岳莉[1]2004年在《重组人内抑素治疗大鼠佐剂性关节炎的血管生成抑制机理》文中研究说明目的：研究重组人内抑素(recombinant human endostatin,RHE)治疗大鼠佐剂性关节炎的血管生成抑制机理。 方法：用弗氏完全佐剂(CFA)建立大鼠AA模型，自大鼠继发性关节炎出现后开始给予不同剂量的RHE(0.1、0.5、2.5mg kg~(-1)，sc，×7d)，正常组及模型组给予等容量的溶媒。采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化法分离并培养大鼠的滑膜细胞，放免法检测滑膜细胞培养上清液中白细胞介素(interleukin，IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平，对常规HE染色的关节病理切片的滑膜组织新生血管进行记数，扫描电子显微镜对滑膜细胞的形态学改变进行观察，免疫组化法检测体外培养的滑膜细胞和滑膜组织血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、TNF-α、Ⅷ因子表达的变化。 结果： 1．RHE对炎性细胞因子产生的影响 与正常组比较，AA大鼠滑膜细胞产生的IL-1和TNF-α明显增加。RHE各个剂量组可显着抑制滑膜细胞IL-1和TNF-α的产生。 2．RHE对滑膜衬里层新生血管数量的影响 正常大鼠的滑膜衬里层只有少量的新生血管，AA大鼠的滑膜组织增生，新生血管数目显着增加。RHE可抑制滑膜组织的增生，使滑膜组织中的新生血管数目明显减少。 3．滑膜细胞和滑膜组织中VEGF，FGF，TNF-α，Ⅷ因子的表达 正常大鼠的滑膜细胞和滑膜组织VEGF、FGF、TNF-α、Ⅷ因子的表达较模型组少，RHE可明显减少VEGF、FGF、TNF-α、Ⅷ因子的表达。 结论 RHE对AA大鼠继发性关节炎具有明显的抑制作用，其机制可能与其抑制滑膜的新生血管生成及炎性细胞因子的分泌等有关。
岳莉, 沈玉先, 王华, 刘丽华, 郑咏秋[2]2003年在《重组人内抑素对大鼠佐剂性关节炎继发性炎症的抑制作用》文中研究说明目的 观察重组人内抑素对大鼠佐剂性关节炎 (AA)继发性炎症是否有抑制作用。方法 用足容积测量仪检测足爪容积并对关节炎症程度进行目测评分 ;HE染色检测非致炎侧膝关节的病理改变。结果 福氏完全佐剂 (CFA)致炎后d 1 0 ,继发性炎症出现 ,同时给予不同剂量的内抑素(0 1、0 5、2 5mg·kg- 1 ·d- 1 ,sc) ,连续 7d。结果发现 ,内抑素 2 5mg·kg- 1 对AA大鼠的继发性足肿胀有明显的抑制作用 ;致炎后d 30病理检查显示AA大鼠的关节内滑膜增厚 ,滑膜衬层细胞增生并伴有新生血管形成 ,滑膜细胞有不同程度的脂肪变性 ;软骨及骨遭到破坏 ,且透明软骨内基质降解及新生血管形成。给予不同剂量的内抑素对AA大鼠关节组织的上述病理改变有不同程度的改善作用 ,内抑素 2 5mg·kg- 1 对AA大鼠的关节病理损伤有完全的抑制作用 ,同时可见滑膜组织内大量胶原沉积和滑膜细胞的脂肪变性。结论 重组人内抑素对大鼠佐剂性关节炎的继发性炎症有显着的抑制作用 ,并能阻止关节炎的病理改变
夏丽娟, 陈飞虎, 阮晶晶, 刘永靖, 袁凤来[3]2008年在《重组人内抑素诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的研究》文中提出目的以弗氏完全佐剂诱导的佐剂性关节炎(AA)大鼠为动物模型,观察重组人内抑素诱导AA大鼠滑膜细胞凋亡的作用。方法分离、培养滑膜细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测重组人内抑素体内用药对滑膜细胞增殖的影响;用缺口末端标记法(TUNEL)及流式细胞仪检测重组人内抑素对AA滑膜细胞凋亡的影响。结果AA大鼠表现为滑膜细胞异常增殖,rh-End(1.25、2.5、5.0mg·kg-1)体内治疗给药及rh-End6.25～50mg·L-1浓度范围体外给药可抑制AA大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖反应。rh-End体内用药可诱导AA大鼠滑膜组织及细胞的凋亡,rh-End体外用药作用48h,AnnexinV/PI双染色法观察到大鼠AAFLS凋亡率为1.77%,rh-End(25mg·L-1)可诱导AA大鼠FLS的凋亡,其凋亡率为6.67%。结论rh-End可不同程度抑制FLS的增殖反应,并诱导其凋亡的发生,减轻AA大鼠增生性滑膜炎。上述结果提示炎症增生的滑膜细胞可能是rh-End的另一个作用靶点。
