乔永[1]2007年在《湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究》文中研究说明为了给绵羊肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积规律及相关基因表达规律的研究提供基础资料,本文以0~6月龄的雄性湖羊羔羊为试验对象,探讨了湖羊羔羊不同部位肌肉(背最长肌、腰大肌、后腿股二头肌和前腿肱二头肌)肌内脂肪沉积的发育性变化以及脂肪沉积和代谢相关基因表达的发育性变化特点。本研究用索氏抽提法测定肌内脂肪含量;以GAPDH基因为内标,用real time PCR法对影响肌内脂肪含量的部分相关基因的表达进行了相对定量分析;并对基因表达与肌内脂肪含量的相关性进行了分析。研究结果如下:1.湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积的发育性变化(1)湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪含量在0-6月龄间均呈上升趋势,5月龄时极显著高于前面各月龄(P<0.01);在背最长肌中,2月龄时IMF显著高于初生时(P<0.05);腰大肌IMF在3月龄时显著高于初生时(P<0.05);后腿股二头肌IMF在前4个月龄时差异均不显著;在0~6月龄间,背最长肌IMF量均高于腰大肌和股二头肌;表明肌内脂肪沉积在绵羊不同部位肌肉沉积的速度有较明显差异,湖羊肌内脂肪的沉积有较明显的组织特异性。(2)4~5月龄是湖羊羔羊肌肉脂肪沉积最快的时期,5月龄时的肌内脂肪含量在不同肌肉部位都极显著高于前面各月龄(P<0.01),表明4~5月龄时是湖羊羔羊肌内脂肪迅速沉积的一个重要时期。2.湖羊羔羊肌肉OB基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)在湖羊羔羊背最长肌中,OB基因mRNA表达水平3月龄时极显著高于其余各月龄(P<0.01);在腰大肌中,初生时表达水平最高,显著高于2~3月龄(P<0.05),3月龄时下降到最低,到4月龄后回升;在前腿肌肉中,初生羔羊的OB基因表达量最高,显著高于3、5和6月龄(P<0.05),然后随月龄增加而波动下降,6月龄时降到最低;后腿肌肉中,初生时OB基因表达量较低,随月龄的增加而上升,3月龄时升到最高,极显著高于初生时(P<0.01),显著高于其余各月龄(P<0.05),然后4月龄时回落,并保持这种低水平表达;(2)初生时腰大肌和前腿肌肉OB基因表达水平极显著高于背最长肌和后腿肌肉(P<0.01),3月龄时背最长肌极显著高于腰大肌和前腿肌肉(P<0.01),后腿肌肉显著高于腰大肌和前腿肌肉(P<0.05);表明OB基因mRNA表达水平发育性变化在湖羊羔羊肌肉中表现出较明显的组织特异性;(3)背最长肌中OB基因的表达与IMF在3~6月龄间成负相关(r=-0.405,P=0.119),股二头肌OB基因的表达量与IMF在3~6月龄间成负相关(r=-0.303,P=0.194),表明OB基因在肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积起着一定的负作用。3.湖羊羔羊肌肉OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)OBR基因mRNA在湖羊羔羊不同部位肌肉中的发育变化模式基本相同,即在刚出生时表达量均较低,然后随月龄增加而上升,到3月龄时各部位均升到最高,然后又下降,保持一个相对较低的水平;腰大肌中,2月龄时OBR mRNA的表达水平极显著高于0~1月龄和4~6月龄(P<0.01);背最长肌中OBR表达水平在3月显著高于2和6月龄(P<0.05);OBR基因在肱二头肌中的表达水平在3月龄时极显著大于其余各月龄(P<0.01);在股二头肌中,3月龄时OBR基因表达水平极显著大于0~1和5~6月龄(P<0.01),显著高于4月龄(P<0.05),6月龄水平显著低于2月龄(P<0.05);(2)2月龄时股二头肌OBR基因mRNA表达量极显著高于背最长肌(P<0.01),3月龄时肱二头肌和股二头肌均高于腰大肌和背最长肌(P<0.05),4月龄时股二头肌极显著高于腰大肌(P<0.01),表明OBR基因在湖羊羔羊肌肉中的表达呈现出组织特异性和时序性发育变化模式;(3)股二头肌中OBR基因的表达量与IMF在本研究中的各月龄均呈明显的负相关(r=-0.433,P=0.012);在背最长肌(r=-0.128,P=0.209)和腰大肌中(r=-0.254,P=0.168)也发现成负相关,表明OBR基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积也起一定的负作用。4.湖羊羔羊下丘脑OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊下丘脑OBR基因在0~6月龄间保持稳定表达水平;(2)湖羊下丘脑OBR基因表达水平与各部位肌肉肌内脂肪含量无明显相关性。5.湖羊羔羊肌肉FAS基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊背最长肌中FAS基因mRNA表达在初生时较低,然后波动上升,到5月龄时升到最高(P<0.01);在腰大肌中,FAS基因mRNA水平变化呈现出先高后低的趋势,2月龄时最高,极显著高于4~6月龄(P<0.01),4月龄时最低,极显著低于0~2月龄(P<0.01);前腿肌肉中,FAS基因mRNA水平随月龄的增加先上升后下降,到3月龄时升到最高,极显著高于其余各月龄(P<0.01),然后下降保持相对较低水平的表达;后腿肌肉中FAS基因表达量初生时较低,波动上升,到3月龄时最高,然后4月龄时下降到最低,极显著低于3和6月龄(P<0.01),5~6月龄缓慢回升;(2)除4月龄时,腰大肌FAS基因mRNA水平均极显著高于其余各部位肌肉(P<0.01);2月龄和5~6月龄时背最长肌FAS表达也极显著高于其余各部位(P<0.01);3月龄时前腿肌肉FAS mRNA水平极显著高于其它部位肌肉(P<0.01)。表明FAS基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性;(3)背最长肌FAS基因表达量与IMF在0~6月龄呈极显著正相关(r=0.606,P=0.005),腰大肌中FAS基因表达量与IMF在4~6月龄呈正相关关系(r=0.360 P=0.187),股二头肌中FAS基因表达量与IMF在4~6月龄呈正相关关系(r=0.471,P=0.076),表明FAS基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着正向调控的作用。6.湖羊羔羊肌肉HSL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)HSL基因在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化表现为:背最长肌中初生时最低,然后随月龄的增加上升,3月龄时出现峰值,显著高于0~1月龄(P<0.05),然后又下降,6月龄时升到最高,极显著高于以前各月龄(P<0.01);腰大肌中表现为“下降-上升-下降-上升”的模式,3月龄时最高,极显著高于1和4月龄(P<0.01);前腿肌肉中先下降,后上升,再下降保持稳定,2月龄时最低,极显著低于刚出生时(P<0.01);后腿肌肉表现为先上升,后下降,又上升的模式,3月龄时最高,显著高于0~1月龄(P<0.05),4月龄时最低,极显著低于3月龄(P<0.01);(2)在0~6月龄,腰大肌中HSL基因mRNA表达量均极显著高于其它部位(P<0.01),0月龄时背最长肌极显著低于其它部位.(P<0.01),4月龄时股二头肌极显著低于其余部位(P<0.01),6月龄时背最长肌极显著高于前腿和后腿肌肉(P<0.01);表明HSL基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性,其中在腰大肌中的表达量显著高于其余各肌肉部位;(3)对湖羊羔羊不同部位肌肉中HSL基因的表达量和IMF的相关性分析表明:各部位肌肉中两者均呈正相关关系,其中背最长肌在0~6月龄呈极显著相关(r=0.630,P=0.0003),腰大肌和股二头肌中4~6月龄两者的相关系数分别为0.589(P=0.020)和0.280(P=0.121),表明HSL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪沉积的调控可能不是在mRNA水平,可能在蛋白水平上。7.湖羊羔羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)LPL基因在湖羊羔羊不同肌肉部位表现出较明显的差异:在背最长肌中LPL基因的表达随月龄的增加而上升,到5月龄时升到最高,显著高于1~4月龄(P<0.05),极显著高于0月龄(P<0.01);在腰大肌中LPL水平初生时较高,到1月龄时上升,到3月龄间稳定,4月龄时下降到最低,5~6月龄回升到1~3月龄时的水平,各月龄间差异不显著;前腿肌肉中,0~2月龄保持稳定,3月龄时升到最高,4月时下降,5月龄时上升,到6月又下降,其中3和5月龄时的表达量极显著高于其余各月龄(P<0.01);后腿肌肉中,LPL基因初生时较高,然后下降,到3月龄时升到最高,4月龄时下降,5~6月龄又回升,各月龄间差异不显著;(2)在刚出生时,股二头肌中LPL mRNA水平极显著高于其余部位肌肉(P<0.01),1~2月龄时腰大肌和股二头基因表达量均高于另外两个研究部位(P<0.05),3月龄时股二头肌极显著高于背最长肌(P<0.01),4月龄时背最长肌和股二头肌均显著高于另外两个部位(P<0.05),6月龄时肱二头肌极显著低于其余三个部位(P<0.01);(3)湖羊羔羊背最长肌中LPL基因的表达量与IMF在0~6月龄呈极显著正相关(r=0.503,P=0.005),在股二头肌肌肉中,LPL基因mRNA水平与IMF呈正相关(r=0.294,P=0.102),表明LPL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积有一定的积极作用。