变化并作出反应，实现基因间协调有序的关系，维持细胞乃至个体的稳定状态和发展的需要。了解这个网络的结构组成、各组件间相互识别的方式及其变化，是后基因组时代的主要任务之一。 转录水平的调节是基因表达调控网络中最重要的环节。已有研究表明DNA顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用是染色质重塑和基因转录调节的基础。筛选、鉴定基因组中的调节片段和它们相应的DNA结合蛋白，阐明这些元件的结构与功能关系，是基因调控研究的主要内容。 现有的研究方法难以大量筛选、鉴定DNA调节元件，它们在筛选DNA调节片段时，或者效率不高，不能快速、大量地筛选基因组中的DNA调节元件，或者需要纯化的转录因子和抗体，只能分离与已知蛋白质结合的DNA片段。另外，由于转录调节因子在细胞中的表达水平极低，利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质。目前已克隆的转录因子不多，对这些因子的表达模式和DNA—蛋白质相互作用规律尚缺足够的研究。因此，建立一种能在大范围内高效筛选和鉴定DNA调控元件的方法，仍然是目前转录调控研究的当务之急。 本实验室在对原有的全基因组PCR技术进行改进的基础上，结合凝胶阻滞实验，建立了筛选DNA调节片段的新方法(Rapid Enrichment and selection of Regulatory Sequence，RERS)。其基本原理是通过超声将基因组DNA随机打断，与DNA连接子相连后进行全基因组PCR扩增、标记，回收200bp左右的DNA片段作为探针，与K562细胞粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收阻滞带DNA再次进行PCR扩增，作为新一轮凝胶阻滞实验的探针，与核粗提物再次进行凝胶阻滞实验。如此重复多轮，不断富集可与K562细胞核粗提物结合的DNA，建立富含调节片段的DNA部分文库，从中筛选出能与核蛋白特异结合和具有细胞特异结合模式的DNA调节片段。与其它已有的方法相比，这种方法具有以下优点：1) 能快速、大范围地富集、筛选基因组中的调控片段。2) 能筛选具有细胞特异结合模式的DNA调节片段。3) 操作简单，不需要纯化的转录因子或相应的抗体，也不用其它特殊材
张晶[3]1997年在《白细胞介素2受体α基因结构和功能的研究》文中指出由白细胞介素2(IL-2)及其受体(IL-2R)为核心的自分泌体系在T淋巴细胞的正常生长、增殖和免疫功能的发挥中起着关键作用。高亲和力的白细胞介素2受体至少由α、β、γ三种亚基组成，其中只有α亚基呈诱导表达，而且是淋巴细胞中结合IL-2的唯一特异成分，因此，IL-2α亚基在机体对IL-2作用的免疫效应中起着重要作用，与其相一致，IL-2Rα亚基的表达受到严格的调控。 基因定向整合技术是新近发展起来可用于细胞基因组定向修饰的新方法。为了研究IL-2Rα基因在T淋巴细胞的功能，并建立体细胞基因敲除的模式系统，我们对在Jurkat细胞中敲除IL-2Rα基因进行了探索，并对IL-2Rα基因第一内含子的转录调控活性进行了初步研究。 一、悬浮细胞甲基纤维素半固体克隆化培养方法的建立与Jurkat Tet-on细胞系的建立。我们借鉴在杂交瘤细胞中用于克隆化培养的甲基纤维素半固体培养方法，用于悬浮细胞Jurkat细胞的克隆化培养，成功地建立了Jurkat Tet-on细胞系-rtTA③。通过Southern杂交显示，在rtTA③细胞中有rtTA基因的整合，Luciferase报告基因的转染结果表明，rtTA③细胞系在Dox 1μg／ml浓度下诱导近30倍的Luciferase的表达。 二，IL-2Rα基因第三内含子的克隆与核苷酸序列测定。应用PCR方法，扩增了IL-2Rα基因第三内含子2.5Kb片段，并成功克隆到pBS-SK载体中。构建了一系列亚克隆并测定了2.5Kb全核苷酸序列，其中2228bp碱基序列为国内外首次测定，此核苷酸序列已被Genbank接受，接受号为U56389。通过计算机分析发现IL-2Rα基因第三内含子具有典型的G↓GU……Py rich(～15bp)NCAG↓GU结构特点，
