潘周辉[1]2003年在《人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达和生长影响的研究》文中研究表明肾癌是严重危害人类生命和健康的最常见肿瘤之一，其中绝大多数为肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)，起源于近曲小管的上皮细胞，为泌尿系统常见的恶性肿瘤，占肾恶性肿瘤的75％。因为肾细胞癌缺乏特异的早期症状，当患者出现典型的临床症状时往往已处于中晚期，临床上虽然采取积极的手术切除和辅助治疗，但疗效不佳，因此迫切需要寻找新的治疗方法以改善患者的预后。 研究表明恶性实体肿瘤的生长与转移必须依赖新生血管持续不断的为其提供营养。肿瘤血管的生成受多种促血管生成因子的调节，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，转化因子β1(TGFβ1)等，其中VEGF起主要作用，它具有强烈的促血管内皮细胞生长增殖的作用。研究表明大多数实体肿瘤中表达或过量表达VEGF，而肾癌作为一种高度血管化的实体瘤，大量资料显示，血管生成是肾癌生长，侵袭和转移的关键，人肾癌组织VEGF高表达，而且与肾癌的分级与分期密切相关。因此通过影响VEGF的表达从而干预肾癌的生长将是一种有效的方式。其中在基因水平干预VEGF的转录和翻译的反义基因疗法更有前瞻性研究价值。为此我们通过构建反义VEGF基因的pcDNA3.1真核表达载体并将其转染入肾癌细胞中，观察人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达的影响及生长的影响。为肾癌的基因治疗提供实验依据。 材料和方法： 1．RT-PCR方法克隆人VEGF基因：从人胶质瘤组织中提取总RNA；按照反转录试剂盒的说明合成VEGFcDNA；PCR反应，引物1为5'-CG GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GC-3'引物2为5'-CG AAG CTT TCA CCG CCT CGC CTT GTC ACA郑州大学2003年研究生毕业论文人反义vEGF荃因对肾癌细胞v印F表达和生长形响的研究TC一3‘，引物1与引物2序列分别加有EeoRI和Hind 111内切酶位点。将RT一PCR产物与pcDNA3.1各自分别用EcoRI和Hindm内切酶进行双酶切反应，然后进行连接反应，将VEGF基因定向克隆于pcDNA3.1真核表达载体，此载体含CMV启动子和氨基糖昔磷酸转移酶基因(G4 18)。转化感受态大肠杆菌DHSQ，挑取阳性载体克隆，进行酶切鉴定以及基因测序检测反义真核表达载体是否构建成功。 2.培养人肾癌786一0细胞，肾癌细胞株786一0细胞生长于RMPI 1640培养基，其中含1既FCS(V/V)，培养于5%C02(V/V)，37℃细胞培养箱中。当细胞处于对数生长期时，利用脂质体Lipofe。t胡INE分别将pcDNA3.1反义VEGF真核表达载体和peoNA3.l转染入人肾癌786一0细胞。分别命名为786一0一(antisens)VEGF组和786一0一PC组，未转染细胞命名为786一0。在G418浓度为700“g/ml的RMPll640培养基(含10%FCS)筛选巧天左右，786一O组细胞全部死亡。786一O一 (ant 1 Sens。)VEGF组和786一0一PC组均有细胞克隆形成。挑取两种细胞的阳性克隆，将两种阳性克隆细胞分别扩增培养。以300 pg/m1浓度为维持浓度。 3.利用以p一actin为内对照，定量RT一PCR方法在转录水平检测786一0- (antisense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这叁组细胞VEGFmRNA表达 4.制备细胞爬片，利用免疫组化方法(SP法)在蛋白水平检测786一0- (ant 1 sense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这叁组细胞VEGF表达 5.利用MTT法酶联免疫检测仪在波长492nm测786一0一(antisense)VEGF组、786一0一PC组和786一0组这叁组细胞的吸光度，绘制叁组细胞生长曲线。 6.统计学分析:采用SPSS10.0软件包进行ANOV统计分析。 结果:克隆出人VEGF基因，经酶切和DNA测序鉴定，证实反义VEGF基因的peDNA3.l真核表达载体构建成功:786一0一(antisense)VEGF组VEGFmRNA的表达受到抑制，明显低于786一0一PC组和786一0组VEGFmRNA的表达(P(0.01)，而786一O一PC组VEGFmRNA的表达没有受到影响，与786一0组相比二者无统计学差异(P>0.05):786一。一(antisense)vEGF组vEeF蛋白的表达明显降低，低于786一0一PC组和786一0组VEGF蛋白的表达(P(0.01)，而786一0一PC组和786一0组vEGF蛋白的表达二者无统计学差异(P>0.05);786一0一(antisense)VEGF组肾癌细胞生长受到抑制，同786一O一PC组和786一0组肾癌细胞生长相比786一0-(ant isense)VEGF组肾癌细胞生长明显减慢。郑州大学2003年研究生毕业论文人反义vE(:F基因对肾癌细胞v氏F表达和生长影响的研究 结论:结果显示本实验成功构建反义vEGF基因的pcDNA3.1真核表达载体;人反义VEGF基因可明显降低肾癌细胞VEGF的表达;明显减慢肾癌细胞的生长。为进一步对肾癌基因治疗的研究提供了一定的实验依据。
