辽宁医学院附属第三医院 辽宁锦州 121000
摘要：目的：将质粒APP695进行1个突变体构建。方法：将第1785bp-1786bp（以目的基因ATG为起始）的碱基GA突变为TC，3'端去掉终止密码子TAG，克隆至pEGFP-N2载体中。结果：构建了突变质粒APPswe。
关键词：阿尔茨海默病；APPswe；质粒
前言
淀粉样前体蛋白基因（amyloid precursor protein，APP）是阿尔茨海默病（AD）相关基因之一。此基因按其转录产物的剪接方式不同可以生成至少6种 APP的亚型，其中最主要的三种为 APP695、APP751、APP770。其中APP695蛋白主要在脑组织神经元中表达。β淀粉样蛋白（β amyloid protein，A β）是构成 AD主要病理学特征之一，来源于APP蛋白[1][2]。
APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性 AD，瑞典家系的突变 Swedish mutations（K595N/M596L）是 APP的 595 /596位点密码子双重突变，即两个碱基对发生改变（Lys→Asn，Met→Leu），使赖氨酸被天冬氨酸置换，蛋氨酸被亮氨酸替代，从而导致 APP 的代谢过程发生改变，造成 A β过度沉积〔3〕[4].
实验方法：
一．引物设计与合成
序列（5’－3’）
F01：CTCAAGCTTCGAATTCATGCTGCCCGGTTTGGCAC
F02：TCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGAC
R01：GCATCCAGATTCACTTCAGAGATCTCCTCC
R02：GTCGACTGCAGAATTCGTTCTGCATCTGCTCAAAG
P1：CCTTCTCGTTCCTGACAA
P2：TGTCAATTCCGCAGGGCA
P3：CTGGGGATGAGAATGAAC
二．目的片段制作
1.PCR扩增
1-1.使用PrimeSTAR.HS DNA Polymerase（Code No.DR010S），对质粒进行PCR扩增。
反应体系：APPwild（10 ng/ul），1 ul；Primer*1（0.01 OD/ul），0.5 ul；Primer*2（0.01 OD/ul），0.5 ul；dNTP Mixture（各2.5 mM），4 ul；5×PrimeSTAR Buffer（Mg2＋ plus）
10 ul，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/ul），0.5 ul，dH2OUp to50 ul。
反应条件98℃，10 sec；55℃，10 sec；72℃，2 min；30 Cycles；72℃，10 min，1 Cycle
*1代表引物F01、F02。
*2代表引物R01、R02。
1-2.将引物F01/ R01、F02/ R02的扩增产物，分别命名为PCR产物Ⅰ、PCR产物Ⅱ，取5 ul进行1%琼脂糖凝胶电泳。
2.PCR产物纯化
将上述PCR产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code No.DV805A）分别进行切胶回收后，分别命名为InsertⅠ，InsertⅡ。
三．载体制作
1.将pEGFP-N2，使用EcoR Ⅰ进行酶切
反应体系：pEGFP-N2（200 ng/ul），5 ul；10×H Buffer，5 ul；EcoR Ⅰ，1 ul；dH2O，Up to 50 ul.
反应条件：37 ℃ 4 hours
2.取5 ul进行1% 琼脂糖凝胶电泳
3．载体回收
使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code No.DV805A）切胶回收约4.7kbp的DNA片段后，命名为Vector DNA。
四．In-Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit（Clontech Code No.639616），进行In-Fusion克隆。
InsertⅠ、InsertⅡ与Vector DNA的In-Fusion产物命名为APPswe。取上述产物1 ul热转化至E.coli Competent Cell JM109（Code No.D9052）中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒命名为CTD676-1。使用引物P1、P2、P3、pEGFP-NR对上述质粒进行测序，结果正确。
结论：
获得目的突变质粒APPswe。为阿尔茨海默病的发病机制研究奠定了基础。
参考文献：
[1]Torreilles F，Touchon J1Pathogenic theories and intrathecal analysis ofs poradic form of Alzheimer′ s disease〔 J〕Prog Neurobiol，2002；66：19122031
[2]Rodriguez-Rivera J，Denner L，Dineley KT.Rosiglitazone reversal of Tg2576 cognitive deficits is independent of peripheral gluco-regulatory status.ehav Brain Res，2011，216（1）：255-61.
[3]Matsui T，I ngelss on M，Fukumoto H，et al1 Expression of APP pathwaymRNAs and proteins in Alzheimer′s disease〔 J〕Brain Res，2007；1161：1162231
论文作者:刘旭颖
论文发表刊物:《健康世界》2015年21期
论文发表时间:2016/3/9
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