张皖东[4]2007年在《雷公藤甲素配伍甘草酸对胶原诱导性关节炎大鼠的影响》文中提出目的：以外周血、滑膜组织和肠道黏膜免疫系统等为主要观察对象，从系统免疫学、黏膜免疫学、病理学等角度来探讨雷公藤甲素配伍甘草酸对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型的作用机理；并与雷公藤甲素作比较，寻找适合的配伍，为类风湿性关节炎的治疗提供新的方案。方法：选用SD大鼠作为实验对象，采用皮下注射Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂混合物的方法诱导出关节炎模型70只，随机分为7组，每组10只：CIA模型组、雷公藤甲素高剂量治疗组(TPH)、雷公藤甲素中剂量治疗组(TPM)、雷公藤甲素低剂量治疗组(TPL)、甘草酸治疗组(GL)、雷公藤甲素中剂量+甘草酸治疗组(TPM-GL)、雷公藤甲素低剂量+甘草酸治疗组(TPL-GL)。另设正常对照组10只。观察动物的关节肿胀程度、关节炎指数。治疗4周后处死动物，光镜下观察踝关节的病理损伤情况；采用ELISA方法测定动物血清中抗Ⅱ型胶原抗体、TNF-a及IL-10的水平；采用免疫组化的方法检测动物膝关节滑膜中VEGF及Endostatin表达的情况。并测量动物的脾脏系数、胸腺系数和小肠派氏小结计数，采用分步消化和梯度离心的方法获取外周血、派氏小结、小肠上皮内和固有层的淋巴细胞，用流式技术检测其T淋巴细胞亚群。结果：关节损伤的结果显示：模型大鼠致炎侧和继发侧的踝关节肿胀程度比正常组显着增加；关节炎指数明显增加。给药后治疗组动物的踝关节肿胀程度与模型组比较均有显着降低，关节炎指数明显下降。TPH、TPM、TPM-GL和TPL-GL组效果优于TPL和GL组，TPL-GL组与TPM组疗效无明显差异。光镜下可见模型大鼠踝关节滑膜细胞明显增生，毛细血管增生形成血管翳，并可见炎细胞浸润，在血管翳下可见明显的软骨表层细胞的变性、坏死。治疗后滑膜细胞增生减轻，血管翳形成和炎细胞浸润减少，软骨破坏减轻。TPH、TPM、TPM-GL和TPL-GL组效果优于TPL和GL组，TPL-GL组与TPM组疗效无明显差异。血清中细胞因子水平测定结果表明：模型大鼠血清中抗Ⅱ型胶原抗体和TNF-a水平明显升高，各给药组大鼠血清抗Ⅱ胶原抗体和TNF-a水平较模型组显着降低；TPH、TPM和TPL组血清抗Ⅱ型胶原抗体和TNF-a水平呈一定程度的剂量——效应相关，TPL-GL组大鼠血清抗Ⅱ胶原抗体和TNF-a水平与TPM组比较无显着性差异。模型大鼠血清IL-10水平明显升高，各给药组大鼠血清IL-10水平较模型组进一步明显升高；TPH、TPM和TPL组血清IL-10水平呈剂量——效应相关，GL组大鼠血清IL-10水平显着低于TPM组，但TPM-GL和TPL-GL组大鼠血清IL-10均较TPM组明显升高。VEGF和Endostatin表达测定结果表明：正常大鼠膝关节滑膜中有少量的VEGF和Endostatin阳性细胞表达，CIA模型组大鼠膝关节滑膜中VEGF表达明显增多，但Endostatin表达无明显变化。TPH、TPM、TPM-GL和TPL-GL组大鼠关节滑膜中VEGF表达较模型组明显减少，GL组的表达明显高于TPM组，TPL-GL组的表达与TPM组无明显差异。各治疗组大鼠关节滑膜中Endostatin表达较模型组明显增加，GL组的表达明显少于TPM组，TPL-GL组的表达与TPM组无明显差异。脾脏系数和胸腺系数的结果表明：模型大鼠的脾脏系数显着高于正常对照组；各给药组大鼠的脾脏系数与模型组比较均有下降，其中TPH、TPM、TPM-GL和TPL-GL组与正常组比较，下降显着；TPL-GL组与TPM组无明显差异。模型大鼠的胸腺系数与正常对照组无明显差异；TPH、TPM和TPM-GL组大鼠胸腺系数显着低于模型组，TPL-GL组与TPM组无明显差异。派氏小结计数结果表明：模型大鼠的派氏小结计数显着高于正常对照组；各给药组大鼠的派氏小结计数与模型组比较均有显着下降，TPL-GL组与TPM组无明显差异。T淋巴细胞亚群的测定结果表明：与正常组比较，模型大鼠外周血中CD~(3+)细胞明显增多，而且主要是CD~(4+)细胞增多，CD~(4+)／CD~(8+)比值也明显升高；与模型组比较，TPH、TPM、TPL、TPM-GL和TPL-GL组大鼠外周血中CD~(4+)细胞数量减少，CD~(4+)／CD~(8+)比值也明显降低。TPL-GL组与TPM组无明显差异。与正常组比较，模型大鼠派氏小结中CD~(4+)／CD~(8+)比值明显升高；与模型组比较，各治疗组大鼠派氏小结中CD~(8+)细胞数量明显增加，CD~(4+)／CD~(8+)比值明显降低。TPL-GL组与TPM组无明显差异。与正常组比较，模型大鼠IEL中CD4~+细胞数量明显增加，CD8~+细胞数量明显减少，CD4~+／CD8~+比值明显升高；与模型组比较，TPH、TPM、TPL、TPM-GL和TPL-GL组大鼠IEL中CD4~+细胞数量明显减少，CD8~+细胞数量明显增加，CD4~+／CD8~+比值明显降低。TPL-GL组与TPM组无明显差异。与正常组比较，模型大鼠LPL中CD4~+细胞数量增加，CD4~+／CD8~+比值明显升高；与模型组比较，TPH、TPM、TPM-GL和TPL-GL组大鼠LPL中CD4~+／CD8~+比值明显降低。TPL-GL组与TPM组无明显差异。结论：雷公藤甲素可以显着减轻CIA大鼠踝关节肿胀程度和关节炎指数，并且呈剂量——效应相关；甘草酸也可以减轻CIA大鼠踝关节肿胀程度和关节炎指数，但疗效明显低于雷公藤甲素。低剂量的雷公藤甲素配伍甘草酸后可以得到与中剂量雷公藤甲素相似的疗效；提示可以通过配伍甘草酸的方法，以减少雷公藤甲素的用量，从而减少其毒副作用。雷公藤甲素和甘草酸均可以抑制CIA大鼠异常的自身免疫反应，通过下调血清中TNF-a含量，上调IL-10的含量，平衡Th 1／Th 2细胞网络，调节其免疫状态，改善关节滑膜炎性病变，达到治疗CIA的作用。二者合用，可以起到协同作用。CIA大鼠滑膜组织中存在血管形成刺激因子与抑制因子的失衡，与滑膜增生和炎症密切相关。雷公藤甲素和甘草酸可以通过调节VEGF和／或Endostatin的水平，而抑制新生血管形成和滑膜细胞增生。雷公藤甲素可以通过调节肠道黏膜不同部位淋巴细胞亚群含量，下调CD4~+／CD8~+的比值，起到免疫抑制作用，诱导免疫耐受的发生。单独的甘草酸具有一定的免疫抑制作用，与雷公藤甲素合用后，可以增加其效应。
