分子与细胞生物化学(2014)385：207-213
DOI10.1007/s11010-013-1829-x
摘要：胃癌（GC）在全球范围内是和癌症相关的死亡病因第二位疾病。根据临床研究来看，随着研究的深入，我们发现微小的RNA（miRNA）和肿瘤转移以及发生的关联性非常紧密。再次，我们验证了miR-25和胃癌组织细胞的增加有紧密联系。胃癌细胞内的miR-25表达增强，说明细胞的增殖加速，会有更多的迁移和侵袭出现，对该指标进行控制就能够减少细胞增殖，降低细胞的凋亡。该物质还会对胃癌细胞的迁移和侵袭产生影响。并且，我们发现带有kazal基序的逆转录诱导半胱氨酸丰富蛋白（RECK）是miR-25的靶标。如果RECK表达过度则会让miR-25的致癌效果被逆转。根据以上的分析，我们明白有部分miR-25会通过靶向RECK让胃癌细胞的生长增殖加剧，加强其运动能力。
关键词miR-25•RECK•胃癌•增殖•迁移•侵袭
介绍
胃癌（GC）在世界上是与癌症有关的死亡疾病第二位疾病，全球每年都要将近70万人因为胃癌而死亡[1]。胃癌属于复杂遗传性疾病，根据当前的一些研究表明，胃癌的发展受到癌基因以及肿瘤抑制基因的影响，该疾病和胃癌的发展有紧密的联系，可是却还不能确定具体的分子机制[ 2 ]。MicroRNAs（miRNAs）是一类新的非编码短RNAs，该物质时能够和3'非翻译区（3'-UTR）进行结合，引起翻译抑制和mRNA衰变，让靶基因的表达被限制[3]。乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌等等癌症疾病的发生发展和miRNA的表达有直接的联系，在其他的一些研究报道中有类似的报道[4-8].。目前根据临床的一些研究来看，miRNAs对肿瘤细胞的生物进程有不可替代的作用，细胞的增殖、分化以及转移都有其参与。[9-11]根据报道称，miR-25在许多的肿瘤中有异常表达过度的情况存在。比如在Xu等[12]报道食管鳞状细胞癌（ESCC）中，该物质表达上升，阻断了E-钙粘蛋白的表达，引起了恶性变性。在.Zhang等[13]的研究中，卵巢癌患者细胞中的miR-25的表达比较高，该物质还会对Bim靶向抑制卵巢癌细胞凋亡。在胆管癌中miR-25的表达也存在过度的情况，和靶向TNF进行联合诱导，让死亡受体-4增加了癌细胞的抗凋亡能力[14]。miR-25在胃癌患者的体内也有过度表达的情况[15,16]。可是我们对于miR-25对胃癌病变的发生和发展影响还不是不是分清楚，在各个环节上的作用不了解。此次研究中，我们对miR-25的增殖、迁移、侵袭影响情况进行了分析。并且，我们确定了kazal基元（RECK）是抑癌基因，也是miR-25的靶点。在此次研究中，miR-25会通过靶向RECK来让胃癌细胞的运动和生长能力得到提升，促进胃癌病变的发展和转移。
材料和方法
组织样本和细胞系
从我们部门通过手术共获得了27个胃癌组织样本和配对的正常组织。所有科目都取得了知情同意书，并且这项工作获得了齐齐哈医学院学术委员会批准。人胃癌细胞系SGC7901，MKN28，MKN45和非恶性胃上皮细胞系GES-I均来自中国科学院（中国，上海），并在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。HEK-293细胞在含10％FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，所有细胞系在37℃，5％CO 2条件下孵化培育。
RNA提取和定量实时PCR技术
(qRT-PCR)
通过TRIzol试剂（Invitrogen 加利福尼亚州, 美国，）分离总RNA。使用SYBR SYBR 预混料前标签（Takara，东京，日本）来评估ABI Stepone plus（ABI，CA，USA）上的基因表达。用一体化的microRNA提取试剂盒（GeneCopoeia，加利福尼亚州, 美国）分离出miRNA。用于RECK的引物：正向，5'-AACCAAATGTGCCGT-GAT-3'和反向5'-ACCTGGCAAAGATGAA-3'.GAPDH引物：正向，5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGGC- 3'，反向 5'-TTGACGGTGCCATGGAATTTG-3'。iR-25和U6的引物形式是从Copocia基因获得的。用GAPDH标准化RECK的表达，用U6标准化miR-25的表达。