8.湖羊肌肉UCP3基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊不同部位肌肉中UCP3基因表达的发育性变化表现为:在背最长肌中,初生时较高,到1月龄时升到最高,然后随月龄增加下降,6月龄时降到最低,各月龄间差异不显著;腰大肌中表现为先上升后下降的模式,3月龄时出现峰值,各月龄间差异不显著;前腿肌肉中初生时较高,1月龄有所下降,2月龄升到最高值,3月龄下降到最低,4月龄回升后又逐渐下降,各月龄间差异不显著;后腿肌肉在各月龄间保持较稳定的水平,没有较大差异;(2)在3月龄时腰大肌中UCP3基因表达水平显著高于其余三个肌肉部位;表明UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的发育性变化有差异,但差异不明显。(3)湖羊羔羊背最长肌中UCP3基因的表达量与背最长肌IMF在0~6月龄呈负相关(r=-0.211,P=0.262);在股二头肌肌肉中,UCP3基因mRNA水平与股二头肌中IMF在2~6月龄间呈负相关(r=-0.209,P=0.328);在腰大肌中,UCP3基因的表达量与IMF在3~6月龄成负相关(r=-0.286,P=0.266),表明UCP3基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着负向调控的作用。
李玉成[2]2008年在《ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控及其机理研究》文中认为脂肪组织中的甘油三酯在维持机体能量平衡过程中起着重要的作用。它的水解是一系列有序调控的过程,在不同的过程中有不同的酶参与。新近发现的脂肪酶ATGL特异性地水解甘油三酯,是甘油三酯水解的主要限速酶。同时它与游离脂肪酸的浓度、葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性紧密相关。因此,它的表达调控很受关注。脂肪细胞因子leptin可以提高脂肪细胞的脂肪分解,诸多现象表明,ATGL在leptin调控脂解过程中可能发挥着重要的作用。但ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化及其机理至今还没有被直接和系统地研究。因此,本实验以与人类生理生化等方面最为相似的猪为模式动物,采用RT-PCR、细胞培养、甘油和FFA释放量测定、半定量RT-PCR、Western Blot等方法克隆了猪ATGL的全长CDS,研究了ATGL在leptin促脂解中的表达变化,并初步探讨了其机理。取得以下主要结果:1成功克隆了猪ATGL基因全长CDS,长度为1446 bp,GenBank登陆号为EU373817。与GenBank已发表的人和小鼠的ATGL基因进行序列比对,同源性分别为87%和82%,这说明猪ATGL基因与人和小鼠在核苷酸水平有较高的同源性,暗示他们之间具有相似的功能和表达调控。猪ATGL基因全长CDS的克隆为研究ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化奠定了一定的基础。2明确了leptin呈浓度依赖性促进猪脂肪细胞的脂解。与对照组相比,5、20和50 ng/mL的Leptin均可显著促进甘油的释放( P< 0.01),并且leptin呈浓度依赖性促进甘油的释放,其中促进甘油最大释放的浓度为50 ng/mL;而与对照组相比,5、20和50 ng/mL的leptin均可降低FFA的释放,但差异不显著( P>0.05)。3从体内和体外两个水平研究了ATGL mRNA和蛋白在leptin介导脂解过程中的表达调控,首次发现了在leptin介导脂解的过程中, ATGL mRNA表达升高的同时却伴随ATGL蛋白表达的下降。在体外猪脂肪细胞上的研究表明,ATGL mRNA的表达随着leptin浓度的增加不断升高,而ATGL的蛋白却不断降低;在活体皮下脂肪组织上的研究表明,ATGL mRNA和蛋白的表达与血清中leptin的水平密切相关,高水平的leptin伴随ATGL mRNA的高表达,但同时伴随ATGL蛋白的低表达。4初步研究了ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控机理,发现了ATGL在leptin介导脂解中的表达受到JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和PPARγ的共同调控。JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路的特异性抑制剂AG490和SB205380分别使ATGL mRNA的表达下调35.02%和23.26%,但与对照组相比,都显著提高ATGL蛋白的表达;PPARγ的特异性抑制剂GW9662和激动剂rosiglitazone分别使ATGL mRNA的表达上调9.16%和下调18.26%,并相应地使ATGL蛋白表达显著下调和上调。
孙平[3]2017年在《茶叶儿茶素合成相关miRNA及靶基因的验证和表达分析》文中研究说明儿茶素是茶叶中重要的次生代谢物,不仅对茶叶的品质形成起着重要作用,而且是茶叶中重要的保健物质。目前,儿茶素已广泛应用于食品、医药及日用品等领域。microRNA是植物基因表达的一类重要调控因子。miRNA参与调控植物器官的形态建成、信号转导、激素应答、逆境胁迫、营养代谢等植物生长发育的各个方面。miRNA对茶树生长发育的作用机理和功能研究逐步发展成为现代茶树研究的新方向。目前关于儿茶素合成调控的研究大多是从环境因素和转录因子角度出发,有关miRNA参与茶树儿茶素生物合成的研究报道较少。本文通过生物信息学和高通量测序获得茶树miRNA序列信息,利用RLM-RACE和降解组测序技术验证miRNA对儿茶素合成相关基因的调控。同时研究了茶树DHD/SDH基因的miRNA鉴定、表达分析,及DHD/SDH在烟草中的干扰表达试验,初步探究DHD/SDH在茶树中功能。主要研究结果如下:1生物信息学鉴定茶树保守miRNA以高EGCG含量的茶树特异资源茶树新品系'1005'转录组文库和miRBase数据库为基础,通过生物信息学方法挖掘茶树中潜在的miRNA序列,获得80个miRNA家族的92个成员。采用qPCR验证miRNA,检测了 31条miRNA在茶树1叶、3叶和老叶中的表达。对miRNA表达模式进行分析,miRNA的表达模式有一致性,但也存在差异。通过qPCR试验检测了 miRNA在不同茶树叶片中的表达水平,这也进一步验证生物信息学预测的可靠性及miRNA的存在。2高通量测序法鉴定茶树miRNA以茶树'1005'混合叶片为样品,利用高通量测序鉴定茶树中保守miRNA,挖掘茶树特异miRNA。通过测序和分析,获得73条保守茶树miRNA,42条茶树新miRNAs。3利用降解组测序鉴定茶树miRNA的靶基因以茶树'1005'混合叶片为样品,构建茶树叶片降解组文库,结合茶树miRNA序列信息和转录组文库分析,共获得miRNA的26条靶基因,共检测到26个降解位点。靶基因主要是转录因子、抗病蛋白、信号转导,其中大部分靶基因与拟南芥同源。利用RLM-RACE验证了 5个miRNA的5条靶基因,与降解组测序得到的结果基本一致。4儿茶素合成相关基因mRNA裂解位点的验证在生物信息学和高通量测序鉴定的茶树miRNA信息基础上,结合NCBI中登录的儿茶合成相关基因序列进行预测,预测结果显示多条miRNA裂解儿茶素合成途径相关基因。利用RLM-RACE法进行裂解位点验证,结果鉴定了 14条miRNA对9条茶树儿茶素合成相关基因的裂解。9条基因为桂皮酸一4-羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、两条查尔酮合成酶(Chalcone synthas,CHS)、查尔酮异构酶(Chaalcone isomerase,CHI)、黄烷酮 3-羟基化酶(Flavanone 3-hydroxylase,F3H)、二氢黄烷醇 4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、无色花青素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR),及两条花青素还原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)。C4H同时被 miR5251 和 miR7777-5P.1 裂解;miR167a 和 miR529d裂解CHI;miR7814同时裂解CHS1和CHS3,产生两个裂解位点;miR5240、miR3444b 和 miR4380a 同时可裂解DFR;miR156g-3p 靶向F3H,试验获得两个裂解位点;miR2868裂解LAR miR5559-5p同时裂解ANR1和ANR2,miR2593e裂解ANR1。另外miR5264和miR7717c-3p裂解靶基因AVR2,且存在多个位点。同时验证过程中发现,靶基因还存在其他潜在剪切位点,说明存在其他未鉴定的miRNA对儿茶素的合成起调控作用。5 miRNA及儿茶素途径相关基因表达与儿茶素积累模式分析对茶树'1005'扦插茶苗进行ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA五种外源激素处理,利用高效液相色谱检测叶片儿茶素含量。结果显示ETH、24-D、IAA、ABA和6-BA处理后酯型儿茶素含量变化与儿茶素总量变化趋势一致。在1叶和2叶中下降,老叶中含量升高。非酯型儿茶素含量变化波动较大。在老叶中,激素处理与对照组差异不显著。