丁春菊[5]2011年在《麝香乌龙丸对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理形态及VEGF、ES表达的影响》文中认为目的:观察麝香乌龙丸对佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜组织病理形态学和血管内皮生长因子(VEGF)及内皮抑素(ES)的影响,探讨麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎是否与调控VEGF/ES的失衡有关。方法:1.分组、造模:本实验设3组,将30只体重180g(±20g)健康Wistar大鼠按体重由小到大编号,按随机数字表随机分成叁组:正常对照组(A组),模型组(B组),麝香乌龙丸组(C组),每组10只。B、C组利用弗氏完全佐剂于大鼠右后足跖皮内注射0.1mL/只,建立AA大鼠模型。2.给药:造模后第15天开始给药,C组按麝香乌龙丸成人每日每千克体重用药量的10倍剂量1.0g/kg给药,溶于2ml生理盐水中灌胃,每日一次,A、B组按同样方法灌入等量生理盐水。各组灌胃1周。期间常规饲养,正常饮水。3.光镜下观察各组大鼠滑膜组织病理形态学变化,并对观察到的关节滑膜变化进行病理形态积分。4.免疫组织化学方法检测各组大鼠跖趾关节滑膜中VEGF、ES的表达情况。结果:1.一般状况观察:A组实验过程中各鼠状态良好,被毛有光泽,活动自如。B、C组造模后第1～3d表现出急性炎症反应,注射右后足出现明显红肿,伴精神萎靡,被毛杂乱,进食量少,自主活动减少;12～14d出现继发病变,表现在鼠尾、耳、前肢及左后肢出现红肿或结节,四肢活动出现障碍。C组给药后大鼠症状逐渐减轻,饮食渐增加,活动增多,足肿胀减轻。2.光镜下观察滑膜组织病理形态学改变:A组滑膜组织表面光滑,薄膜样,半透明,滑膜细胞单层,排列整齐,呈扁平形,无血管增生,无纤维化,无乳头状增生,未见炎细胞浸润;B组滑膜表面粗糙,明显肿胀、充血、肥厚,滑膜细胞多层,增生活跃,滑膜组织中纤维组织增生,毛细血管增多扩张充血,可见大量炎细胞及纤维母细胞浸润;C组滑膜肿胀、充血程度及较B组明显减轻,可见轻度滑膜细胞增生,未见明显炎细胞浸润及血管增生,纤维化不明显。B、C组关节滑膜病理积分较A组明显增高(P<0.01),C组与B组比较关节滑膜病理积分有显着差异(P<0.05)。3.VEGF、ES阳性表达:VEGF、ES的阳性表达定位于胞浆和(或)胞膜,呈棕黄色或棕黄色颗粒。主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层。VEGF在B组滑膜中的阳性表达率较A组明显增高(P<0.01),C组的阳性表达率较B组显着降低(P<0.05)。ES在A组滑膜中无表达,在B组滑膜中低表达,C组的阳性表达率较B组明显升高(P<0.01)。4.VEGF/ES比值:C组与B组比较VEGF/ES的比值明显降低(P<0.01)。结论:本实验证明,麝香乌龙丸能显着改善模型大鼠跖趾关节类风湿关节炎滑膜组织的病理损害程度,有效抑制滑膜炎症,降低关节软骨基质的降解,其机制可能与其下调VEGF的阳性表达,上调ES的阳性表达,从而调控VEGF/ES的失衡而抑制滑膜组织血管生成相关。
龚永芳[6]2017年在《重组人内抑素对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及机制研究》文中指出增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是一种皮肤软组织损伤之后机体过度修复导致的皮肤纤维化疾病,手术后的发病率可达40%-70%,而烧伤后的发病率更高达91%。HS主要的临床表现为损伤局部组织凸于正常皮肤的异常增生,并伴有疼痛、瘙痒等机体感觉不适,同时给患者带来局部组织外观和功能上的改变,如局部关节部位的瘢痕性挛缩等,严重影响了患者的身心健康。其确切的发病原因和机制目前尚未完全明确,临床上也缺乏特异性的治疗措施,而单纯的手术切除会产生新的瘢痕。增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSFs)是HS发生和发展过程中的主要效应细胞,且HSFs增殖和凋亡之间的不平衡也是临床上HS过度增生和持续存在的重要原因,因而抑制HSFs增殖和(或)促进HSFs凋亡可以成为临床上治疗HS的一个重要突破口。内抑素(endostatin)是O’Reilly等人从小鼠血管内皮瘤细胞的培养上清液中分离纯化得到的一种蛋白质,共184个氨基酸残基。先前的研究发现内抑素可特异性抑制血管内皮细胞增殖,通过进一步的研究证实,内抑素可以直接抑制部分肿瘤细胞增殖、迁移并诱导凋亡从而发挥抗肿瘤效应。我们早期的研究证实重组人内抑素(recombinant human endostatin,rh Endostatin)可特异性抑制佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖并诱导其凋亡;Ren等证明内抑素可以通过降低瘢痕组织中bcl-2的表达和抑制瘢痕内新生血管的形成来抑制瘢痕的增生。