宋东奎, 潘周辉, 杨太森[2]2003年在《人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响》文中认为目的 探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。 方法 采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。 结果 pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。 结论 VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。
潘周辉, 陈昭典, 杨太森[3]2005年在《人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达的影响》文中认为目的:构建反义VEGF基因真核表达载体,研究其对肾癌细胞VEGF表达的影响。方法:克隆人 VEGF基因,将反义VEGF基因定向克隆于质粒PCDNA3．1(-)真核表达载体,酶切鉴定;转染入肾癌细胞,G418筛选阳性克隆。RT-PCR方法检测VEGFMRNA的表达,免疫组化法检测VEGF基因的蛋白表达,MTT法测细胞生长,流式细胞术检测细胞周期。结果:成功构建反义VEGF基因真核表达载体;反义VEGF组VEGFMRNA的表达受到抑制, 明显低于空载体组和对照组VEGFMRNA的表达,空载体组VEGFMRNA的表达没有受到影响;反义VEGF组的VEGF 蛋白表达明显低于空载体组和对照组,空载体组和对照组VEGF蛋白的表达无显着差异;反义VEGF组细胞生长减慢,G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。结论:人反义VEGF基因可明显降低肾癌细胞VEGF基因在转录和翻译水平的表达,抑制肾癌细胞生长,为肾癌基因治疗提供一定的实验依据。
金建军[4]2003年在《血管内皮生长因子在膀胱肿瘤血、尿中的表达和反义基因治疗的研究》文中认为背景膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤，近年来发病率明显上升。目前术前诊断和术后随访主要依据B超和膀胱镜检查，辅以尿脱落细胞学等检查。许多病人往往因为膀胱镜检查有痛苦而延误了病情，B超和尿脱落细胞学检查对早期肿瘤的发现和肿瘤复发效果也欠佳，尽管目前有许多膀胱肿瘤的标记物，但敏感性和特异性均不满意，因此我们研究血管内皮生长因子（VEGF）与膀胱肿瘤的关系，希望能找到一种更有效的膀胱肿瘤标记物。此外，尽管膀胱癌的治疗有手术、膀胱内药物灌注等方法，但膀胱癌患者肿瘤复发率及死亡率仍较高，特别是晚期膀胱肿瘤患者缺乏有效的治疗方法。大量研究表明血管生成是实体肿瘤生长、进展和转移的必要条件，肿瘤血管生成需要血管生成因子的作用，而血管内皮生长因子是最重要和作用最强的血管生成因子，研究显示VEGF的表达在膀胱肿瘤中广泛存在。因此，利用VEGF反义基因治疗膀胱肿瘤，可以减少VEGF表达，从而抑制肿瘤血管生成，使膀胱肿瘤生长受抑制和肿瘤坏死，从而达到治疗膀胱肿瘤的目的。所以，基因治疗膀胱肿瘤是一种新的探索，具有重要深远的意义。本课题用ELISA定量分析的方法测定对照者和膀胱肿瘤患者手术前后血清和尿液中的VEGF水平，探讨患者血清、尿液中VEGF作为膀胱肿瘤标记物的可能性及其临床意义；构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒，并将重组质粒转染人膀胱癌细胞株，研究反义基因治疗对膀胱癌细胞体外增殖和致瘤性的影响，探讨反义VEGF121 cDNA基因治疗膀胱肿瘤的作用和可行性，为膀胱癌的基因治疗提供一定的实验依据。第一部分 膀胱癌患者血清、尿液中VEGF的定量研究 目的研究VEGF在膀胱肿瘤患者的血清和尿液中表达情况，及其作为膀胱肿瘤标记物的价值。材料与方法膀胱癌患者40例，表浅性膀胱肿瘤20例，浸润性膀胱肿瘤20例。对照组36例，包括膀胱良性疾病17例和健康普查者19例。其中15例患者在行膀胱肿瘤切除术后3个月后再次随访。5例在术后3～6个月复发后再次随访。