IAA处理后,1叶中CHI、F3'5'H表达显著上升,PAL、CHS1、F3H、ANS的表达与对照比较呈显著下降;2叶中4CZ1、CHI表达显著上升,仅ANS呈显著下降趋势;老叶中PAL呈显著上升,C4H、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、LAR、ANRI、ANR2 呈显著下降趋势。2,4-D处理后,4CZ1和PAL表达有提高外,其它基因表达趋势与儿茶素含量趋势基本一致。ETH处理后,在1叶中,F3'5'H表达显著上升,而PAL、CHS1、CHS2、CHS3、F3H、DFR、ANS表达量显著下降。与对照相比2叶中除CHI显著下降外,其余基因均显著上升。老叶中,PAL、4CL1、CHI、ANS 表达显著上升,CHS1、CHS2、CHS3、F3H、F3 '5 'H、ANR1、ANR2表达呈下降趋势。ABA处理后,1叶中C4H、4CL1、4CL2、CHS1、CHS2、CHS3、CHI、F3'5'H、DFR、LAR、ANR2表达呈显著上升,仅AVS呈显著下降趋势。在2叶中,苯丙烷途径和类黄酮途径的基因表达均呈显著上升。在老叶中,除ANS外其他基因表达均显著下降。6-BA处理下,在1和2叶中,多数儿茶素合成相关基因表达呈显著上升,但也有例外,1叶中F3H和ANS表达差异不显著,2叶中CHI和F3H差异不显著。在老叶中,4CL2、CHS1、HHS2、CHS3、CHI、F3H、DFR、ANR1、ANR2呈显著下降趋势,其他基因差异不显著。采用qPCR检测外源激素处理下miRNA与靶基因的表达模式。miR156g-3p 与靶基因 F3H,miR2868 与靶基因 LAR,miR529d 和miR167a与靶基因CHI表达基本呈负相关,进一步证实miRNA在转录后水平对靶基因起着负调控作用,抑制其表达。DFR同时被miR5240、miR3444b和miR4380a调控。分析三条miRNA的表达模式发现,外源激素处理下三条miRNA表达趋势基本一致。说明miR5240、miR3444b 和 miR4380a 三条 miRNA 共同介导 DFR的转录后水平表达调控。miR7814与靶基因CHS表达并未完全呈负相关,原因可能是同一 miRNA靶向同一家族成员基因,其对不同成员的调控强弱存在差异,另一方面可能是受到多个调控因子调控。ANR、C4H受两条及以上miRNA的调控,miRNA与靶基因的表达并未呈负显著的调控模式。靶基因同时受多条miRNA的调控,不同发育成度叶片或外源激素的刺激时,可能会不启动不同的调控方式,如共同调控靶基因表达,或不同调控因子功能互补。6莽草酸途径3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶表达调控及功能研究儿茶素生物合成主要涉及的途径:莽草酸途径、苯丙烷途径、类黄酮合成途径。莽草酸途径是连接初级代谢和次生代谢的重要桥梁。3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶(DHD/SDH)是莽草酸中唯一的双功能酶。在获得的茶树miRNA序列的基础上,对本试验室克隆得到的茶树三条DHD/SDH进行miRNA预测和鉴定。获得了 4条miRNA参与裂解CsDHD/SDH。其中 miR5180b、miR1510b-5p 和 miR24 共同靶向CsDHD/SDH2,miR868-5p 作用于CsDHD/SDH3。同时对茶树中三条CsDHD/SDH表达模式进行了检测。不同激素处理下,CsDHD/SDH2 和 CsDHD/SDH3表达模式一致。CsDHD/SDH2 和CsDHD/SDH3的表达模式存在协同作用。CsDHD/SDH1与CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之间的表达存在负反馈调节,CsDHD/SDH1上调表达时会导致互补基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下调表达。为进一步分析茶树CsDHD/SDH功能,我们构建了茶树CsDHD/SDH1干扰载体,并转化至烟草中,获得了 T1代阳性转基因植株。通过荧光定量检测分析显示CsDHD/SDH1干扰载体表达后导致烟草自身NtDHD/SDH1表达下调,但促使烟草自身NtDHD/SDH2表达上调。同时T1代转基因烟草类黄酮含量降低。说明DHD/SDH1在植物的类黄酮的合成中具有重要作用。
李明军[4]2009年在《苹果和猕猴桃抗坏血酸形成与积累的生理和分子机理研究》文中研究表明抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA),又名维生素C(Vitamin C,Vc),是生物体内重要的抗氧化剂和许多酶的辅因子。植物体内的AsA不仅与自身生长发育和逆境的抗性密切相关,而且由于人类自身不能合成AsA,它又是人体重要的天然AsA来源,与人类的健康密切相关。目前,对AsA在作物可食部分积累机制及其AsA含量差异的原因尚不清楚。本文以低AsA含量的苹果(Malus domestica Borkh‘Gala’)和高AsA含量的猕猴桃(Actinidia deliciosa cv. Qinmei)为材料,从AsA的组织分配、生物合成、再生、运输及光调控等方面对AsA形成和积累机理进行了研究。获得的主要结果如下:1.从苹果果实中克隆获得了AsA再生酶MDHAR和DHAR2及合成酶GME和GalUR基因cDNA全长或部分序列。其中,MDHAR长1400 bp,包含了1305 bp的完整开放阅读框,编码一个膜结合MDHAR;DHAR2长933 bp,包含了798 bp的完整开放阅读框,属于GSH依赖性胞质DHAR;GME长1323 bp,包含了1131 bp的完整开放阅读框,序列分析发现其编码一个NAD依赖性胞质酶。而GalUR长668 bp,与草莓GalUR氨基酸同源性高达80%,为GalUR基因的cDNA部分序列。2.在‘嘎啦’苹果果实的果皮、果肉中检测到了AsA合成关键酶GalDH和GalLDH基因mRNA的表达和活性;通过不同AsA合成前体物饲喂发现,参与L-半乳糖途径的L-Gal和L-GL能引起果皮和果肉AsA含量的明显增加,D-GalUA也能引起果皮AsA含量的明显增加,且幼果的增加幅度高于成熟果。在果实的不同组织中,高AsA含量的果皮有高的AsA合成和再生酶基因的表达量和活性;果皮中AsA含量受光的调控,与阴面果皮相比,阳面果皮具有高的GalDH、GalLDH、GalUR及MDHAR、DHAR mRNA表达量和活性,而阳面和阴面果肉间则无明显差异。对苹果AsA运输的初步研究发现,在果实微管组织中存在大量AsA的积累,且在具有AsA合成能力的果柄和叶柄韧皮部及其卸载液中也存在大量AsA,但果柄施加外源AsA并不能引起果实AsA含量的增加。这表明在苹果中AsA可能能从叶片运输到果实,但在果实中不能很好的卸载从而在维管束中积累;或者这些组织中自身合成的AsA仅在果柄或叶柄中发挥它的抗氧化等功能,而与果实和叶片间AsA运输关系不大。这些结果表明生物合成是苹果AsA形成的主要原因。3.光直接影响苹果叶片和果皮中的AsA合成和代谢。在弱光条件下,苹果叶片和果皮中AsA合成酶GalDH和GalLDH mRNA表达量与活性及再生能力明显降低,AsA含量下降。果实或整个树体遮光后,果肉组织中GalDH和GalLDH转录水平及其活性和再生酶活性均无明显变化。果实遮光对果肉AsA水平无明显影响,但整个树体遮光20 d后果肉中T-AsA和AsA含量明显降低,且树冠底部内膛果实果肉的AsA含量也较低。这说明苹果果肉组织中AsA的合成和代谢能力不直接受光的调控,但光可通过影响叶片间接地对果肉中AsA含量起到调控作用。4.在苹果果实生长发育过程中,单位鲜重果实中T-AsA和AsA含量在花后0 d的子房中最高,之后随着生长发育逐渐下降,在花后60 d后至果实成熟基本保持不变。从单个果实中AsA的积累量来看,在整个果实生长发育过程中AsA积累一直在发生,即在单个果实中AsA合成速率一直大于DHA的降解速率。在果实生长发育过程中,AsA合成酶基因表达量表现出不同的变化模式。GME、GGP和GalUR mRNA表达量在果实生长发育过程中显著地增加与AsA含量的变化不一致,表明它们对AsA含量不起关键调控作用。GPP在果实发育过程中与单位鲜重中AsA含量的变化模式存在相似性。在幼果期果实高的GalDH和GalLDH mRNA表达量和酶活性与幼果期由L-Gal和L-GL合成AsA的能力相一致。在AsA再生系统中,MDHAR mRNA表达量和酶活性随果实的生长表现出明显的下降趋势,与AsA/DHA比值呈负相关。5.为了探索叶片AsA形成与调控和果实的异同点,研究了不同叶龄苹果叶片AsA形成及其与合成和再生的调控关系。结果表明,在不同叶龄的苹果叶片中,AsA的积累主要发生在幼叶向成熟叶的转变期,该时期叶片有高的AsA合成和再生能力,而衰老期AsA合成和再生能力下降,AsA含量降低。在AsA合成中,GPP的转录调控可能对苹果叶片AsA水平起着重要的调控作用,而GMP、GGP、GalLDH表达量的变化模式表明它们对AsA水平不具有调控功能。此外,GGP和GalUR在老叶中高的表达量可能与衰老有关。在再生系统中,MDHAR表达量和活性与苹果叶片中DHA含量相关,表明MDHAR可能在维持植物AsA氧化还原状态中起重要作用。而在AsA水平稳定的成熟叶中高的DHAR表达量和活性表明DHAR在维持AsA合成和氧化降解之间的平衡中可能起重要作用。6.从美味猕猴桃品种‘秦美’果实中克隆获得了MDHAR、DHAR2和GME基因cDNA部分序列及DHAR1和GPP基因的cDNA全长序列。其中,MDHAR长1019 bp,属于膜结合MDHAR基因的cDNA部分序列; DHAR1长821 bp,包含了639 bp的完整开放阅读框,而DHAR2长542 bp,包含5′端起始密码子ATG,分别与已报道的两种植物胞质DHAR有高度的同源性,均为GSH依赖性胞质DHAR;GME长846 bp,与其它植物GME基因氨基酸同源性多在90%以上,为美味猕猴桃GME基因的cDNA部分序列;GGP为1542 bp,包含1353 bp的完全开放阅读框,对其编码蛋白结构分析发现,它具有螺旋跨膜区,是一个膜结合蛋白。