本课题组前期的研究发现rh Endostatin(6.25,12.5,25,50,100μg/ml)可以直接抑制HSFs增殖,本实验正是在本课题组前期研究的基础上进一步探讨rh Endostatin(100μg/ml)对兔耳HSFs凋亡的作用并探讨其中凋亡相应的分子机制,从而为HS的临床治疗以及寻找药物治疗新靶点提供实验基础和理论依据。目的:观察rh Endostatin对HSFs凋亡的影响,探讨其作用的部分细胞与分子机制。方法:(1)HS模型制备与鉴定:新西兰大耳兔8只,分为正常组(2只)和HS模型组(6只),模型组大耳兔建立兔耳HS模型;术后第28天,瘢痕形成;随机取两只兔耳瘢痕组织和正常兔耳皮肤行组织学观察,鉴定HS。(2)HSFs分离培养和鉴定:采用组织块培养法培养细胞,取第3代(传2代)细胞行波形蛋白免疫细胞化学染色鉴定HSFs。后续实验采用第3代细胞。(3)HSFs凋亡情况检测:将模型组细胞分为未处理组、内抑素处理组(100μg/ml)和5-氟尿嘧啶处理组(500μg/ml),流式细胞仪(FCM)对细胞凋亡情况进行检测。(4)HSFs凋亡相关基因与蛋白检测:实时荧光定量PCR法检测c-fos,c-jun,NF-κB,fas,caspase-3,bcl-2和p53 m RNA;Western Blot法检测相应蛋白表达。(5)HSFs胞质内的Ca~(2+)检测:Fluo-4/AM作为Ca~(2+)指示剂,其终浓度为100mg/ml rh Endostatin灌流HSFs,同时用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)动态观察和记录HSFs在有无Ca~(2+)液时胞质中的Ca~(2+)荧光强度(fluorescence intensity,FI)变化,检测rh Endostatin对HSFs胞质Ca~(2+)浓度(cytosolic free calcium concentration)[Ca~(2+)]i的影响。结果:(1)术后28天,HS即形成。HE染色结果显示瘢痕组织较周围正常皮肤明显增厚,同时瘢痕组织内的胶原纤维也明显变粗变大,呈现出旋涡或结节状,形成胶原结节;同时伴有大量的成纤维细胞增殖以及小血管增生。(2)波形蛋白免疫细胞化学染色对第3代(传2代)细胞进行鉴定的结果显示:细胞胞质内含有大量的棕黄色颗粒,呈现成纤维细胞特性。(3)FCM分析结果显示,rh Endostatin(100μg/ml)可促进HSFs早期及晚期凋亡,且以早期凋亡更为显着,分别为(10.78±0.06)%、(2.12±0.04)%,差异较未处理对照组HSFs均具有统计学意义(P<0.01)。(4)实时荧光定量PCR及Western Blot分析结果显示,与未处理对照组HSFs相比较,rh Endostatin(100μg/ml)能明显降低HSFs c-jun,c-fos,NF-κB,fas,p53,caspase-3和bcl-2 m RNA和蛋白的表达水平(P<0.01)。(5)CLSM检测结果显示,当细胞处于无Ca~(2+)液(D-Hanks缓冲液)中时,rh Endostatin(100mg/ml)不能引起HSFs胞质内Ca~(2+)FI的改变。当细胞外缓冲液为有Ca~(2+)液(Hanks缓冲液)时,终浓度为100mg/ml rh Endostatin灌流HSFs可使胞质Ca~(2+)FI急剧增加达峰值,随即荧光开始减弱,FI随时间而缓慢下降。结论:(1)rh Endostatin可促进HSFs凋亡。(2)rh Endostatin促进HSFs凋亡与其降低c-fos,c-jun,NF-κB和bcl-2基因的表达与活化有关,同时该凋亡过程不依赖于fas,p53表达增加,也不被caspase-3活性降低所抑制。(3)rh Endostatin可引起HSFs胞外Ca~(2+)内流,细胞内钙超载可能作为HSFs凋亡的一个重要始动环节。
吕玉琳[7]2012年在《重组人内抑素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响及机制研究》文中研究表明目的观察重组人内抑素（recombinant human endostatin, rhEndostatin）对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid-derived fibroblasts, KFs)增殖的影响，探讨其作用的细胞与分子机制，为瘢痕疙瘩（keloid）药物治疗及寻找治疗新靶点提供实验依据。方法①瘢痕疙瘩组织的HE染色：术后取瘢痕疙瘩组织，4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、切片；苏木素-伊红(HE)染色；中性树胶封片；显微镜观察并摄片。②KFs体外培养：7例瘢痕疙瘩组织标本（腹部2例，耳垂4例，大腿1例）均来自安徽医科大学附属医院整形外科瘢痕疙瘩患者，按文献方法进行成纤维细胞原代培养，待细胞融合后传代，实验所用细胞均为处于第3代对数生长期的KFs。③细胞鉴定：体外培养的细胞通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色检测对其性质进行鉴定。