刘 靓（东南大学附属中大医院无锡分院血液科 江苏 无锡 ２４１０００）
【中图分类号】Ｒ７３３．７【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０４２１－０１【摘要】目的应用短串联重复序列．聚合酶链反应（ＳＴＲ．ＰＣＲ）半定量方法检测异基因造血干细胞移植后嵌合体。方法给１０例接受移植的患者行移植后嵌合体检测，采集外周血提取ＤＮＡ，对９个ＳＴＲ位点行聚合酶链反应扩增，扩增完成后行聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影，再计算嵌合率。结果１０例患者均检测到供者细胞，８例达到完全嵌合（ＣＣ），２例形成混合造血（ＭＣ）。结论ＳＴＲ．ＰＣＲ结合凝胶电泳成像分析技术是一种敏感、准确、可靠、经济的嵌合体半定量检测方法。
２０世纪９０年代以来，造血干细胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ ｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＨＳＣＴ）技术取得飞速发展，现已成为治疗恶性血液病、遗传性疾病等的主要手段之一。随着ＨＳＣＴ应用范围的扩大，移植效果日益得到重视，移植后的检测也将成为ＨＳＣＴ研究中不可缺少的一部分［１］。短串联重复序列（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ）是近年来发现的，广泛存在于基因组中的ＤＮＡ长度多态性片段，它由２～６个碱基构成一个在长度上呈串联重复排列的核心序列。有学者将ＳＴＲ应用于ＨＳＣＴ后植入证据的检测，结果显示ＳＴＲ基因位点检测可用于判断移植效果、预防复发、实行临床早期干预治疗等。本文我们运用的ＳＴＲ．ＰＣＲ结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术可以计算出嵌合率。我们对１０例接受ＨＳＣＴ的患者进行了动态嵌合体的监测，根据嵌合结果，为患者的临床治疗，预后提供依据。１资料与方法１．１病例资料：对象为２０１１．２０１３年在东南大学附属中大医院血液科接受ａｌｌｏ．ＨＳＣＴ的患者１０例（男８，女２），年龄８～５３岁（中位年龄２５岁）。１．２预处理方案及ＧＶＨＤ的防治：预处理用改良的Ｂｕ／ＣＹ预处理方案，即阿糖胞苷，白消安，环磷酰胺，司莫司汀，抗胸腺细胞球蛋白。ＧＶＨＤ预防采用环孢霉素Ａ、麦考酚酸酯和短程甲氨蝶呤方案。１．３标本的收集和处理：在干细胞移植前采集供者和受者外周血１～２ｍｌ，术后＋１４天、＋２８天采集患者外周血，此后每月或每３月１次采集。１．４聚合酶链反应扩增：以上个步骤提取的ＤＮＡ为模板，对９个ＳＴＲ基因座（Ｄ８Ｓ１１７９，Ｄ２１Ｓ１１，Ｄ１８Ｓ５１，Ｄ５Ｓ８１８，Ｄ１３Ｓ３１７，Ｄ７Ｓ８２０，Ｄ３Ｓ１３５８，ｖＷＡ，ＦＧＡ）进行扩增。［２］１．５扩增产物的检测：扩增完成后，行非连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色显影。第一步先定性分析：根据等位基因阶梯（ｌａｄｄｅｒ）对照阅读各位点的基因型，找出各组供、受体可区分彼此的有信息位点，并选择出Ｉ类和ＩＩ类位点进行下一步嵌合率计算［３］。第二步定量分析：电泳后的凝胶用ＵＶＰ成像分析系统进行灰度扫描，再用Ｇｅｌ．Ｐｒｏ４．０软件进行片段分析，以相应的公式计算供体细胞嵌合率（ＤＣ）。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆１．６嵌合体的界定：完全嵌合体（ＣＣ）：ＤＣ ＞９５％；混合嵌合体（ＭＣ）：５％＜ＤＣ ＜９５％［高比例嵌合体（ＨＭＣ）：ＤＣ≥ ５０％；低比例嵌合体（ＬＭＣ）：ＤＣ≤５０％。２结果：移植后一个月内嵌合体检测情况：移植一个月后，１０例患者均形成不同比例的供、受者造血细胞嵌合体，其中８例形成ＣＣ，２例形成ＭＣ；５例形成高比例混合嵌合（ＨＭＣ）；１例低比例混合嵌合（ＬＭＣ）。所有稳定植入的患者在移植后１４天多数病例达ＣＣ，平均嵌合率是９５．８８％。３讨论在应用ＳＴＲ．ＰＣＲ进行嵌合体的检测时，微卫星位点的选择十分重要，只有特异性强的位点才能保证结果的灵敏性和准确性。