7.在美味猕猴桃品种‘秦美’果实中也检测到了AsA合成酶GalUR、GalDH和GalLDH mRNA表达及GalDH和GalLDH活性。不同AsA合成前体物饲喂发现,不仅参与L-半乳糖途径的L-Gal和L-GL能引起果实AsA含量的显著增加,而且L-GulL和D-GalUA也能引起AsA含量的明显增加,且幼果高于成熟果。这说明猕猴桃果实具有AsA合成能力,且可能存在多个途径。在果实的不同组织中,有高AsA合成和再生酶基因表达和活性的果肉及种子区有最高的AsA含量,而合成酶基因表达量和活性水平较低的中轴AsA含量很低。同时,猕猴桃果实AsA的分布也存在细胞特异性,果皮细胞中几乎观察不到AsA的存在;在果肉细胞中,大细胞不仅胞内有大量的AsA积累,而且在其细胞壁上也有AsA的存在;中轴细胞中AsA主要分布在细胞壁等质外体;维管束的导管细胞中也存在大量的AsA。对猕猴桃AsA运输能力的研究表明,果柄和叶柄中自身合成的AsA可能仅在果柄或叶柄中发挥抗氧化等功能,而与果实与叶片间AsA运输关系无关。但幼果期果柄施加外源蔗糖能引起幼果AsA含量的明显增加,表明猕猴桃果实中的AsA可能与叶片糖源的供应能力有关。这些结果也说明猕猴桃果实中AsA形成的主要原因是自身合成,同时叶片的糖源供应能力可能调控着幼果期果肉中AsA合成速率。8.猕猴桃果实套袋遮光不影响果实中AsA含量,但幼果中AsA水平明显受日变化的影响,清晨6:00比中午和下午的AsA含量明显低。在果实不同发育阶段树体遮光处理中,花后0-40 d间遮光能显著降低幼果中T-AsA和AsA含量,而花后40 d后遮光对AsA含量无明显影响。这表明光不直接影响猕猴桃果实中AsA含量,但能通过叶片影响幼果中AsA含量。猕猴桃树体遮光显著降低了叶片AsA合成和再生酶基因的表达量和活性,引起了AsA含量显著下降和DHA增加。尽管如此,花后0-40 d树体遮光也显著降低了花后40 d猕猴桃果实中AsA合成酶GalLDH、GalDH、GPP、GME和GalUR及再生酶MDHAR和DHAR mRNA表达量,并降低了GalLDH、GalDH、MDHAR和DHAR活性,幼果AsA含量和积累量下降,40 d后果实生长速率下降,果实变小。而花后40-120 d遮光虽引起了糖含量的显著下降,但对AsA含量、合成和再生无明显影响。这表明花后0-40 d树体遮光降低了猕猴桃幼果AsA合成能力。外源蔗糖对幼果AsA含量的增加表明花后0-40 d遮光处理对猕猴桃幼果AsA合成的影响可能与淀粉、可溶性总糖和蔗糖含量的明显降低有关。这些结果表明光不直接影响猕猴桃果实AsA含量和合成,但能通过影响叶片对果实的糖供应能力或其它信号调控幼果AsA合成和再生能力,间接调控着幼果中AsA含量和果实中AsA积累量,且这种对幼果AsA含量的影响可能与后期果实膨大有关。9.在猕猴桃果实生长发育过程中,单位鲜重果实中T-AsA和AsA含量在花后迅速增加,并在花后30 d达到最高,之后逐渐下降,在花后60 d后至果实成熟基本保持不变。从单个果实中AsA的积累量来看,T-AsA和AsA积累量在花后伴随果实的生长迅速增加,在花后45 d达到最高,之后至果实成熟期保持不变。这说明猕猴桃果实中AsA的积累主要发生在花后45 d前的幼果期。在果实生长发育过程中,GPP和GGP在转录水平上对果实AsA合成调控的可能性最大,特别是GPP,而从GalLDH、GalDH、GMP和GME转录水平的变化模式来看,它们对AsA合成调控的可能性很小。在AsA再生系统中,MDHAR和DHAR表达量及活性与幼果期AsA的快速积累关系不大。但45 d后高的表达和活性(尤其MDHAR)可能与AsA水平的维持有关。在碳水化合物中,可溶性总糖、还原糖和淀粉含量与AsA的变化模式均不存在相关性,但在花后45 d之前的幼果期蔗糖和淀粉的变化模式与AsA含量有着相似性,说明蔗糖可能与幼果期猕猴桃果实中AsA的合成有一定的关系。总之,苹果和猕猴桃果实中AsA形成的主要原因是自身的生物合成。与苹果相比,猕猴桃不仅有着高的AsA合成能力,还可能存在D-半乳糖醛酸等支路途径。叶片可通过影响糖源的供应或其它物质调控着果实中AsA的合成能力,进而不可逆的影响着果实中AsA含量和积累量。从整个果实中AsA积累模式来看,‘嘎啦’苹果在整个果实发育过程中均有AsA的积累发生,但积累速率低;猕猴桃果实中AsA积累主要发生在花后45 d前,之后至果实成熟基本维持不变,且在花后30 d前幼果中的AsA积累量明显大于果实变大对细胞中AsA的稀释作用,是猕猴桃高AsA积累的主要时期。从AsA水平的维持来看,虽然MDHAR和DHAR对苹果和猕猴桃果实AsA的积累量不起关键作用,但它们在维持AsA氧化还原状态及AsA合成和氧化降解的平衡中起着重要作用。与苹果相比,猕猴桃果实有显著高的MDHAR和DHAR活性,低的AsA氧化程度,这也是猕猴桃果实高AsA含量的另一原因。通过对苹果和猕猴桃果实发育过程中、不同叶龄的苹果叶片中及猕猴桃树体遮光下AsA合成和代谢酶基因转录水平与AsA含量和积累量的关系研究发现,在AsA合成的L-半乳糖途径中GPP的转录调控对AsA的合成与积累起着重要的调控作用,它可能是L-半乳糖途径合成AsA的关键调控基因。
蒋南[5]2017年在《单色光对鸡松果体和下丘脑生物钟昼夜节律系统的影响》文中研究说明禽类褪黑激素的分泌呈现昼低夜高的节律性。该节律性分泌受到体内生物钟系统的调控。松果体和下丘脑均属于禽类生物钟的主钟振荡器,二者既可以独立振荡又能够相互作用。生物钟振荡器的振荡依赖于一个由正调控钟基因(cClock、cBmalll及cBmall2)和负调控钟基因(cCry1、cCry2、cPer2及cPer3)组成的负反馈调节环路。前期研究显示单色绿光可以提高雏鸡血浆褪黑激素水平,但该作用的机制是否是通过影响鸡生物钟系统而进行调节的尚不清楚。因此,本研究选用刚出壳的AA肉鸡分别饲养于白(400-760nm)、红(660nm)、绿(560nm)、蓝(480nm)四种光色下,光照制度LD 12:12,并于第三日龄实施松果体摘除手术。饲养至第14日龄,每隔4小时,共6个时间点取松果体和下丘脑,研究不同单色光对鸡松果体和下丘脑生物钟昼夜节律系统的影响,探讨单色光影响松果体褪黑激素分泌的机制以及松果体褪黑激素在单色光对下丘脑生物钟昼夜振荡器影响中的作用。研究结果如下:1鸡松果体和下丘脑钟基因的昼夜节律表达鸡松果体和下丘脑正、负调控钟基因均表现出明显的昼夜节律性表达。除了cP rs基因,其他钟基因的表达均表现为白天升高、夜间降低的形式。在两个主钟中,cCrys和cPers钟基因表达相似,峰相位较为接近;但下丘脑cClock的振幅是松果体的两倍,而松果体cBBmals和cCry1的振幅约为下丘脑的两倍,松果体cClock、cBmas和cPer3的峰相位较下丘脑的延迟。2单色光对松果体生物钟昼夜系统的影响对钟基因昼夜表达的影响:不同单色光照射下,松果体钟基因依然维持明显的昼夜节律性表达,除了红光下cCry2的节律性较白光下明显降低(R2 = 0.243,P = 0.033)。绿光明显增加正调控钟基因的表达量,降低负调控钟基因的表达量;而红光则抑制了正调控钟基因的表达量,增加了负调控钟基因的表达量。与白光相比,绿光下正调控基因的中值和振幅均增加,负调控基因的中值和振幅则减小。在蓝光影响下,正调控钟基因的相位均较白光下发生延迟(0.2 h-0.8 h),负调控钟基因的相位均发生提前(0.1 h-1.5 h)。同时,绿光也明显增加了钟蛋白CLOCK和BMAL1的表达量。对褪黑激素昼夜含量的影响:绿光可以显著提高松果体cAana如基因表达的水平,同时绿光下血浆褪黑激素的含量也高出其他光组1.48%-30.93%(P = 0.000-0.655,ANOVA);而红光下褪黑激素的含量明显较其他光组低了 5.6%-23.4%(P=0.000-0.006,ANOVA)。不同光色下松果体cAanat和血浆褪黑激素均表现出明显的昼夜节律。同时,绿光下松果体cAanat和血浆褪黑激素昼夜振荡的中值和振幅均高于其他光色,而在红光下则均低于其他光组。对松果体视蛋白表达的影响:白光和绿光下,cOpnp的基因表达呈现昼高夜低的表达形式;而蓝光和红光下,cOpnp则呈现出白天低而夜间高的形式。红光下cOpnp的振幅明显下降且昼夜节律性消失(R2= 0.2,P = 0.425)。cOpn4-1基因的表达量呈现白天低夜间高的形式。比起其他光色,绿光下cOpn4-1的昼夜节律性和振幅明显增加。不同单色光下cOpn4-2均呈现白天高夜间低的昼夜节律性表达,其中蓝光下cOpn4-2节律性以及振幅明显降低。在单色光下cCreb的振荡均表现出明显的昼夜节律性。3单色光对下丘脑钟基因昼夜表达的影响不同光色下,下丘脑钟基因均呈现明显的昼夜节律性表达。绿光显著增加了钟基因cClodk、cBmal1以及cCry1的表达量,抑制了cBmal 和cCry2的表达;红光则降低了 cClock、cBmal1以及cCOy1的表达量,却明显增加了 cBBmal2和cCry2的表达量。就节律参数而言,cClock、cBmaal1以及cCry1的中值和振幅在绿光下最大,而cBmal2的中值和振幅在绿光下最小;在红光,cClock和cBmal1的中值和振幅均较白光和绿光小。同时,红光下钟基因峰相位的移动比绿光和蓝光更为明显。对钟蛋白的检测发现,绿光下CLOCK和BMAL1表达的变化与基因水平相类似。同时,钟蛋白CLOCK在下丘脑视交叉上核、前内侧核、室周核、室旁核及正中隆起中均有阳性表达。4松果体褪黑激素介导单色光对下丘脑钟基因表达的影响松果体摘除对血浆褪黑激素昼夜含量的影响:松摘后不同光色下鸡血浆褪黑激素水平与各自假手术组相比均明显下降,但依然保持明显的昼夜节律性;同时绿光下血浆褪黑激素水平仍然高出其他光色 7.0%-55.52%(P= 0.000-0.039,ANOVA)。