④细胞增殖检测：取第3代KFs，分别用不同剂量rhEndostatin (6.25×10~(-6),1.25×10~(-5),2.50×10~(-5),5.00×10~(-5),1.00×10-4mg/L)作用24h，48h，72h，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测各剂量rhEndostatin对KFs的抑制率，计算rhEndostatin对KFs作用的半数抑制浓度（50%Inhibitionconcentration，IC_(50)），本实验IC_(50)为5.00×10~(-5)mg/L。⑤细胞周期检测：传2代培养的KFs接种于6孔培养板中，细胞分设对照组、rhEndostatin组（5.00×10~(-5)mg/L）、5-氟尿嘧啶（5-FU）组（0.5mg/mL），用无血清的培养液培养24h，使细胞周期同步化，继之换上含20%血清的培养液，并相应加入rhEndostatin (终剂量5.00×10~(-5)mg/L)和5-FU(终剂量0.5mg/mL)，继续培养48h后收集细胞，FCM检测细胞周期。⑥细胞周期相关基因表达检测：应用免疫组化染色技术检测5.00×10~(-5)mg/LrhEndostatin48h后，KFs对p~(53)、增殖细胞核抗原（preliferation cell nuclear antigen,PCNA）、细胞周期素D1（CyclinD1）和周期蛋白依赖性激酶-4（cyclin-dependentkinase4, CDK_4）的表达情况。结果①HE染色结果：镜下可见瘢痕疙瘩组织真皮内炎性细胞浸润、大量成纤维细胞增殖和胶原沉积；部分胶原纤维排列紊乱，呈束状或结节状，形成纤维条索，发生玻璃样变性。提示该手术标本为瘢痕疙瘩组织。②KFs体外培养结果：组织块接种后7~8d，其周边可见少许梭形细胞，继之细胞逐渐增多并以组织块为中心呈放射状生长；传2代培养的细胞单层排列，形态均一，呈长梭状，折光性好。③KFs鉴定结果：细胞波形蛋白免疫化学染色显示胞浆均呈棕黄色。④rhEndostatin对KFs增殖的影响：除6.25×10~(-6)mg/L剂量组外，各剂量组rhEndostatin能明显抑制KFs的增殖，各组间KFs抑制率两两比较差异具有统计学意义(P <0.05)，抑制效应与rhEndostatin剂量和作用时间呈一定的依赖关系；其中，5.00×10~(-5)mg/L和1.00×10~(-4)mg/L组rhEndostatin作用48h后，细胞生长缓慢，体积变小，数目减少，排列紊乱。⑤r hEndostatin对KFs细胞周期的影响：FCM检测和分析结果显示，对照组KFs细胞周期主要停留在S期（42.21±3.32），G_2/M期细胞较少为（19.70±3.64）；加入rhEndostatin （5.00×10~(-5)mg/L）后， G_1期细胞由对照组（36.30±4.40）增至（65.09±3.20），而S期和G2/M期细胞显着减少，分别为（12.86±2.14）和（12.78±3.40）。⑥rhEndostatin对p~(53)、PCNA、CyclinD_1和CDK4表达的影响：p~(53)、PCNA、CyclinD_1和CDK_4阳性染色均呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，除CDK4主要位于细胞核和细胞浆，其余均位于细胞核。结果显示，p~(53)、PCNA、CyclinD1和CDK4在KFs中均呈强阳性表达分别为79.32%、89.45%、61.13%和82.34%，经5.00×10~(-5)mg/L rhEndostatin处理48h后，p~(53)、PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达降低，分别为16.18%、12.23%、24.98%和15.26%。结论rhEndostatin具有抑制KFs增殖的作用，其作用机制可能与rhEndostatin抑制p~(53)、CDK_4、CyclinD_1和PCNA表达有关。
袁凤来[8]2008年在《酸敏感离子通道在佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞中的表达和部分功能研究》文中提出类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,其主要病理特点是滑膜细胞增生,衬里层增厚,炎细胞浸润,以及软骨和骨组织的破坏,最终导致关节畸形和功能障碍。关节软骨和骨组织的破坏是致残的根本原因,积极寻找导致关节软骨破坏及骨组织病理生理改变的关键环节是防治该病的重点。软骨细胞本身的代谢对关节软骨细胞外基质(extracellar matrix,ECM)合成以及修复中起关键作用。组织酸化影响关节软骨细胞生长代谢,细胞外pH降低,可以激活与关节软骨破坏相关的基质金属蛋白酶。但软骨细胞是通过何种途径来感受周围环境pH的变化呢?研究表明,对于胞外pH的变化,细胞可以通过酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)途径去感受胞外的pH改变。ASICs是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道,近年来对ASICs的研究发展非常迅速,因其具有广泛的生物学功能和重要的病理学意义而备受关注。研究表明ASICs在脑缺血、癫痫、肿瘤等伴有局部组织酸化的病理过程中发挥重要作用。RA由于炎症导致关节局部组织酸化与脑缺血等导致的酸中毒具有相似的病理特点,那么,关节软骨细胞是否存在ASICs?ASICs是否在RA关节软骨破坏过程中发挥作用?