吴芸[4]2017年在《CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统的构建及其在猪基因组编辑中的应用研究》文中指出基因组编辑是借助于细胞自身的DNA损伤修复机制对目标基因序列进行碱基删除、插入或突变的基因组操作过程。早期仅依靠自发性同源重组的基因组编辑效率极低,直到人工核酸酶出现,由人工核酸酶定点切割DNA产生双链断裂,激活体内DNA修复机制进行定点的基因组编辑,极大的提高了编辑的效率。随着测序技术的不断发展,一些基因得到注释,基因功能的研究成为重点和热点,目前研究基因功能的手段主要是基因修饰技术。近年来,CRISPR/Cas9核酸酶以其简单、快捷、高效的特点迅速发展,广泛运用于不同种类细胞的基因组修饰。精准的定点基因组编辑技术不仅能推进基因功能的研究,用于构建人类疾病模型、基因治疗,还能加快动物的遗传改良。双等位基因基因组修饰细胞的获得费时、费力且效率很低,目前这仍然是基因组编辑技术中的一个难点。本研究开发了一套CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统。该系统有效整合了基因编辑阳性细胞富集报告系统(Surrogate Reporter,Rep)与含有sgRNA的供体系统(Donor,Don)。其特点是既能作为供体提供修复的模板,又能作为报告系统反应核酸酶的活性和靶位点整合的效率。首先在哺乳动物细胞中对该系统(Rep/Don)进行了概念验证,结果显示双等位基因位点的基因敲入效率得到了显著提高。随后用Rep/Don打靶系统在猪PK15细胞上对lnc-sscg3623基因进行了基因编辑研究,同样获得了高效双等位基因位点的编辑结果。1.构建用于哺乳动物细胞基因组编辑的三个整合系统Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR。其中Rep/Don PG系统中包含一个抗性基因(puror)和一个荧光蛋白基因(eGFP),两个基因通过剪切肽(T2A)连接(Puror-eGFP)。与前述整合系统类似,Rep/Don NR和Rep/Don ZR系统中分别含有Neor-mRFP和Zeor-mRFP元件。三个整合系统中每个抗性基因编码区分别插入了CRISPR/Cas9的靶位点序列,该靶位点序列的两端含有200 bp的抗性基因重复片段,从而构成了SSA(Single Strand Annealing)结构,当CRISPR/Cas9核酸酶对靶序列进行切割后,产生载体DNA的双链断裂,诱导细胞内DNA损伤修复机制的激活。从而对载体进行SSA介导的损伤修复,修复的结果导致抗性基因的阅读框恢复正常表达。除了对整合系统中的报告基因进行靶向切割外,CRISPR/Cas9同时对细胞基因组上的靶位点进行切割,由于整合载体中含有基因组上靶位点的同源序列,细胞对基因组DNA的损伤将会通过同源重组(Homologous Directed Repair,HDR)修复机制以载体为模板进行修复,通过对修复后的抗性基因筛选,能够实现对基因组编辑后的阳性细胞富集。由于两个等位基因位点上整合了含有不同抗性基因的供体,因此同时对两个抗性基因的筛选能够实现对双等位基因位点编辑细胞的富集。2.将构建的Rep/Don PG和Rep/Don ZR打靶系统在HEK293T细胞上对目标基因CCR5进行了编辑,结果表明,Rep/Don PG和Rep/Don ZR单系统的双敲效率分别是2.33%和2.08%,Rep/Don PG+ZR的双敲效率为34.09%。3.通过药物杀伤实验确定嘌呤霉素(Puromycin)、G418和博莱霉素(Zeocin)这三种抗生素药物在猪PK15细胞中的最佳工作浓度。嘌呤霉素的最佳筛选浓度是1μg/mL,G418是1200μg/mL,博莱霉素为400μg/mL。4.设计三条猪lncRNA基因lnc-sscg3623的sgRNA,构建了相应的CRISPR/Cas9表达载体和RPG报告载体,共转染HEK293T细胞后通过绿色荧光蛋白报告基因的表达,初步判别sgRNA的效率,选择了活性较高的sgRNA Tar2和sgRNA Tar1用于后续实验。5.构建了用于编辑猪lnc-sscg3623基因两个靶位点Tar2和Tar1的Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR打靶系统及对应的CRISPR/Cas9打靶载体。在lnc-sscg3623基因Tar1位点,Rep/Don PG、Rep/Don NR和Rep/Don ZR单个打靶系统在猪PK15细胞系中的单敲效率分别为:25%、37.5%和26.32%。Rep/Don PG+ZR的双敲效率为:10%。在Tar2位点,经过各打靶系统对应的抗生素(嘌呤霉素、G418和博莱霉素)筛选后,得到敲入的阳性细胞,三个单系统Rep/Don PG、Rep/Don NR、Rep/Don ZR的单敲效率分别为:75%、65%和64.86%;双敲效率分别是:6.81%、7.5%和2.7%。lnc-sscg3623Tar2.Rep/Don PG+NR双系统的靶向双敲效率为16.67%,lnc-sscg3623Tar2.Rep/Don PG+ZR双系统双敲效率为18.18%。本研究开发了一套CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统,为基因功能研究、畜禽经济性状改良提供了研究基础。