松果体摘除对下丘脑钟基因表达的影响:随着松摘后褪黑激素水平的下降,在不同光色下下丘钟基因cClock和cPer2的振幅均较各自假手术组明显下降;而cBmal1的中值和振幅较假手术组相似,但红光下和蓝光下的相位分别较各自假手术组延迟2 h和提前2 h。红光下下丘脑cBmal2和cCry2的昼夜表达均失去了节律性。松摘后绿光下cCry1的表达量下降,而红光下表达量升高。松摘后红光下cPer3的表达量依然高于其他光组。同时,下丘脑钟蛋白CLOCK的定位仍然出现在下丘脑视觉视交叉上核、室周核以及室旁核。松果体摘除对下丘脑褪黑激素受体表达的影响:14日龄鸡下丘脑中褪黑激素受体cMel1a、cMel1b和cMel1c均呈现明显的昼夜节律性表达。松摘后三种受体的表达量较对照组和假手术组均分别显著降低 35.43%-37.98%(P= 0.000,AVONA)、12.55%-34.55%(P=0.000-0.032,AVONA)和4.39%-23.71%(P = 0.000-0.999,AVONA)。同时,松摘后三种受体的振幅较各自对照组和假手术组明显下降;cMel1b和cMel1c表达的昼夜节律性也随之消失。影响钟基因表达的褪黑激素受体途径:体外添加褪黑激素浓度250 pg/mL时,钟基因cClock的表达量显著高于未添加褪黑激素组45.63%-45.81%(P = 0.003-0.606,ANOVA)。当加入Mella/Mellb非特异性阻断剂Luzindole时,钟基因cClock:的表达量显著下降30.6%-31.4%(P=0.004-0.01,ANOVA);而在仅加入Mellb特异性受体阻断剂4P-PDOT的处理组中,钟基因cClock的表达量比仅添加褪黑激素刺激组的表达量显著低23.6%(P = 0.009,ANOVA);而当仅添加褪黑激素受体Mellc特异性受体阻断剂Prazosin时,钟基因cC/ock的表达量高于其他未加褪黑激素组 44.37%-47.6%(P= 0.002-0.009,ANOVA)。结论:七种核心钟基因在14日龄鸡松果体和下丘脑中的表达均存在明显的昼夜节律性。绿光可以通过影响cOpnp和cOpn4-1来增加松果体正调控钟基因的表达量并降低了负调控钟基因的表达,促进松果体褪黑激素关键合成酶cAanat的表达,从而增加血浆褪黑激素水平。同时,松果体摘除前后下丘脑钟蛋白CLOCK均出现在视觉视交叉上核、室旁核及室周核,单色光可以通过影响松果体褪黑激素的分泌,后者通过其受体Mella和Mellb调节下丘脑钟基因的昼夜节律表达。
曾钧[6]2000年在《肺纤维化大鼠模型中MCP-1 mRNA的表达与调控》文中研究指明背景:特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是令临床医生棘手的常见病之一,其详细的病理机制未明,也欠缺有效的治疗手段。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1)是近来发现的一种强效单核细胞趋化剂,它不仅具有特异的单核细胞趋化活性,也具有激活单核细胞的活性,而且对淋巴细胞和嗜碱性粒细胞同样有化学趋化作用,因而在机体防御、抗炎和抗肿瘤方面起着重要的作用。MCP-1与许多炎性疾病和自身免疫性疾病的关系非常密切,有望成为一种新的理想的药物作用靶标。各种炎性疾病的易发程度和好发部位以及感染程度是否与MCP-1的组织表达差异有关,目前已成为国内外研究热点之一;博莱霉素(Bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化大鼠体内MCP-1mRNA表达情况和调控研究,则至今仍未见报导。 目的:了解BLM诱导大鼠肺纤维化损伤过程中MCP-1mRNA的表达情况;观察脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、云芝多糖(Coriolusversicolor polysaccharides,CVP)和地塞米松(Dexamethasone,Dex)对MCP-1mRNA表达的影响,为临床上IPF疾病的治疗开拓新的药物治疗法提供理论基础。 方法:①大鼠通过腹腔注射不同剂量的LPS、IFN-γ、TNF-α、BLM和生理盐水后,在处理后0、4、6、8小时,用定量RT-PCR方法检测处理组和正常对照组MCP-1mRNA在多种组织的表达情况;②用抗癌药物BLM气管内滴注大鼠后,观察不同时间点(0天、6小时、1天、3天、7天)肺组织病理学变化并测定各时间点MCP-1mRNA表达量;③分别用LPS、CVP和Dex以不同剂量组处理第3天肺损伤大鼠,病理组织切片观察对照组和各处理组单核细胞聚集情况,用定量RT-PCR方法分别检测各组MCP-1mRNA的表达水平,并测定各组第7天肺纤维化组织羟脯氨酸含量。 结果:①MCP八 在正常对照组肝、肾、肺等多种组织中都有 基础表达:us能诱导肝和肺组织*C卜IInRNA的强烈表达③0刀1), 肾诱导程度次之O吻刀1),其它组织包括脊髓、心、皮肤、小肠与正常 对照组无显著差别;②LPS诱导肝和肺中MCP-IInRNA表达的时间曲 线显示:注射LPS后4小时诱导达到高峰,随时间延长,诱导快速下 降,至第8小时,表达水平仍高于正常对照组。@BLM、IFN4和hF- Q均能诱导肝和肺中 MCP-IInRNA表达,但较LPS诱导程度弱;④BLM 气管内滴注1至3天引起大鼠肺组织早期典型的炎症变化过程(肺出血、 水肿、肺胞腔和肺泡隔炎性细胞的聚集或者肺泡壁增厚等),至第7天, 肺纤维化初步形成;MCP-lmRNA表达的时间曲线显示,滴注后第 6 小时表达即开始增强,第3天诱导达到最高峰,其后逐渐下降,至第7 天表达水平仍高于假手术组。⑤BLM气管内滴注大鼠第3天(对照组), 肺损伤组织MCP1 表达水平(.47土0.38)显著高于假手术组O.30 士0.25*P<0刀1X而u8引起了肺损伤组织**卜lmRNA表达水平*.54 土0.43)的明显升高o<0刀1h③CVP和DCX都抑制了肺损伤大鼠肺组织 MCP1 表达,并呈明显的的量-效关系庐量依赖性卜 相关系数 分别为心.990和心.961,而且炎性细胞(单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒 细胞)聚集数目减少O功刀1),两处理组病理损害程度明显减轻;与对照 组(.47i0.38湘比,CVP处理组(中剂量)MCP-IlllltrvA的表达水平(1.77 土0.32)和Dex处理组(中剂量)MCP4 的表达水平*.97上0.36)均 有统计学差异o叼刀1卜①肺纤维化大鼠肺组织(对照组)羟脯氨酸含量 O.25土 0.27mg/g)与假手术组*刀9士 0刀3mg/g)相比,有统计学意义 (P<0*1):**P组和**互组羟脯氨酸含量(1.93土0.24m令g、1.77土0.36my幻 与对照组相比均有显著差别o<队01),而*Ps组o.59土0二om令功则无统 计学意义。 结论:①MCP-1是LPS介导炎症反应的重要介质,LPS诱导器官损 伤程度可能在肝、肺和肾三种器官中较历害。②MCP刁参与了BLM诱 导大鼠肺纤维化损伤过程。③CVP和Dex均可抑制肺损伤组织MCPI 的 产生,可能通过抑制其转录而产生作用。④CVP和Dex通过抑制MCP- IInRNA的表达,对 BLM诱导的肺纤维化损伤起明显防护作用。
王菲[7]2012年在《hTERT pre-mRNA选择性剪接在调控胶质瘤端粒酶活性中作用的研究》文中研究说明研究目的:端粒是控制细胞增殖与衰老凋亡的生物钟,分化成熟的正常人体细胞不表达端粒酶,因次端粒随细胞分离次数增加逐渐缩短。端粒酶异常再表达及活化与细胞恶性转化密切相关,约90%以上恶性肿瘤有端粒酶再表达及活化。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是人端粒酶的催化亚单位及决定其活性的关键因素。hTERT对端粒酶活性的调控分为转录水平调控和hTERT pre-mRNA选择性剪接调控,即转录后水平调控。α和β两个位点的缺失是目前hTERT pre-mRNA剪接调控中研究较多的位点。hTERT pre-mRNA序列上存在着外显子剪接增强子(ESE)序列,反义寡核苷酸与之相结合可诱导外显子跳跃,改变选择性剪接模式。本研究应用反义寡核苷酸与hTERT pre-mRNA中的外显子剪接增强子结合,调控其剪接模式,减少全长型hTERT mRNA的表达,抑制端粒酶活性,从而影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。旨在探讨hTERT pre-mRNA的选择性剪接对端粒酶活性的调节作用,为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据。研究方法:第一部分:以胶质瘤细胞系和胶质瘤组织标本为研究对象,采用RT-PCR方法检测hTERT选择性剪接变异体,用TRAP方法检测端粒酶活性,分析hTERT选择性剪接变异体和端粒酶活性的关系。第二部分:应用ESEfinder3.0软件分析hTERT pre-mRNA序列上外显子剪接增强子(ESE)的位点,特别是对外显子5~外显子9之间的序列进行预测分析,以获得分值较高,即ESE概率较大的位点。根据ESE序列设计并合成与其互补的反义寡核苷酸,将其转染U251胶质瘤细胞,探讨不同化学修饰结构对胶质瘤细胞端粒酶活性及端粒长度的影响。第三部分:应用TRAP法、TRF法检测经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的端粒酶活性及端粒长度;应用MTT法、平板克隆形成实验、PI染色细胞周期测定、单细胞凝胶电泳、DNALadder实验、Annexin V/PI双染色细胞凋亡检测法、2DMatrigel实验、3DMatrigel实验、Transwell实验等,分析经反义寡核苷酸长时程处理后U251细胞的增殖、凋亡和侵袭能力的变化;应用Western blot技术检测与肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达变化情况;观察经反义寡核苷酸长时程处理后U87细胞干细胞神经球的形成情况,及用TRAP法、TRF法检测U87干细胞的端粒酶活性及端粒长度。