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ELISA试验以其灵敏度高、特异性好、操作简便、可大批量操作等特点而广泛应用于各种传染性疾病、肿瘤标志物及激素等项目的检测[1]，优质的试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。所谓“花板”，指在所有标本进行检测的过程中，所用的仪器及加样过程都处于正常状态，步骤均按各种试剂说明书的要求去操作，排除实验所用仪器和操作步骤对实验结果的影响外，试剂盒内的空白、阴性和阳性对照以及室内质控值都很正常，只有检测的血液标本情况异常，标本孔的吸光度（OD值）明显偏高、弱阳性结果出现较多的现象。这种现象对检验结果的正常判断造成了很大的影响，权威数据报告阳性率不应该是很高的情况下，复查后出现“花板”问题的标本基本上仍是阴性。因此，如何避免“花板”的产生，先要找出造成“花板”的原因是关键。
ELISA试验操作并不复杂，但影响试验结果的因素却很多。为了避免“花板”问题的出现，降低检测的假阳性率，获得更理想的实验结果，同时为了节约试剂避免不必要的浪费，首先在选择ELISA试剂时，应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据，保证试剂来源可靠，效期内使用，不同厂家或批次的试剂不能混用。其次，在标本因素、操作因素、边缘效应等方面要注意以下几点。
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1标本因素
标本的采集和处理不规范，严重溶血或血脂的标本，使待测血清中混有红细胞或纤维蛋白原，这两种物质易沉淀或附着在酶标板聚乙烯孔内不易洗净，所以样本的采集及血清分离中要注意避免溶血、血脂、细菌污染，有溶血、混浊或絮状物时，应自然放置1-2h或37℃水浴放置10min，使血液充分凝固收缩，然后适当加强离心速度，延长离心时间（3000r/min离心15min），使血细胞和纤维蛋白充分沉淀，血细胞与血清彻底分离后取上清检测，让标本中的非特异性物质所致的假阳性率降至最低。有资料表明，离心转速越高，离心时间越长，标本得到充分离心后，可有效避免“花板”的出现[2]
2操作因素
2.1加样 加标本时尽量避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板；加样太快，无法保证加样的准确性和均一性，加在孔壁上部的非包被区，也易导致非特异性吸附而出现“花板”。
2.2 温育 因样本过多，加样后未及时放入温育箱或温育后洗板机来不及及时洗板，导致反应板在室温放置时间过长，人为间接增加了反应时间，致蛋白质非特异吸附于固相载体，导致非特异性结合，难以清洗造成“花板”，因此要严格控制加样时间，样本较多时应分批操作。封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象导致“花板”。反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确，温度过高也易造成“花板”。由于厂家的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构特别，易产生边缘效应，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，易造成周边与内部孔结果差异。干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。
2.3洗涤 如果酶标板质量差，结合不均匀造成包板不均匀易致“花板”；酶标板的材料聚苯乙烯因其具有较强的吸附蛋白质的性能而被广泛用于ELISA试验的固相载体，但聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，它既能吸附特异性蛋白质，也能吸附非特异性蛋白质，所以需要在洗涤时把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来，通过洗涤来清除反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，洗涤在ELISA实验过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着试验的成败。如对高IgG血症的血液中存在的非特异性IgG，操作者很难在加样时将其去除，解决的最佳时机就是洗涤[3]。手洗：手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染或花板、跳孔；洗板完毕拍板时用干净合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。注意洗液量既不能过少出现边缘效应，也不能过满造成孔与孔之间液体溢出连成整体液面后产生“花板”。机洗：要求板要平整，洗板机洗板过程中，往往是数排一起洗，如果板不平，就容易造成洗液有残留，对结果造成干扰；严重血脂、凝血或污染的标本易造成洗板机加液头堵塞或针口有纤维蛋白和异物，导致在洗板的过程中产生拖带现象而导致“花板”，因此要勤疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要尽可能少。洗液时环境温度也会影响洗板的干净程度，尤其是冬天温度过低时容易出现“花板”问题，最好保持室温在20-30℃。洗液要新鲜配置，放置时间过长易产生絮状物或浑浊，造成堵孔或“花板”。洗板次数不够或洗板浸泡时间过短也会因洗板不净造成“花板”。
2.4显色 有些厂家的试剂显色剂不稳定，使用前易变蓝，如使用前不仔细检查，也易出现”花板“现象。
3边缘效应
边缘效应是指外周孔显色较中心孔深，原因为96孔板周孔与中心孔表面热力学梯度不同，工作环境温度不均衡，出现边缘效应；使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可排除边缘效应，且可提高测定重复性。
4人为因素
4.1主观因素 责任心不强，导致操作失误，不及时更换吸头，人为改变操作步骤，缩短或延长反应时间，随意增减洗涤次数及洗涤量，洗液配置浓度过高或过低等。
4.2客观因素 如视力不好，手抖等导致交叉污染出现“花板”
参考文献：
[1]张国平，王林，等.酶联免疫吸附试验“花板”问题原因分析[J].检验医学与临床，2008年9月第5卷第18期，1131
[2]柯丽.ELISA法检测HBsAg出现“花板”问题的解决[J].现代检验医学杂志，2006年11月第21卷第6期，102
[3]白风梅.ELISA“花板“出现的原因及处理方法初探[J].中国实用医药.2011年3月第6卷第8期，145
论文作者:敬秀芬,贺文娟
论文发表刊物:《健康世界》2015年6期
论文发表时间:2015/10/29
标签：标本论文; 试剂论文; 操作论文; 时间论文; 边缘论文; 水浴论文; 效应论文; 《健康世界》2015年6期论文;