杨倩[5]2018年在《hnRNP K与宫颈癌变的关系以及与Siha细胞全基因组的结合和功能分析》文中指出目的宫颈癌是受多因素影响的复杂疾病,持续感染高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)已被公认为宫颈癌的必要病因,但在其发生发展过程中尚有其他因素作用。核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)含有的KH域能识别并结合DNA和RNA序列,参与调控基因表达、细胞周期、凋亡及细胞侵袭和转移等多种生物学过程,对肿瘤的发生发展具有重要意义。现已发现hnRNP K在众多肿瘤中异常高表达,但在宫颈癌变中的表达情况尚不清楚。目前对hnRNP K与DNA相互作用的研究多见于和某些基因的启动子结合,而在宫颈癌细胞中与全基因组DNA的结合情况并不明确。本次研究旨在探讨hnRNP K与宫颈癌变的关系,并利用染色质免疫沉淀(Ch IP)与二代测序相结合的染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)技术,在Siha细胞中系统、全面地了解hnRNP K在全基因组的结合位点、可能发挥的功能及参与的通路等,为后续深入研究宫颈癌的发病机制提供新线索,也为寻找宫颈癌防治靶点提供科学依据。方法从课题组2014年6月至2014年9月在山西介休建立的宫颈病变研究队列和山西省肿瘤医院中选取经宫颈液基薄层细胞学技术(TCT)筛查、阴道镜检查及病理学确诊的宫颈正常(NC)者67例,低度宫颈上皮内瘤样变(CINI)患者69例,高度宫颈上皮内瘤样变(CINII/III)患者68例和宫颈鳞状细胞癌(SCC)患者40例作为研究对象。采用结构式问卷调查宫颈病变相关因素,并收集全部研究对象宫颈脱落细胞、活检或手术宫颈组织标本。采用导流杂交法检测HPV感染情况,Western Blot检测hnRNP K蛋白表达水平,利用SPSS 21.0软件进行相关数据的Logistic回归分析、Kruskal-Wallis H检验、Bonferroni检验、c~2检验及c~2_(趋势)检验等。同时,选择HPV16阳性的Siha细胞为实验对象。应用Ch IP结合二代测序技术检测hnRNP K在全基因组的结合位点,利用MEME软件、GO数据库、KEGG数据库分别进行hnRNP K结合DNA序列的特征分析、hnRNP K结合基因功能的富集分析、hnRNP K结合基因通路的富集分析。结果1、hnRNP K蛋白表达与宫颈病变的关系:hnRNP K蛋白表达量在各宫颈病变组的总体分布差异有统计学意义(H=42.57,P<0.001),CINI组、CINII/III组及SCC组的表达量均高于NC组,除CINII/III组与SCC组的差异无统计学意义外z其余各组间的差异均有统计学意义。随着宫颈病变的进展,hnRNP K蛋白高表达率呈逐渐升高趋势(χ~2_(趋势)=21.20,P<0.001)。调整宫颈病变相关因素后,hnRNP K蛋白高表达可增加罹患CINII/III(OR=6.23,95%CI:2.50-13.44)和SCC(OR=5.01,95%CI:2.15-14.02)的风险。2、hnRNP K结合位点在全基因组的分布:hnRNP K与全基因组DNA结合位点的个数为21963个,平均长度150bp,每条染色体上均有hnRNP K结合位点的分布,其中1号、2号、5号和X染色体上的结合位点较多。hnRNP K结合位点多处于基因间区(31.85%)和内含子区(28.56%),但在外显子区、转录起始位点上游2kb以及转录起始位点下游2kb也有分布。