赵鸿鹰和王宇同样为这项工作做出了贡献。
赵鸿鹰•王宇•杨柳•江荣科•李文庆
齐齐哈尔医学院附属第五医院
大庆龙南医院，肿瘤内科
大庆163453，中国
e-mail:zhaohy163@163.com
质粒
miR-25模拟物/抑制剂和相应的对照购自
RiboBio（中国广州）.pcDNA3-RECK是使用下列引物产生的：正向5'-GGGGTACCGCGGCGGTAGCGGCGGCA-3'和反向，5'-CCCTCGAGCCGTGGGCAGTCAGTT-3'。
在KpnI和XhoI限制性酶切位点（Invitrogen，CA，USA）将PCR片段亚克隆到peDNA3.0中。使用以下引物从正向，5'-CCCTCGAGCTCTGAAATACATAGGGATA-3'和反向5'-TTGCGGCCGCTTATTAAAATAGAAAAGC-3'从人CDNA扩增RECK mRNA的3'-UTR。在Xhol和Not限制性位点将PCR片段亚克隆到psi-
psi-CHECK2载体上（Promega.WI，USA）。RECK的miR-25结合位点模块中的突变通过全质粒扩增引入miR-25的种子区（NEB，Ipswich，
加拿大）。
细胞增殖实验
每孔共104个细胞接种在96孔培养板中，在正常条件下培养24小时。然后将其转染miR-25模拟物/抑制剂或相应的对照。48小时后使用细胞计数试剂盒8（CCK8）（Dojindo，Tokyo，日本））分析细胞增殖。
细胞凋亡测定
用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（Biovision，CA，USA）转染72小时后检测细胞凋亡情况。通过计数凋亡细胞的百分比来计算结果。使用Cell Quest软件分析数据。
图1 miR-25在GC组织和细胞系中的表达水平升高.a通过qRT-PCR检测GC组织和正常组织中miR-25的表达水平.b miR-25 在GCC细胞系SGC7901，MKN28，MKN45和对照细胞系（GES-1）中的表达水平，所有数据通过U6标准化。* p <0.05，**，p <0.01与对照组相比
施普林格
萤光素酶报告基因分析
将RECK和miR-25模拟物的野生型（WT）或突变型（Mut）3'-UTR转染到HEK-293细胞中。转染48小时后，使用双荧光素酶报告基因1000测定系统测定荧光素酶
（Promega）。实验独立重复四次
Western印迹法
从肿瘤组织和相应的正常组织或GC细胞中提取总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，IL，USA）测定蛋白质浓度，蛋白质被10％的SDS-PAGE凝胶分离并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，MA，USA）。首先将膜与特定的第一抗体孵育，然后与用HRP标记的第二抗体一起孵育，并通过ECL检测。使用ImageJ软件测定信号强度。
细胞迁移和侵袭检测
处理过的细胞同样铺在48孔Boyden室的上部隔室中，8μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器（BD Biosciences）。然后用未包被的（移动）或包被的基质胶（浸润）进行细胞迁移和侵袭测定。孵育24小时后，将迁移和侵入的下层细胞用甲醇固定，用Giemsa染色（0.05％），并在光学显微镜放大200倍计数，实验独立重复4次。
统计分析
数据以均数±标准差表示。组间差异采用单因素方差分析或非配对t检验分析，P <0.05被认为有统计学意义。