组织酸化是炎症病理下常见的现象,但对ASICs是否参与由组织酸化诱导关节软骨损伤的病理生理过程,以及抑制或阻断ASICs对炎症损伤的关节软骨是否有保护作用尚不清楚。为进一步探讨ASICs在RA关节软骨细胞中的作用。本实验以弗氏完全佐剂(Complete Freund′s Adjuvant,CFA)诱导佐剂性关节炎(adjuvant-inducedarthritis,AA)大鼠模型为研究对象,研究AA大鼠关节软骨细胞中ASICs的表达与部分功能。具体研究内容包括以下四个部分:1.大鼠关节软骨ASICs的表达利用RT-PCR和Western blot检测ASICs在大鼠关节软骨的表达。结果显示大鼠关节软骨存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA及其蛋白的表达。半定量分析表明ASIC1amRNA在大鼠关节软骨的表达水平高于其它亚基。提示关节软骨细胞存在ASICs,可能参与关节软骨细胞的代谢过程。2.AA大鼠关节软骨ASICs的表达大鼠右侧后足跖皮内注射CFA,诱导AA大鼠模型。用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测ASICs在AA大鼠关节软骨的表达。经半定量分析,AA大鼠关节软骨中表达高水平的ASIC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA,与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);Western blot检测显示蛋白表达的变化与mRNA变化一致。结果提示AA大鼠关节软骨中ASICs的表达增多,参与病理情况下关节软骨的代谢过程。3.常用RA药物对AA大鼠关节软骨细胞ASICs的影响及作用48只大鼠,随机分成正常组,AA模型组,阿司匹林(50 mg.kg~(-1))组,地塞米松(0.2 mg.kg~(-1))组,雷公藤多苷(50 mg.kg~(-1))组和左旋咪唑(10 mg.kg~(-1))组。CFA致炎后d10起,AA大鼠出现继发性炎症,此时地塞米松组采用腹腔注射,其它用药组分别灌胃给药,正常组与模型组灌等容量的无菌注射用水,连续7d。实时荧光定量PCR和Western blot分析显示阿司匹林能显着抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICs mRNA和蛋白的表达(P＜0.01),其它用药组对ASICs无明显抑制作用,与模型组比较,无明显差异(P＞0.05)。各用药组能明显升高AA大鼠关节软骨细胞外基质(ECM)成分Ⅱ型胶原和aggrcan表达量,其中阿司匹林作用最显着。以上结果提示:抑制关节软骨细胞ASICs的表达对关节软骨具有保护作用,ASICs可能参与RA关节软骨破坏。4.ASICs阻断剂amiloride对AA大鼠关节软骨损伤的影响40只大鼠,随机分成正常组,AA模型组,amiloride(5 mg.kg~(-1))组,阿司匹林(50 mg.kg~(-1))组+amiloride(5 mg.kg~(-1))组,阿司匹林(50 mg.kg~(-1))组。足容积法测量继发侧足肿胀度;病理组织学检查结果显示各用药组关节软骨损伤明显改善;实时荧光定量PCR观察ASICs阻断剂amiloride能抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICsmRNA的表达,其中阿司匹林合并amiloride组抑制最为显着;免疫组化和alcian蓝染色分别检测ECMⅡ型胶原和蛋白多糖的变化,结果显示各用药组均明显升高ECMⅡ型胶原和蛋白多糖蛋的表达,其中阿司匹林合并amiloride组作用最为显着(P＜0.01)。通过离体细胞实验,用激光共聚焦显微镜(Fura-3/AM)检测细胞Ca~(2+)浓度的方法,分析胞外不同浓度pH值和阻断剂amiloride对关节软骨细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)的影响。结果表明细胞外pH(6.5,pH6.5)可使关节软骨细胞内Ca~(2+)水平短暂性升高,amiloride能明显抑制pH6.5诱导的关节软骨胞内Ca~(2+)水平。以上结果提示:ASICs阻断剂amiloride对大鼠关节软骨损伤具有保护作用,其机制可能通过阻断酸敏感离子通道,抑制Ca~(2+)超载,减轻软骨细胞损伤,从而保护关节软骨。
储继军[9]2016年在《补肾安胎冲剂对RSA小鼠母胎界面血管重铸的干预机制研究》文中指出目的本课题拟在前期研究的基础上,以VEGF/PI3K/AKT信号通路为切入点,研究补肾安胎冲剂对RSA模型小鼠胎盘血管重铸的干预机制。通过观察蜕膜VEGF、VEGFR-2、s VEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表达及组织形态学的变化,检测VEGF、VEGF受体、促血管生成因子、抑血管生成因子、PI3K、AKT、p-AKT等m RNA的表达,探索补肾安胎冲剂对VEGF/PI3K/AKT信号通路的影响,揭示补肾健脾中药促进母胎界面血管重铸、保护妊娠的分子生物学机制,以丰富补肾健脾中药治疗RSA的科学内涵。方法通过文献研究,总结分析RSA小鼠母胎界面血管生成与脾肾的关系;从中医理论角度,阐释RSA小鼠子宫蜕膜组织血管生成“从脾肾论治”的机制。