3、hnRNP K结合DNA序列的特征分析:Motif(基序)分析发现,hnRNP K有4条易于结合的motif,这些motif中的胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)含量较高,尤其是胞嘧啶(C)含量最高,提示hnRNP K倾向结合于胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)富集的DNA序列。4、hnRNP K结合基因在染色体上的分布:21963个hnRNP K结合位点中有14968个被注释为基因片段,覆盖1321个基因,每条染色体上均有hnRNP K结合基因的分布,而分布于1号、2号、5号和7号染色体上的基因较多。5、hnRNP K结合基因的功能分析:GO富集分析发现,hnRNP K结合的基因在Molecular Function层面主要富集于核酸结合(GO:0003676),包括DNA结合(GO:0003677)及RNA结合(GO:0003723),还有转运活性(GO:0005215)、分子功能调节(GO:0098772)及转录辅因子活性(GO:0003712)等;Biological Process层面主要包括细胞进程的调控(GO:0050794)、信号转导(GO:0007165)、RNA加工(GO:0006396)、生物调节(GO:0065007)及细胞周期调控(GO:0051726)等;Cellular Component层面主要有膜成分(GO:0016020)和细胞骨架(GO:0005856)等。6、hnRNP K结合基因的通路分析:pathway富集分析显示,富集于肿瘤通路(ko05200)的基因最多,并发现了乳腺癌(ko05224)、结直肠癌(ko05210)、子宫内膜癌(ko05213)、黑色素瘤(ko05218)、胰腺癌(ko05212)、前列腺癌(ko05215)等多个癌症通路,还有肿瘤坏死因子通路(ko04668)、肿瘤中转录失调(ko05202)、肿瘤中MicroRNAs(ko05206)等肿瘤相关通路;也有基因富集于RNA转运(ko03013)、p53信号通路(ko04115)、Wnt信号通路(ko04310)、MAPK信号通路(ko04010)、细胞周期(ko04110)、凋亡(ko04210)等重要通路。另外,本次研究特别发现了病毒致癌作用通路(ko05203)及雌激素信号通路(ko04915)与宫颈癌密切相关的通路。结论1、hnRNP K蛋白高表达可增加高度宫颈上皮内瘤样变和宫颈癌的罹患风险,其在低度宫颈上皮内瘤样变期即出现表达升高,提示hnRNP K蛋白可作为宫颈癌变早期诊断的生物标志。2、hnRNP K蛋白广泛地与人类基因组DNA结合,其结合位点和结合基因在每条染色体上均有分布。hnRNP K的结合位点主要分布于人类基因组的基因间区和内含子区,而不是启动子区,提示hnRNP K可能在宫颈癌中存在新的调控机制且更为复杂。3、hnRNP K具有调控基因转录和翻译,以及调节细胞周期、凋亡、迁移、黏附和分裂等生物学功能,在信号转导、生物调节等方面发挥不可忽视的作用。提示hnRNP K可能通过对细胞生物学行为的影响促进了宫颈癌的发生发展。4、hnRNP K结合的基因多富集于与肿瘤有关的生物学通路,而且参与调节一些重要的信号通路。值得关注的是,hnRNP K涉及到几条与宫颈癌密切相关的通路,如病毒致癌作用通路及雌激素信号通路,提示hnRNP K在宫颈癌发生发展中具有重要意义。
魏强[6]2017年在《全基因组功能性非编码RNA筛选系统的构建与验证》文中研究表明随着大规模高通量测序技术的迅猛发展,越来越多的研究表明非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在疾病调控和发生发展中发挥着非常重要的作用。目前,研究最多的功能ncRNA是发挥RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用的micro RNA和siRNA。但作为ncRNA家族中重要一员的长链非编码RNA(Long non-codng RNA,Lnc RNA),不仅在数量上占全部ncRNA的近80%,而且可通过和靶基因组成复杂的调控网络共同调节有机体的各种活动,如转录和翻译调控、转录后的表观遗传学修饰、控制细胞周期、细胞分化和细胞凋亡等。LncRNA在基因组中广泛存在,其表达水平的改变甚至是空间结构变化都可引起一系列蛋白表达和信号通路状态的变化。以DNA为模版的RNA转录由三种不同的RNA聚合酶(RNA Pol I、II和III)完成。RNA Pol II能够对mRNA和ncRNA转录,但RNA Pol I和RNA Pol III迄今仅被发现可以转录ncRNA。