所有对象均在治疗开始前采集外周静脉血和收集中段尿，血清、尿液均以双抗体夹心ELISA方法测定VEGF含量，按试剂盒说明进行操作。尿液中VEGF值以<WP=5>该样本中尿肌酐浓度进行校正。 结果以系列标准溶液的浓度为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标制作标准曲线，对照标准曲线得到相应的VEGF浓度。所有膀胱癌患者和对照者血清、尿液中均检测到VEGF。膀胱癌患者血清和尿液VEGF平均水平分别为348.53±225.80 pg/mL和576.54±390.50 ng/gCr，都显着高于对照组（血清、尿液VEGF分别为123.89±50.19 pg/mL和60.08±36.26 ng/gCr）。膀胱癌病人随着分期升高而血清、尿液VEGF均呈相应升高的趋势。浸润性膀胱肿瘤中血清和尿液中VEGF水平明显比表浅性膀胱肿瘤要高。肿瘤切除术后3个月，绝大多数膀胱癌患者血清和尿液VEGF明显下降，而肿瘤复发者则又出现明显升高。 结论 本研究用ELISA定量分析的方法证明VEGF在膀胱肿瘤患者的血清和尿液中表达明显升高，并与肿瘤分期和分级密切相关，术后膀胱肿瘤患者血清和尿中VEGF水平降低，而复发者VEGF水平又重新升高，表明它们可以作为膀胱癌的肿瘤标记物，可望作为预后评估、疗效评价和术后随访监测的指标。 关键词血管内皮生长因子，膀胱肿瘤，血清，尿液，酶联免疫吸附试验第二部分 人反义VEGF121 cDNA表达质粒的构建 目的 构建pcDNA3-As-VEGF121重组质粒，为进一步研究VEGF反义基因对膀胱肿瘤的治疗作用奠定基础。材料与方法根据pcDNA3真核表达载体多克隆位点区特点和VEGF121 N端和C端氨基酸序列设计上游引物和下游引物。上游引物：5'-GCC GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT T-3' ；下游引物：5'-GTT GGA TCC TTA TCA CCG CCT CGG CTT-3'。上游引物引入EcoRⅠ位点，下游引物引入BamHⅠ位点，以pcDNA3-VEGF121为模板，PCR扩增VEGF121 cDNA，扩增产物经Klenow酶补平，BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收目的片段（0.48kb）。pcDNA3经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收载体片段（5.4kb）。两片段连接后转化大肠杆菌DH5α，扩增转化菌并制备重组质粒，重组质粒经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定。结果pcDNA3-As-VEGF121重组质粒经3套限制性内切酶鉴定。BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，出现0.48kb<WP=6>和5.4kb两个条带，0.48kb为VEGF121 cDNA片段，5.4kb为载体pcDNA3片段。BamHⅠ和EcoRⅤ限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，出现0.49kb和5.39kb两个条带。BglⅡ和EcoRⅤ限制性内切酶酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，出现1.37kb和4.51kb两个条带。进行DNA序列分析与预期结果相符，阅读框架（ORF）正确。结论将VEGF121 cDNA反向插入pcDNA3载体后得到重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 ，限制性内切酶酶切鉴定及DNA序列分析，表明pcDNA3-As-VEGF121构建成功。关键词血管内皮生长因子，膀胱肿瘤，反义cDNA，构建第叁部分 转染人反义VEGF121 cDNA对人膀胱癌细胞增殖的研究 目的
参考文献：
[1]. 人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达和生长影响的研究[D]. 潘周辉. 郑州大学. 2003
[2]. 人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响[J]. 宋东奎, 潘周辉, 杨太森. 中华泌尿外科杂志. 2003
[3]. 人反义VEGF基因对肾癌细胞VEGF表达的影响[J]. 潘周辉, 陈昭典, 杨太森. 中国病理生理杂志. 2005
[4]. 血管内皮生长因子在膀胱肿瘤血、尿中的表达和反义基因治疗的研究[D]. 金建军. 复旦大学. 2003
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