。孵化时间（小时） 孵化时间（小时）
对照 miR-25抑制剂
图2 miR-25促进胃癌细胞株增殖a miR-25的强制表达显着增强MKN28细胞的细胞增殖。b miR-25的抑制显着降低SGC7901细胞的增殖。
C miR-25抑制剂诱导SGC7901细胞凋亡的比例明显高于负调控对照组* P <0.05，** P <0.01与对照组比较
结果
在GC组织样品和细胞系中miR-25升高
应用qRT-PCR技术检测27例胃癌组织和相应正常组织样本及3例胃癌细胞系SGC7901，MKN28，MKN45和胃上皮细胞系中miR-25的表达。miR -25在GC组织样品和细胞系中的表达显著升高（图1a，b）。
milR-25促进的GC细胞系增殖
我们研究了miR-25对GC细胞系增殖的影响。miR-25的过度表达显著提高了MKN28细胞的增殖（图2a）。相反，miR-25的抑制剂转染可以显著降低SGC7901的增殖（图2b）。这些数据表明miR-25可以促进GC细胞的细胞增殖。
我们进一步探讨了miR-25对细胞凋亡的影响，发现转染miR-25抑制剂72小时后SGC7901细胞中的凋亡显着增加（图2c），表明miR-25可能在人类GC细胞中起抗凋亡因子的作用。
miR-25提高GC细胞系的活力
、
为了研究miR-25对GC细胞运动性的作用，将miR-25或对照转染到MKN28细胞中并进行迁移和侵袭测定。miR-25显著增强MKN28细胞的迁移和侵袭能力（图3a，b）。相反，miR-25抑制剂转染显著降低了SGC7901细胞的迁移和侵袭能力（图3c，d）。这些数据表明， miR-25能提高GC细胞的迁移和侵袭能力。
图3 miR-2促进GC细胞系运动。
a转染了miR-25模拟物的MKN28细胞的迁移。
b用miR-25模拟物转染的MKN28细胞的侵袭。
C用miR-25抑制剂转染的SGC7901细胞的迁移。
d转染miR-25抑制剂的SGC7901细胞的侵袭* p <0.05
与对照组相比
RECK是miR-25的直接靶标
使用TargetScan 6.2选择miR-25的潜在靶标，并且RECK.一种肿瘤抑制基因也被预测为miR-28的靶标。将野生型或突变的RECK 3'-UTR序列扩增并亚克隆入 萤光素酶报告基因载体（图4a）。.miR-25抑制WT RECK 3'-UTR的萤光素酶活性，而对HEK-293细胞中的Mut RECK 3'-UTR没有影响（图4b）.miR-25在MKN28中的过度表达显着抑制RECK中 mRNA和蛋白质的表达水平（图4c，d）。而在SGC7901细胞中的miR-25抑制剂转染显著增加RECK的mRNA和蛋白质的表达水平（图4e，f）。 这些结果表明在转录后miR-25抑制RECK表达。
RECK的过度表达减弱了miR-25的致癌作用
A
WT RECK 3'-UTR 5’...UAUAAAUGUCUUUAAUGCAAUAU...3’
hsa-miR-25 3'AGUCUGGCUCUGUUCACGUUAC5’
Mut RECK 3'-UTR 5’...UAUAAAUGUCUUUAAUCCUAAAU...3’
B
相对的荧光素酶的活性
WT Mut
C
相对强度
RECK GAPDH Control miR-25 Control miR-25
D
相对表达
Control miR-25
E
相对强度
RECK GAPDH Control
miR-25 inhibitor Control miR-25 inhibitor
F
相对表达
Control miR-25 inhibitor
图4 RECK是miR-25的直接靶点。
a RECK 3'-UTR中潜在的miR-25靶向位点和突变序列。
b将HEK-293细胞与miR-25或具有WT或Mut RECK 3'-UTR的载体共转染