本研究室在运用两个相向排列的RNA Pol III型启动子U6和H1载体,成功构建随机siRNA干扰文库的基础上,遵循同样的思路自行设计并建立了以人基因组DNA衍生的nc RNA文库。通过将被随机打断的人基因组DNA片段插入到双启动子之间,成功构建了能够进行全基因组筛选的ncrna文库。为了确保文库的构建质量,我们利用gibsonassembly(ga)体外同源重组拼接技术,弥补了经典分子克隆方法在构建文库中的不足。该ncrna质粒文库一次组装数目约2.3×106,完成5次gibsonassembly即可达到1.2×107的文库库容。随机挑选8个阳性克隆的菌落pcr和dna测序分析证实了ncrna文库的多样性和代表性。为了验证新构建的ncrna文库的功能,我们尝试利用ncrna文库筛选人黑色素瘤细胞系a375中表达水平被特异性上调或下调后引起对维罗菲尼耐药的基因。我们发现亲本a375对维罗菲尼的致死浓度为10μm。将ncrna质粒文库包装为逆转录病毒文库并感染亲本a375细胞后,亲本a375细胞接受致死浓度10μm维罗菲尼的筛选。早期,成功感染文库的a375细胞大量死亡,但少部分存活细胞慢慢长出一些集落,将这些筛选后存活的混合池细胞命名为a375/hl。我们发现和亲本a375细胞相比,耐药细胞a375/hl形态狭长、呈梭形,呈间充质样形态改变;a375/hl细胞对维罗菲尼的敏感性降低。wst-1检测显示,亲本a375对维罗菲尼的半数抑制浓度为4.17μm,a375/hl对维罗菲尼的半数抑制浓度为8.76μm。在浓度为1μm的维罗菲尼作用下,a375/hl细胞的克隆形成能力远远大于亲本细胞a375。当30μm高浓度的维罗菲尼处理a375/hl细胞24小时后发现,耐药细胞a375/hl组更容易形成药物结晶,提示a375/hl可能比亲本细胞的药物泵出率高。实时荧光定量PCR检测显示,和亲本细胞A375相比,A375/HL细胞中上皮细胞标志物E-cadherin mRNA的表达降低,其它相关的间充质标志物表达升高。利用10条肿瘤相关信号通路荧光素酶报告基因检测技术发现,接受药物处理后,A375/HL中没有被激活的信号通路,包括Elk1/SRF、AP1、Myc/Max和STAT在内的多条信号通路受到显著抑制。据报道,BRAF抑制可导致其他信号通路的适应性激活。接着我们检测了EGFR信号通路中关键激酶Akt、STAT3、MEK和Erk的磷酸化水平。通过激光共聚焦显微镜检测发现基础状态下,p-Akt、p-STAT3、p-MEK和p-Erk在A375/HL细胞中的表达水平高于亲本细胞A375,提示有包括EGFR信号通路在内的其它信号通路的代偿激活。因此,我们认为利用ncRNA文库筛选出的对维罗菲尼耐药的细胞与其它研究中描述的获得性耐药细胞以及临床肿瘤耐药样本的耐药特性有共通性。这表明我们利用基于人基因组DNA衍生的ncRNA文库进行全基因组范围内对维罗菲尼耐药的功能基因筛选是有效可行的。最后,提取耐药细胞A375/HL的基因组DNA,通过PCR将耐药细胞基因组中插入的功能nc RNA序列连入测序引物,测序前检测构建的ncRNA测序文库的质量和含量。综上所述,本研究首次提出并建立了一个针对人类基因的利用基因组DNA进行文库构建的策略和功能筛选耐药基因的技术路线。这些前期研究工作显示这种文库的成功构建为规模化功能基因筛选研究提供了新的技术平台。
谢红涛[7]2006年在《梅山×大白F1代与其亲本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及特征分析》文中研究指明骨骼肌是动物体内最丰富的组织，其生长发育相关性状是肉用家畜最重要的性状之一。两个具有不同遗传基础的亲本杂交产生的后代在生长发育和肌肉品质等方面往往超过其双亲，产生杂种优势现象。为了更好的解释和利用杂种优势，人们提出了很多假说，但是都不能很好的解释杂种优势现象。随着分子生物学的发展，人们已经认识到杂种优势是基因差异表达的结果。本研究以猪背最长肌为材料，利用抑制消减杂交技术构建了梅山猪及其杂交F1代梅大猪背最长肌间的正反向消减cDNA文库，进行了差异表达基因的筛选、克隆和鉴定，取得了如下结果：1、以猪管家基因G3PDH作为消减指标，对每个消减文库的消减效率进行了检测，结果表明2个消减文库的消减效率都达2~(10)倍以上，有的甚至高达2~(15)倍，这表明某些在梅山猪及其杂交F_1代梅大猪背最长肌组织中的差异表达基因的富集效率也达2~(10)倍以上，说明所构建的消减cDNA文库质量很好。