实验取雌性CBA/J小鼠50只,雄性DBA/2小鼠20只,雄性BALB/c小鼠5只,按2∶1比例合笼交配,检出阴栓者计为妊娠第0天,分别建立RSA模型CBA/J×DBA/2小鼠与正常妊娠模型CBA×BALB/c小鼠,按妊娠顺序随机分为正常组、模型组和黄体酮胶囊对照组、补肾安胎冲剂低剂量组和补肾安胎冲剂高剂量组,每组动物数均为8只。其中正常妊娠组、模型对照组分别予以蒸馏水灌胃,黄体酮胶囊组、补肾安胎冲剂低、高剂量组分别给予相应药物灌胃,连续15天,末次给药24h后,断颈处死孕鼠,剖视子宫观察各组小鼠胚胎丢失率,取其子宫蜕膜组织,病理形态学观察子宫蜕膜组织变化,免疫组化SP法检测蜕膜组织VEGF、VEGFR-2、s VEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表达,蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)检测蜕膜组织MVD、HIF-1α、VEGF、ES及PI3K、AKT、p-AKT的表达,Q-PCR法检测蜕膜组织VEGF m RNA、VEGFR-2m RNA、s VEGFR-1 m RNA、Ras m RNA、MAPK m RNA、HIF-1αm RNA、ESm RNA的含量等。结果理论研究结果:1.母胎界面血管重铸是维持妊娠的关键。胎儿及胎盘的正常发育都主要取决于滋养细胞的分化和子宫-胎盘血管网络的构建。受精卵在着床过程之中,滋养细胞侵入子宫内膜和螺旋动脉,前者产生大量血管生成因子,后者逐渐取代内皮细胞,导致螺旋动脉扩张,不仅使植入部位的血流增加,而且使子宫内膜在短时间内迅速蜕膜化,在各种血管生长因子的共同调控下形成大量新生血管。2.血管新生是促进母胎界面血管重铸的本质。正常组织中由于缺少促血管生成刺激因子或者血管生成刺激因子被高水平血管生成抑制因子严格控制,促血管生成和抑制血管生成两者处于平衡状态;当促血管生长因子浓度上升,或者血管生成抑制因子浓度下降,都会打破血管生成的调节平衡,促血管生成因素处于优势从而引起血管生成过程。3.VEGF/PI3K/AKT信号通路调节促进母胎界面血管重铸。PI3K/AKT信号通路活化能通过多种途径上调低氧诱导因子-1α的表达,从而启动VEGF基因转录,促进VEGF表达。4.脾肾亏虚是RSA的重要病机。妊娠从着床到胎盘形成的整个过程不仅需要丰富的血液供应,而且都离不开血管新生、通透性改变,胚胎生长发育、妊娠成功的关键在于胎儿、胎盘及子宫蜕膜血管的生长发育,这就要求胎盘血管网需要充分发育才能满足母胎之间气体和养料的交换及胎儿代谢废物的排泄的需要。这些都与中医学“脾主运化”、“脾主升清”、“肾藏精,主生殖”等理论密切关联。5.健脾益肾是促进RSA母胎界面血管重铸的重要治则。补肾健脾法具有防治流产的确切疗效,补肾健脾中药补肾安胎冲剂能够促进血管的生成和发育,以维持正常的妊娠,为中药通过改善蜕膜血管生成方面而发挥其保胎作用机理提供了实验依据。实验研究结果:1.与正常妊娠小鼠相比,模型组RSA小鼠胚胎丢失率显着升高并具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性药组RSA小鼠胚胎丢失率显着降低并具有统计学意义(P<0.01)。2.与正常妊娠小鼠比较,模型组RSA小鼠绒毛形态呈现为大小不一,不规则状,合体滋养层细胞明显减少,细胞滋养层细胞也相对减少;模型组小鼠细胞可见萎缩变性,排列较为紊乱,并能观察到明显的凋亡细胞和炎性细胞;细胞核呈现固缩态,染色程度较深;间充质及基质纤维素样变性十分明显,间质血管也明显减少;此外,蜕膜组织变性明显,上皮有缺失,细胞排列凌乱,腺体呈皱缩状,血管可见明显瘀血。给予补肾安胎冲剂和黄体酮胶囊干预后,RSA小鼠蜕膜组织血管形态学呈现好转趋势。3.在各组小鼠蜕膜组织中,VEGF的表达主要见于蜕膜细胞、腺上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中,细胞核着色不明显,蜕膜细胞阳性染色强;VEGFR-2在蜕膜组织的阳性表达位于大部分蜕膜细胞及少数腺上皮细胞的胞核和胞浆内;s VEGFR-1在血管内皮细胞中存在丰富的表达。模型组RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表达低于正常组、低剂量组、高剂量组及阳性药组;s VEGFR-1的表达高于正常组、低剂量组、高剂量组及阳性药组。4.与正常组相比,模型组RSA小鼠HIF-1α、VEGF、MVD蛋白表达显着降低、ES蛋白显着升高并具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组HIF-1α、VEGF、MVD 3种蛋的白表达升高、而ES蛋白则降低,并具有统计学差异(P<0.05)。5.与正常组比较,模型组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达显着降低(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达显着升高并具有统计学意义(P<0.05)。6.与正常组相比,模型组RSA小鼠HIF-1α、VEGF m RNA表达显着降低、ES m RNA显着升高并具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组HIF-1α、VEGF m RNA表达显着升高、ES m RNA显着降低并具有统计学意义(P<0.05)。