检测到.Luciferase活性物。c在用miR-25或对照转染的MKN28细胞中通过Western印迹法检测RECK蛋白水平。d在用miR-25或对照转染的MKN28细胞中通过qRT-PCR检测RECK mRNA的表达。e在用miR-25抑制剂或对照转染的SGC7901细胞中，通过Western印迹法检测RECK蛋白水平。 GAPDH被用作内参照。f在用miR-25抑制剂或对照转染的SGC7901细胞中通过qRT-PCR检测RECK mRNA的表达。GAPDH作为内参照* P <0.05，** p <0.01与对照组相比
进一步调查，以研究RECK过度表达是否可以减弱miR-25的致癌作用（图5a）CCK8试验，细胞迁移和侵袭（图5b，c）均表明通过RECK过度表达质粒补充的RECK ，pcDNA3-RECK可显著减弱miR-25的致癌作用。通过qRT-PCR验证RECK质粒的效果（图5d）。 这些结果表明miR-25部分通过靶向RECK促进了GC细胞的增殖和运动。
讨论
虽然临床中对于miRNA在各种癌症中的情况进行了较多的研究，可是胃癌中的mi’RNA异常表达和潜在功能的研究还是比较少，我们对其了解还是不够多。再次我们和正常进行了对比，胃癌组织样本和细胞系的miR-25表达有明显的增加表现，和其他的癌症研究结果相符合[12-14]，对于胃癌患者，我们了解到miR-25对癌细胞增殖，癌细胞凋亡抑制都有非常大的帮助。除此之外，抑制miR-25能够让SGC7901细胞中的细胞迁移和侵袭能力下降，而该物质的过度表达则会让MKN28细胞的迁移和侵袭能力增加，所以我们根据结果来分析，miR-25对胃癌的发展有着非常重要的作用。
RECK已被报道为GC和细胞系中的肿瘤抑制基因。RECK最初是通过在ras激活的成纤维细胞中诱导逆转的能力被发现的。RECK的主要作用是抑制基质金属蛋白酶（MMPs）参与细胞外基质分解和血管生成。包括MMP-2.MMP-9和MMP14。都被认为参与了癌症进程.RECK在胚胎形成[17]，血管形成和肿瘤生成中起着重要的生理作用[18]。许多肿瘤与RECK下调有关，特别是RECK的下调与生存率降低相关，至少有19种人类肿瘤细胞系被证实缺失RECK mRNA [18]。到目前为止，有关预后和RECK表达的肿瘤研究包括乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰腺肿瘤[ 19 ]。RECK已被报道受多种miRNAs调控.Hirata等[24] 报道，miR-182-5p作为致癌基因，通过抑制RECK和SMAD家族成员4（Smad4），可导致膀胱癌中β-catenin信号通路的激活.RECK也被发现在一些肿瘤中是miR-21的直接靶标，并起到肿瘤抑制剂的作用[25-27]。在我们的研究中，我们发现miR-25负调节RECK表达，RECK的过度表达可以减弱miR-25的致癌作用，如在增殖，迁移和侵袭检测中所示。
总而言之，miR-25在胃癌中过度表达，其异常表达对人体的胃癌细胞生物过程会造成影响，参与其中，导致胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭，可以抑制RECK表达.miR-25可能作为 GC的生物标志物，采取抑制miR-25的方式可以让治疗胃癌疾病获得较好的理论依据。
利益冲突作者声明他们没有利益冲突。
培养时间（小时） 对照miR-25 miR-25 + RECK
图5 RECK过表达减弱了miR-25的致癌作用
aMKN28细胞与miR-25和RECK或载体共转染。 使用CCK8试验来测试细胞增殖
b与miR-25和RECK或载体共转染的MKN28细胞的迁移测定。
c与miR-25和RECK或TNF-α共转染的MKN28细胞的侵袭测定
* P <0.05。** p <0.01与对照相比* P <0.05。 **与miR-25组相比，P <0.01
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论文作者:赵鸿鹰•王宇•杨柳• 江
论文发表刊物:《世界复合医学》2018年第04期
论文发表时间:2018/6/15
标签：细胞论文; 胃癌论文; 转染论文; 细胞系论文; 靶向论文; 肿瘤论文; 抑制剂论文; 《世界复合医学》2018年第04期论文;