嵌合体检测的目的主要是在以供者细胞为前提的条件下发现受者细胞，因此在检测之前需要先选择对供受者有检测意义的位点。Ｏｂｅｒｋｉｒｃｈｅｒ等［４］判定有意义的位点标准是：能显示供、受者各自的特异条带，或者至少是受者的特异条带，以便进一步进行定性或定量分析。ＳＴＲ位点分布情况存在人群、地区差异性，我们选择Ｄ８Ｓ１１７９， Ｄ２１Ｓ１１，Ｄ１８Ｓ５１，Ｄ５Ｓ８１８，Ｄ１３Ｓ３１７，Ｄ７Ｓ８２０，Ｄ３Ｓ１３５８，ｖＷＡ，ＦＧＡ９个位点。这几个位点错配较少，有较高的个体识别能力，易于分型而且等位基因频率在研究人群所属江苏地区分布较好。［５、６］荧光标记的多重ＰＣＲ结合测序仪和基因扫描软件程序检测嵌合体虽然也能定量分析嵌合体并且自动化程度高，但其敏感性较单一位点ＳＴＲ．ＰＣＲ方法低，而且费用贵，我们采用的ＳＴＲ．ＰＣＲ结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像分析技术检测嵌合体的方法在长期监测的后期我们只需筛选出敏感性高的位点扩增即可，简便易行，费用也比较便宜。
参考文献［１］ＤＵＢＯＶＳＫＹＪ，ＤＡＸＢＥＲＧＥＲＨ，ＦＲＩＴＳＣＨ，ｅｔａ１．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｃｈｉｍｅｒｉｓｍｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｐｏｓｔ．ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｐｅｒｉｏｄｉｎｐｅｄｉａｔｒｉｃｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍａｌｉｇｎａｎｔａｎｄｎｏｎ．ｍａｌｉｇｎａｎｔｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｉｍｅｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ，ｇｒａｆｔｆａｉｌｕｒｅａｎｄｒｅｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９９，１３（１２）：２０６０—２０６９．［２］李桢，邹红岩，邓志辉等．短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程［Ｊ］．中国临床康复，２００５，２６：９９．１０１．［３］ＴＨＩＥＤＥＣ，ＦＬＯＲＥＫＭ，ＢＯＲＮＨＡＭ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｘｅｄｃｈｉｍｅｒｉｓｍｕｓｉｎｇｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｍａｒｋｅｒｓａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌ，１９９９，（２３）：１０５５．１０６０．［４］ＯｂｅｒｋｉｃｈｅｒＡＲ，ＳｔｒｏｗｔＭＰ__________，ＨｅｒｚｉｇＧＰ，ｅｔａ．ｌＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｈｉｇｈｌｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃｃｈｉｍｅｒｉｓｍｆｏｌｌｏｗｉｎｇａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９９５，１６（５）：６９５．７０２．［５］张斌，闵涯邻，俞卫东等．南京地区汉族９个ＳＴＲ基因座的遗传多态性［Ｊ］．中国法医学杂志，２００４，１９：１６８．１６９．［６］俞卫东，闵涯邻，张斌等．江苏地区汉族人群１５个ＳＴＲ基因座遗传频率调查［Ｊ］．中国法医学杂志，２００３，１８（４）：２４５．２４６．
论文作者:刘 靓
论文发表刊物:《健康必读》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/8/17
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