2、在每个文库中随机挑选了600多个克隆进行PCR鉴定。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver和以梅大猪为Tester、梅山猪为Driver的消减cDNA文库中我们分别获得了591和632个有效阳性克隆，插入片段长度主要分布于150—750bp之间。3、利用斑点杂交技术，以正向消减cDNA、反向未消减cDNA为探针对2个消减cDNA文库中的阳性克隆进行了高通量筛选。在以梅山猪为Tester、梅大猪为Driver的消减cDNA文库中，我们选取了27个差异表达克隆进行分析，发现共代表14个ESTs，4个在猪中为已知基因，10个在猪中为未知基因(其中7个与人等其他物种的基因有高相似性，3个未找到明显的相似性)。在以梅大猪为Tester、梅山猪为Drivcr的消减cDNA文库中，我们选取了20个差异克隆进行分析，发现共代表11个ESTs，其中1个在猪中为已知基因，2个未找到明显的相似性，8个在猪中为未知基因，但分别与人等其他物种的基因有高的相似性。并利用含内标化的半定量RT-PCR对其中一些ESTs进行了验证，大部分为差异表达。4、将电子克隆、SMART技术和比较基因组学相结合，成功克隆了4个差异表达基因的全长和1个基因的编码区全长cDNA序列：①肌球蛋白轻链调控蛋白2(Myosin Regulatory Light Chain 2，MRLC2)，GenBank登录号DQ490129，cDNA全长990bp，ORF为519bp；②造血干细胞因子117(Hematopoietic Stem／Progenitor Cells，HSPC117)，GenBank登录号DQ508263，cDNA全长2015bp，ORF为1518bp；③(Bridging Integrator 1，BIN1)，GenBank登录号EF117688，cDNA全长2001bp，ORF为1305bp；④Ras癌基因(H-Ras／N-Ras／K-Ras family，N-Ras)，cDNA长986bp，ORF为570bp，GenBank登录号DQ325522；⑤肌肉磷酸化酶(Glycogen phosphorylase，muscle form，PYGM)，GenBank登录号DQ508264，cDNA全长2843bp，ORF为2529bp。其中MRLC2和HSPC117在梅山猪中表达量高于梅大猪，BIN1、N-Ras和PYGM在杂种F1代梅大猪中表达量较高。5、利用ORF Finder、GENSCAN、Signal P3.0、ProtParam、Prosite、MEGA等软件对猪MRLC2、HSPC117、、BIN1、N-Ras和PYGM基因的编码区、结构、蛋白质位点及其功能进行了分析，并构建了物种间系统进化树。6、利用半定量RT—PCR技术对所获得的差异表达基因进行了不同组织(背最长肌、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、子宫、卵巢和睾丸)间的表达分析。7、利用比较基因组学和PCR技术，扩增了猪BIN1、N-Ras和PYGM等3个基因部分基因组序列，分析了其在不同猪种中的多态性，并在大白×梅山F2中与性状进行了相关分析，结果发现，猪肌肉磷酸化酶基因PYGM125位点AA基因型的活体瘦肉率比BB基因型高3％，肥肉率低5％，提示该位点可能是一个比较好的分子标记。
张伸[8]2001年在《DNA调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定》文中研究表明一切生命现象，实际上都是机体产生的一系列复杂的信息传递和调控的过程。细胞水平的信息传递和调控是细胞各种行为的基础。从第一信使细胞外信号、第二信使、第三信使转录调节因子到靶基因，蛋白质之间的相互作用，蛋白质与基因调控序列之间的相互作用，通过编码DNA结合蛋白质的基因的表达，形成的基因调控信息传递网络，是细胞立体网络的一个核心部分。细胞的整体功能即是在基因调控信息传递网络的调控下，维持细胞内整个立体网络的稳定状态，并按照既定的内在程序分化、发育，或改进自身的结构以适应于环境。 疾病的形成与整个基因调控信息传递网络有关，要对基因调控信息传递网络和细胞行为有深入透彻的认识，首先要明确细胞内所有的基因，即基因组。基因组的研究对细胞内所有基因的克隆、鉴定起到巨大的推动作用。功能基因组研究主要包括以下各个部分：基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等。