结果:第一部分:胶质瘤组织中及胶质瘤细胞系内均存在hTERT选择性剪接变异体表达。端粒酶活性和全长型hTERTmRNA表达相对量存在相关性,而总hTERT mRNA与端粒酶活性无相关性。第二部分:设计合成的2'-氧-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸可调节hTERT pre-mRNA的剪接作用,产生外显子跳跃;使hTERT外外显子7和外显子8丢失,减少了全长型hTERT mRNA的表达,而增加了 β缺失型hTERT mRNA的表达;降低了 U251胶质瘤细胞的端粒酶活性。第三部分:经反义寡核苷酸长时程处理的U251细胞端粒酶活性降低,端粒长度缩短,增殖活性受到抑制,细胞凋亡显著增加,侵袭能力明显减弱,肿瘤细胞恶性表型相关的蛋白表达明显下调;经反义寡核苷酸长时程处理的U87细胞干细胞神经球形成不良,干细胞的端粒酶活性降低,端粒长度缩短。结论:1.hTERT pre-mRNA存在选择性剪接现象,可生成多种剪接变异体。总hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性并不是一一对应的关系,只有全长型hTERT蛋白具有促端粒酶活性。2.hTERT pre-mRNA序列上存在ESE位点,与之互补的2'-氧甲基硫代磷酸酯反义寡核苷酸可调控hTERT pre-mRNA选择性剪接模式,介导hTERT pre-mRNA外显子跳跃,减少全长型hTERT mRNA的表达,增加β缺失型hTERT mRNA的表达,从而抑制胶质瘤细胞的端粒酶活性。3.反义寡核苷酸通过改变hTERT pre-mRNA的选择性剪接模式抑制端粒酶活性,缩短端粒长度,使细胞增殖能力减弱,使肿瘤细胞凋亡明显,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。使胶质瘤干细胞的增殖能力减弱,端粒酶活性降低、端粒长度变短。4.本研究可为新一代端粒酶抑制剂研发提供新思路及参考依据,为胶质瘤基因治疗提供新的靶点及重要线索,可能成为将来胶质瘤治疗的有效策略之一。
张莹[8]2016年在《自然放牧与放牧补饲育肥对呼伦贝尔羔羊与呼杜杂一代羔羊脂肪与蛋白质代谢的影响》文中进行了进一步梳理本论文研究了呼伦贝尔羔羊(HL)与呼杜杂一代羔羊(HZ)在自然放牧(NG)与放牧补饲(GS)两种不同育肥方式下脂肪酸(FA)和氨基酸(AA)组成存在的差异,并从脂类和蛋白质代谢相关的血液和组织生化指标、相关基因和蛋白质表达及其与日粮组成的关系角度,探讨其存在差异的主要原因,寻找可能影响羊肉FA和AA组成的关键因素,为通过日粮对羊肉的品质和风味进行调控进而提高羊肉质量提供理论依据。采用2x2完全随机试验设计,选择体重、体型与体况接近的健康4月龄断奶HL和HZ公羔各60只,随机分成4组,每组30只。其中,因素一分为NG和GS两种育肥方式,因素二为2个品种,分别为HL和HZ。育肥试验分为育肥前期(1-30d)和育肥后期(31-60d)两个阶段。NG组在天然草场进行自然放牧(8-10月份)。GS组在自然放牧的基础上每天补饲精料补充料,补饲期分为前、后2期,共2个月。论文分6个试验,试验1比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊日粮FA与AA组成的差异。试验2和试验3比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊羊肉FA和AA含量与组成的差异,探讨了育肥方式和品种对肉羊肉品质的影响。试验4比较研究了不同育肥方式下HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢有关的血液生化指标及组织酶活的变化规律,探讨了育肥方式和品种对肉羊脂肪和蛋白质代谢的影响。试验5和试验6研究了不同育肥方式对HL和HZ羔羊脂肪和蛋白质代谢相关基因和蛋白质表达的影响,进一步从基因转录、蛋白翻译、Wnt信号通路和mTOR信号通路探讨了其可能的影响机理。在本试验条件下初步得出以下结果:从日粮FA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮SFA含量及其进食量较高,其中主要是C16:0和C18:0,其次是C17:0;MUFA含量及其进食量较高,主要是C18:1c9,其次是C15:1;ω-6PUFA含量及其进食量较高,主要是C18:2c6,其次是C18:2t6;NG组日粮co-3PUFA含量及其进食量较高,主要是C18:3n3,其次是C20:5n3。从日粮AA组成及其进食量分析,与NG组相比,GS组日粮EAA含量及其进食量较高,其中主要是Leu,其次是Phe和Lys;NEAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Asp;BCAA含量及其进食量较高,主要是Leu,其次是Ile和Val;FAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Leu和Arg;DAA含量及其进食量较高,主要是Glu,其次是Met和Asp;LAA含量及其进食量较高,主要是Met,其次是Lys。与NG组相比,GS组多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,其中主要是C18:0,其次是C14:0和C24:0;MUFA含量较高,主要是C18:1c9,其次是C17:1;ω-6PUFA含量较高,主要是C18:2n-6c,其次是C18:3n-6;NG组肌肉和脂肪组织中co-3PUFA含量较高,主要是C18:3n-3,其次是C20:5n-3。HZ羔羊多数肌肉和脂肪组织中SFA含量较高,主要是C16:0和C18:0,其次是C24:0;MUFA含量较高,主要是C18:ln-9c。与GS组相比,NG组血浆和肌肉组织中EAA、NEAA和BCAA含量升高;与HL相比,HZ血浆和肌肉组织中EAA、NEAA、TAA、FAA、LAA和DAA含量均有升高的趋势。与GS组相比,NG组血清中与脂肪和蛋白质分解相关的T3/T4、GH、Leptin和TNFa含量显著升高,血清中TP、TG和LDL-C含量显著降低,血清和组织中与FA分解相关的HSL酶活及与蛋白质代谢相关的BCAT2和BCKD酶活显著升高;血清中与脂肪和蛋白质合成相关的INS含量显著降低,血清和组织中与FA合成相关的FAS和ACC酶活显著降低。与HL相比,HZ血清中T3/T4、PG、NEFA含量和HSL酶活显著降低,但IGF-1、TG、HDL-C含量和ACC酶活显著升高。GS组肌肉、脂肪和肝脏组织中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于NG组,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组;HZ中与脂肪合成相关的ADD1、FAS, ACC和DGAT1 mRNA表达量高于HL羔羊,但与脂肪分解相关的HSL mRNA表达量低于NG组。与GS组相比,NG组Wnt信号通路中PPARγ mRNA表达量显著升高,但β-catenin mRNA表达量呈现相反的规律。与HZ相比,HL中PPARy和C/EBPα mRNA表达量显著降低,但β-catenin mRNA表达量显著升高。Wnt信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。与GS组相比,NG组与蛋白质合成正相关的mTORC1, S6K1和eIF-4G mRNA表达量显著降低,与蛋白质合成负相关的4EB-P1mKNA表达量显著升高;与HL相比,HZ组织中mTORCl、S6K1和eIF-4G mRNA表达量显著升高,而4E-BP1mRNA表达量显著降低。mTOR信号通路中蛋白表达的规律基本与基因转录规律相一致。综合上述研究结果得出,从脂肪酸营养角度分析,NG组肌肉和脂肪组织的肉品质优于GS组,HL肌肉和脂肪组织的肉品质优于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的FA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮PUFA含量降低,提高了组织中与FA从头合成相关的FAS, ACC和PPARy mRNA表达量,进而提高了从头合成酶ACC、FAS及SCD的活性及血清中INS和IGF-1含量,导致体组织中SFA和MUFA含量的增加;日粮中C18:2n6和C18:3n-3含量是导致体组织相应FA差异的主要原因,进而引起肉品质发生改变。从蛋白质营养角度分析,NG组肌肉的蛋白质营养价值低于GS组,HL肌肉的蛋白质营养价值低于HZ羔羊。引起其差异的主要原因是日粮的AA含量与组成不同,与自然放牧相比,放牧补饲日粮中Leu含量较高,提高了血清中INS和IGF-1含量,激活了mTOR信号通路,提高了mTORCl、S6K1、4EB-P1 mRNA及其磷酸化蛋白的表达量,进而促进了蛋白质合成;降低了BCAT1和BCKD酶活,提高了肌肉中BCAA的含量,进而导致肌肉的营养价值发生变化。