7.与正常组相比,模型组RSA小鼠RAS、MAPK、VEGF-R2 m RNA表达显着降低、SVEGF-R1 m RNA显着升高并具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组Ras、MAPK、VEGF-R2m RNA表达显着升高、SVEGF-R1 m RNA显着降低并具有统计学意义(P<0.05)。结论RSA小鼠存在蜕膜血管新生障碍,且蜕膜血管新生与VEGF/PI3K/AKT表达有关。补肾安胎冲剂能明显改善RSA小鼠胚胎丢失率、促进蜕膜血管新生。补肾安胎冲剂改善RSA小鼠蜕膜血管新生的机制在于:1.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织细胞因子表达改善RSA小鼠血管新生:通过上调蜕膜血管VEGF、VEGFR-2、MAPK、HIF-1α、RAS和MVD蛋白表达,下调s VEGFR-1和ES蛋白表达,从而改善RSA小鼠蜕膜血管新生。2.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织VEGF/PI3K/AKT通路表达改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达,调节VEGF/PI3K/AKT通路表达,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。3.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织HIF-1α、VEGF、ES m RNA水平改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管HIF-1α、VEGF m RNA表达,下调ES m RNA水平,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。4.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织RAS、MAPK、VEGF-R2 m RNA、SVEGF-R1 m RNA水平改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管Ras、MAPK、VEGF-R2 m RNA表达,下调SVEGF-R1 m RNA水平,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。
张锋, 陈飞虎[10]2011年在《重组人内抑素在猕猴体内的药物代谢动力学》文中提出目的通过静脉及皮下给药,研究重组人内抑素(rhEndostatin)在猕猴体内的药物代谢动力学过程,为临床合理用药提供依据和参考。方法通过高效液相色谱法和放射性检测法分别测定静脉及皮下给药后猕猴血液中重组人内抑素的放射性活性以及其浓度,进而求出其药物代谢动力学参数。结果静脉及皮下给药后,其主要药物代谢动力学参数分别为:t1/2α254 min,t1/2β764 min,平均滞留时间(MRT)969 min,曲线下面积(AUC)2 893 mg/L.min-1;Cmax4.01 mg/L,Tmax30 min,MRT1 982 min,AUC 2 502 mg/L.min-1。结论皮下给药不仅吸收速度较快,且吸收程度也很高,绝对生物利用度达到86.5%,提示皮下给药是合理的给药方式。
参考文献：
[1]. 重组人内抑素治疗大鼠佐剂性关节炎的血管生成抑制机理[D]. 岳莉. 安徽医科大学. 2004
[2]. 重组人内抑素对大鼠佐剂性关节炎继发性炎症的抑制作用[J]. 岳莉, 沈玉先, 王华, 刘丽华, 郑咏秋. 中国药理学通报. 2003
[3]. 重组人内抑素诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的研究[J]. 夏丽娟, 陈飞虎, 阮晶晶, 刘永靖, 袁凤来. 中国药理学通报. 2008
[4]. 雷公藤甲素配伍甘草酸对胶原诱导性关节炎大鼠的影响[D]. 张皖东. 中国中医科学院. 2007
[5]. 麝香乌龙丸对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理形态及VEGF、ES表达的影响[D]. 丁春菊. 河北联合大学. 2011
[6]. 重组人内抑素对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及机制研究[D]. 龚永芳. 安徽医科大学. 2017
[7]. 重组人内抑素对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响及机制研究[D]. 吕玉琳. 安徽医科大学. 2012
[8]. 酸敏感离子通道在佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞中的表达和部分功能研究[D]. 袁凤来. 安徽医科大学. 2008
[9]. 补肾安胎冲剂对RSA小鼠母胎界面血管重铸的干预机制研究[D]. 储继军. 湖北中医药大学. 2016
[10]. 重组人内抑素在猕猴体内的药物代谢动力学[J]. 张锋, 陈飞虎. 安徽医科大学学报. 2011