功能基因组对细胞内的所有分子及它们之间的相互作用进行解析：确定出每一个功能单元的反应模式，浓度变化规律；确定出它们之间所有的相互作用和反应。即确定细胞立体网络中所有的结点和网络联系，得到网络的基本结构，作为理解和重建细胞功能的基础。 DNA与蛋白质之间的相互作用是构成基因调控信息传递网络的基础之一。通过DNA与蛋白质的相互作用，细胞基因组上的基因实现有序、协调表达，使细胞表现出有秩序和自组织的行为，如细胞的分裂与增殖，细胞的分化与凋亡，和个体有序的发育过程。已有的研究表明，反式作用因子与相应的DNA顺式作用元件的结合是染色质重塑和基因转录调节的基础。所以，筛选、鉴定DNA调节元件和DNA结合蛋白质，对研究基因调控信息传递网络和揭示基因表达调节和基因组自身组织规律是很有必要的。 现有的研究方法难以大量筛选、鉴定DNA调节元件，它们在筛选DNA调节片段时，或者效率不高，不能快速、大量筛选基因组中的DNA调节片段，或者需要纯化的转录因子和抗体，只能分离与已知蛋白质结合的DNA片段。另外，由于转录调节因子在细胞中的表达水平很低，利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质，目前已克隆的转录因子不多，对这些因子的表达模式和DNA-蛋白质相互作用规律尚缺乏足够的研究。因此，当前转录
王令[9]2013年在《锌指核酸酶的构建及其在动物基因组编辑中的应用》文中指出精确高效的实现内源基因靶向编辑是转基因技术的难点和重点。传统的自发同源重组方法的效率低下和逆病毒载体法的安全性差等问题，限制其广泛应用和转基因新品种的培育。锌指核酸酶作为一种人工核酸酶，含有特异DNA识别结构域锌指蛋白和非特异性DNA切割活性域FokⅠ，赋予了其靶向切割特定DNA双链的能力。当锌指核酸酶识别并结合至靶序列，以二聚体形式切割DNA产生双链切口（Double strand breaks,DSBs）。细胞在修复DSBs过程中功能实现基因组的靶向编辑，如基因敲入（Geneknock-in），基因敲除（Gene knock-out）,基因修复（Gene correction），基因破坏（Genedisruption）等。锌指蛋白是决定锌指核酸酶结合靶基因特异性和基因修饰高效性的关键因素。现阶段，主要是组装、筛选获得特异锌指蛋白，然后与FokⅠ连接获得活性锌指核酸酶。有研究表明，即使获得的锌指蛋白有DNA识别和结合活性，组装成锌指核酸酶仍然不能切割靶序列。所以，获得活性锌指核酸酶是此技术的难点。此外，锌指核酸酶实现基因组编辑后，如何筛选和富集阳性克隆，获得转基因细胞系也是锌指核酸酶技术应用的关键之一。本论文以奶山羊编码酪蛋白的alpha S1-casein（α S1-casein）为靶基因，利用酵母筛选系统，从锌指核酸酶文库中直接筛选获得活性锌指核酸酶，然后在哺乳动物细胞水平检测锌指核酸酶切割靶序列的活性。最后将锌指核酸酶作用于靶细胞，通过嘌呤霉素药物筛选富集作用，获得基因敲除细胞系，为后续获得转基因奶山羊新品种提供技术支持。同时，基于锌指蛋白和FokⅠ相互作用的独立性，构建了锌指核酸酶介导的酵母杂交系统，为鉴定蛋白与蛋白相互作用提供一种新方法。1．基于开源式（OPEN）筛选方法，构建3个锌指核酸酶随机突变文库。每个文库的三个锌指模块中，一个单锌指模块中识别DNA的关键氨基酸的编码序列以PCR方式实现随机突变，并保持其他两个模块不变，以质粒形式的锌指核酸酶文库库容量达到106~107。根据靶基因α S1-casein的潜在靶序列和OPEN筛选方法，构建9个报告载体。2.基于Gal4蛋白介导的酵母双杂交筛选系统，第一轮筛选富集识别6个三联碱基的单个锌指，将富集的单锌指组装成2个锌指核酸酶重组文库；然后通过第二轮的筛选，获得识别左右单侧9-bp的活性锌指核酸酶；最后通过第三轮针对全长靶序列的筛选，获得3对活性锌指核酸酶。3.构建锌指核酸酶真核表达载体对pST-ZFNL、pST-ZFNR和含靶序列的双荧光报告载体pRFP-EGFP-BS，检测锌指核酸酶在哺乳动物细胞内的切割活性。将锌指核酸酶表达载体和双荧光报告载体共转染至HEK293T细胞。当锌指核酸酶作用于EGFP基因中的靶序列，修复突变的EGFP基因，细胞表现出绿色荧光阳性。利用流式细胞仪检测锌指核酸酶作用后的绿色荧光阳性细胞率，间接反应筛选获得的3对锌指核酸酶切割靶序列活性分别为8.9%，9.3%，5.0%。4.活性锌指核酸酶作用于靶细胞——奶山羊乳腺上皮细胞。