李丹[9]2014年在《HMGA2在Wnt/β-catenin信号通路介导的散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的作用》文中研究表明大肠腺瘤是一种临床较常见的具有癌变潜能的大肠良性病变,其组织学类型以管状腺瘤最为常见。研究表明,大肠腺瘤被认为是大肠癌主要的癌前病变,80%以上的大肠癌是发生在先存的腺瘤基础上。“正常大肠上皮-腺瘤-腺癌”的发病路径已被公认为是经典的大肠癌发病过程。但是大肠腺瘤癌变是一个多基因改变、多阶段综合作用累积的复杂过程,其确切机制仍不明确。因此对大肠腺瘤癌变机制的研究对于大肠癌的预防具有重要意义。Wnt/β-catenin是经典Wnt信号通路途径,在胚胎发育及多种肿瘤的发生、发展过程起着重要的作用。目前,已经公认Wnt/β-catenin信号通路是大肠腺瘤癌变过程中的关键信号通路之一,该通路的异常激活可以介导大肠腺瘤的癌变。分泌性Wnt蛋白是该途径的启动因子,其中Wnt2和Wnt5a主要在胃肠道肿瘤中表达。当细胞受到损伤因素的作用后,Wnt信号结合到卷曲蛋白胞外区,将胞质中Dsh蛋白募集至胞膜下,使Dsh活化从而抑制由Axin、APC和GSK-3β组成的复合物活性,导致β-catenin不能被GSK-3β磷酸化,进而导致β-catenin不能被降解,致使大量游离的β-catenin聚集在胞质中,随后进入胞核与转录因子TCF/LEF结合,激活其转录活性,启动一系列下游靶分子如c-myc、CDK4、CyclinD1、VEGF等,从而促进肿瘤发生。β-catenin是Wnt信号通路的核心分子,信号通路激活的关键在于β-catenin在细胞质中累积以及其与转录因子TCF/LEF的结合。Wnt、β-catenin、CDK4、CyclinD1是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成成分,它们参与调节细胞增殖、抑制细胞分化及调控细胞周期,起着重要作用。高迁移率蛋白(HMGA2)是一种构架转录因子,普遍存在于真核生物中,其自身缺乏转录活性,但含有三个特殊的AT钩结构,这些AT钩结构可以结合到富集AT序列的染色质上,改变基因的DNA构象,或者直接与相关蛋白发生作用,继而增强或者抑制这些基因的转录活性,从而影响胚胎形成、组织发育,引起肿瘤的发生。HMGA2在分化成熟组织中很少表达或几乎不表达,而在胚胎期以及不成熟组织中大量表达。近年来大量研究发现,HMGA2在多种恶性肿瘤组织中出现异常表达,如肺癌、白血病、卵巢癌、大肠癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌等,这些肿瘤的发生、发展均与HMGA2基因异常表达有关,被认为是一个潜在的肿瘤分子标志物。但目前有关HMGA2在在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中所起的确切作用及机制,尚缺乏系统性地研究。研究已经发现,HMGA2与TCFs家族中的TCF/LEF有一定的相似结构域,即含有HMG的DNA结合域,它能够增强β-catenin与TCF/LEF结合的转录活性,与Wnt/β-catenin信号通路关系密切。有研究表明HMGA2在转基因小鼠乳腺癌中可能受Wnt10b/β-catenin信号通路调控而影响肿瘤的增殖;在胃癌中HMGA2的异常表达可能会激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进EMT的进程。二者之间可能存在相互调控的作用。因此,鉴于Wnt/β-catenin信号通路在大肠腺瘤癌变中的重要作用以及HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路之间可能存在的相互调控作用,使得我们思考一个问题:HMGA2和Wnt/β-catenin信号通路是否共同参与调控散发性大肠管状腺瘤的癌变以及它们之间发挥怎样的调控作用,目前国内外尚未见相关报道。本实验第一部分首先选取大肠癌细胞株,采用siRNA技术、Realtime-PCR及Western blot方法,探讨HMGA2与经典Wnt/β-catenin信号通路在人大肠癌细胞中发挥怎样的调控作用;接着第二部分利用免疫组织化学方法,进一步在组织学上分析HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1)在大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系,深入揭示散发性大肠管状腺瘤癌变的发生机制,为大肠管状腺瘤癌变的早期预防和临床靶向治疗提供科学依据。第一部分大肠癌细胞中HMGA2对Wnt/β-catenin信号通路调控作用的研究目的:在细胞水平上探讨HMGA2与经典Wnt/β-catenin信号通路之间发挥怎样的调控作用方法:1细胞培养选择三株人类结肠癌细胞株(HCT116、HT-29和SW480)进行体外培养。HCT116和HT-29细胞用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基培养;SW480细胞用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的L-15培养基培养。细胞呈贴壁生长。2siRNA实验靶细胞的筛选HCT116、HT-29和SW480细胞分别于对数生长期时给予0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,收集细胞。应用Real time-PCR及Western blot技术分别对三株人类结肠癌细胞中HMGA2的表达进行了检测,筛选高表达HMGA2的细胞株作为后续研究的靶细胞。3siRNA转染分别构建针对人HMGA2、Wnt2、β-catenin基因的siRNA序列,瞬时转染人结肠癌细胞株HCT116,同时转染Negtive control siRNA(NCsiRNA)作为阴性对照。分别检测HMGA2基因沉默后对Wnt/β-catenin信号通路的影响以及Wnt2或β-catenin基因沉默后对HMGA2的影响。4蛋白免疫印记(Western blot)转染处理HCT116细胞48h后,提取细胞总蛋白,用蛋白免疫印迹方法,检测转染处理后人结肠癌细胞株HCT116中HMGA2及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达情况,采用Odyssey仪器进行显色分析,Bio-LD图像分析系统进行定量分析。5Real time-PCR转染处理HCT116细胞48h后,应用Real time-PCR检测HCT116细胞中HMGA2及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的mRNA水平,采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct (ΔΔCt)方法计算,计算目的基因的相对表达量。6统计学分析应用SPSS Statistics17.0软件,计量资料以均数±标准差(x s)表示,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果:1筛选高表达HMGA2的人结肠癌细胞株对三株人结肠癌细胞中HMGA2mRNA及蛋白表达情况进行检测,结果发现HCT116、SW480和HT-29这三株细胞均表达HMGA2,但HCT116细胞HMGA2表达水平最高。因此,选择HCT116细胞作为本实验的研究对象。2siRNA干扰效率的检测2.1HMGA2siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞,检测HMGA2siRNA的干扰效率。Real-time PCR结果显示,与NC siRNA对照组相比,HMGA2mRNA的表达在HCT116细胞HMGA2siRNA转染组中降低了78%。Western blot结果同样表明,HMGA2蛋白的表达在HMGA2siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用HMGA2siRNA序列可以有效干扰HMGA2的表达。2.2Wnt2siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞,检测Wnt2siRNA的干扰效率。Real-timePCR结果显示,与NC siRNA对照组相比,Wnt2mRNA的表达在HCT116细胞Wnt2siRNA转染组中降低了75%。Western blot结果同样表明,Wnt2蛋白的表达在Wnt2siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用Wnt2siRNA序列可以有效干扰Wnt2的表达。2.3β-catenin siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞,检测β-catenin siRNA的干扰效率。Real-time PCR结果显示,与NC siRNA对照组相比,β-catenin mRNA的表达在HCT116细胞β-catenin siRNA转染组中降低了79%。Western blot结果同样表明,β-catenin蛋白的表达在β-catenin siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用β-catenin siRNA序列可以有效干扰β-catenin的表达。3HMGA2对体外培养HCT116细胞Wnt/β-catenin信号通路表达的影响3.1HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞Wnt2表达的影响于转染48小时后收集细胞,检测HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内Wnt2的影响。RT-PCR和Western blot结果显示,与NCsiRNA对照组相比,Wnt2mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2siRNA转染组没有明显变化(P>0.05);提示HMGA2不参与调控Wnt2的表达。3.2HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞β-catenin表达的影响于转染48小时后收集细胞,检测HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内β-catenin的影响。