将锌指核酸酶载体和报告载体pB-CBA-Puro-BS共同电转染至奶山羊乳腺上皮细胞。基于嘌呤霉素抗性基因的报告载体含有靶序列，当锌指核酸酶切割靶序列，修复报告基因后，细胞在含嘌呤霉素药物的培养基中存活，实现阳性细胞的筛选和富集。然后收集阳性克隆，利用T7核酸内切酶分析基因组中靶序列突变频率。当无报告载体pB-CBA-Puro-BS的富集作用时，我们未检测到基因组靶序列的突变；有报告载体时，利用嘌呤霉素药物筛选富集获得细胞克隆，3对锌指核酸酶实现靶基因突变率分别为9.4%，15.9%和4.1%。5.锌指核酸酶的锌指蛋白ZFP和FokⅠ切割域各司其职，具有相互独立性。将ZFP和X蛋白融合表达，FokⅠ和Y蛋白融合表达，利用X和Y蛋白的相互作用募集ZFP和FokⅠ，形成有活性的重组ZFN，切割靶序列，实现下游报告基因的表达。基于Gal4基因的报告载体，我们验证了蛋白对P53/SV40LT募集活性ZFN，随后利用此系统在cDNA文库中筛选和WDSV的orfA相互作用的蛋白。ZFN介导的此酵母双杂交系统为蛋白与蛋白相互作用鉴定提供一种新方法。
侯萍[10]1996年在《人食管癌中缺失基因片段的分离和鉴定》文中研究表明食管癌(Esophageal Cancer，EC)是一种常见的恶性肿瘤。近15年来，我室及国外许多实验室对食管癌的细胞遗传学和分子遗传学改变做了大量的研究，表明食管癌涉及数条染色体的畸变，在某些染色体的特定区域内存在较高频率的杂合性缺失(LOH)和微卫星序列不稳定(MIN)，提示在这些区域内存在抑癌基因。 代表性差异分析(RDA)是一种新的基因克隆技术，通过正常基因组与突变基因组DNA之间的比较直接分离出存在差别的基因片段，与国际上通用的连锁分析一定位克隆技术相比，不需对众多的疾病大家系进行连锁分析以确定基因的位置和功能，因此具有简便、快速、敏感、经济等优点，但是RDA策略的实验步骤繁琐，同时采用核酸酶富集和分离缺失的基因片段，可能导致许多遗传信息的损失。 我们依据RDA的原理，改进和简化了实验程序，建立了简化的基因组消减杂交技术。以正常胎盘DNA为检测DNA，食管癌细胞系(EC8712和EC8733)DNA为驱赶DNA，通过三轮消减杂交、PCR富集和Southern杂交验证，获得7个食管癌细胞系中特异缺失的基因片段，命名为12H1、12H2、33H3、33H4、12B1、3382和3383。克隆测序后发现12H1为512bp，12H2为428bp，33H3为509bp，33H4为355bp，12B1约为680bp(部分测序)，3382为519bp，3383为425bp，同源性比较发现12H1与33H3高度同源(94.9％)且与定位于4p的人基因组DNA中一段串联重复的新序列98％同源。33H4与定位于17号染色体上α卫星序列87％同源。12B1与人LI家族中具有转座作用且带有开放阅读框的成员90％同源。12H2、3382和3383无同源序列，可能来自新的未知基因。分别
参考文献：
[1]. 人基因组中DNA调节片段的快速富集与筛选[D]. 徐海明. 中国协和医科大学. 2000
[2]. 用改进的RERS方法富集与筛选Apo(a)-Plasminogen基因簇中的调节片段[D]. 吕湘. 中国协和医科大学. 2002
[3]. 白细胞介素2受体α基因结构和功能的研究[D]. 张晶. 中国协和医科大学. 1997
[4]. CRISPR/Cas9高效等位基因编辑系统的构建及其在猪基因组编辑中的应用研究[D]. 吴芸. 西北农林科技大学. 2017
[5]. hnRNP K与宫颈癌变的关系以及与Siha细胞全基因组的结合和功能分析[D]. 杨倩. 山西医科大学. 2018
[6]. 全基因组功能性非编码RNA筛选系统的构建与验证[D]. 魏强. 重庆医科大学. 2017
[7]. 梅山×大白F1代与其亲本梅山猪背最长肌间差异表达基因的克隆鉴定及特征分析[D]. 谢红涛. 华中农业大学. 2006
[8]. DNA调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定[D]. 张伸. 中国协和医科大学. 2001
[9]. 锌指核酸酶的构建及其在动物基因组编辑中的应用[D]. 王令. 西北农林科技大学. 2013
[10]. 人食管癌中缺失基因片段的分离和鉴定[D]. 侯萍. 中国协和医科大学. 1996
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