RT-PCR和Western blot结果显示,β-catenin mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2转染组低于阴性对照组(P<0.05);提示HMGA2可以调控β-catenin的表达。4Wnt/β-catenin信号通路对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响4.1Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响于转染48小时后收集细胞,检测Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内HMGA2的影响。RT-PCR和Western blot结果显示,Wnt2siRNA转染组中HMGA2mRNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组明显降低(P<0.05);提示Wnt2可以调控HMGA2的表达。4.2β-catenin siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响于转染48小时后收集细胞,检测β-catenin siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响。RT-PCR和Western blot结果显示,β-catenin siRNA转染组中HMGA2mRNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组明显降低(P<0.05);提示β-catenin可以调控HMGA2的表达。5HMGA2siRNA或Wnt/β-catenin siRNA干扰对信号通路相关因子的影响5.1HMGA2siRNA或Wnt2siRNA干扰对信号通路关键分子β-catenin的影响程度于转染48小时后收集细胞,检测HMGA2siRNA或Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内β-catenin的影响程度。RT-PCR和Westernblot结果显示,与NC siRNA对照组相比,β-catenin mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2或Wnt2转染组均有所降低(P<0.05),但在HMGA2转染组明显降低(P<0.05);提示HMGA2或Wnt2均可以调控β-catenin的表达,但HMGA2起主要调控作用。5.2HMGA2siRNA、Wnt2siRNA或β-catenin siRNA干扰对信号通路下游分子CDK4及CyclinD1表达的影响程度于转染48小时后收集细胞,检测HMGA2siRNA、Wnt2siRNA或β-catenin siRNA干扰对对信号通路下游分子CDK4及CyclinD1的影响程度。RT-PCR和Western blot结果显示,与NC siRNA对照组相比,CDK4、CyclinD1mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2、、Wnt2、或β-catenin转染组均有所降低(P<0.05),但在HMGA2转染组明显降低(P<0.05);提示HMGA2、、Wnt2、或β-catenin均可以调控CDK4、CyclinD1的表达,但HMGA2起主要调控作用。第二部分HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系目的:在组织学方面分析HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1)在大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系。方法:1采用免疫组织化学SP三步法,研究37例正常大肠黏膜、121例散发性大肠管状腺瘤伴上皮异型增生病例、96例大肠管状腺瘤癌变病例中HMGA2、Wnt2、β-catenin、CDK4及CyclinD1蛋白的表达情况,探讨HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路的关系,并结合临床病理特征进行关联分析。2统计学分析:应用SPSS Statistics17.0软件,数据分析采用单因素方差分析、χ2检验、wilcoxon符号秩和检验及spearman相关性分析,P<0.05时其差异有统计学意义。结果:1HMGA2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况及其与临床病理特征关系1.1HMGA2蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示,HMGA2蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高,分别是0.00%(0/37)、37.19%(45/121)、77.08%(74/96),其中管状腺瘤伴不同程度异型增生组和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组(P<0.05),而且管状腺瘤癌变组明显高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组(P<0.05)。HMGA2的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组分别为17.39%(8/46)、38.64%(17/44)、70.97%(22/31),其中中、重度异型增生组高于轻度异型增生组(P<0.05),重度异型增生组高于中度异型增生组(P<0.05)。1.2HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系1.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中HMGA2蛋白的阳性表达率与腺瘤分级密切相关(χ2=22.379,P<0.05);而与患者年龄、性别、腺瘤大小、腺瘤发生部位无关(P>0.05)。1.2.2管状腺瘤癌变组中HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中HMGA2蛋白阳性表达率与淋巴结转移及TNM分期密切相关(χ2=13.225及χ2=4.657;均P<0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位以及浸润深度无关(P>0.05)。2Wnt2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系2.1Wnt2蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示,Wnt2蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高,分别是5.40%(2/37)、43.80%(53/121)、90.63%(87/96),其中管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组(P<0.05),而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组(P<0.05)。Wnt2的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高,分别为32.61%(15/46)、38.64%(17/44)、67.74%(21/31),但各组之间无明显差别(P>0.05)。2.2Wnt2蛋白的表达与临床病理特征关系2.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中Wnt2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中Wnt2蛋白的阳性表达率与患者年龄、性别、腺瘤大小、腺瘤发生部位及腺瘤分级均无关(P>0.05)。2.2.2管状腺瘤癌变组中Wnt2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中Wnt2蛋白阳性表达率与浸润深度、Dukes分期密切相关(χ2=10.965及χ2=13.574;均P<0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位及淋巴结转移无关(P>0.05)。3β-catenin在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况与临床病理特征关系3.1β-catenin蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示,β-catenin蛋白的阳性表达位于细胞膜、细胞浆及细胞核,37例正常大肠黏膜组阳性表达全部位于细胞膜上,为正常表达。β-catenin蛋白随着腺瘤异型增生以及癌变的出现其细胞浆和细胞核异常表达率逐渐升高,其中正常大肠黏膜组、管状腺瘤异型增生组以及管状腺瘤癌变组中的异常表达率分别是0.00%(0/37)、50.41%(61/121)、90.63%(87/96);管状腺瘤异型增生组和管状腺瘤癌变组中β-catenin的异常表达率明显高于正常大肠黏膜组(P<0.05),而且管状腺瘤癌变组中β-catenin的异常表达率明显高于管状腺瘤异型增生组(P<0.05)。大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中β-catenin的异常表达率分别为21.74%(10/46)、52.27%(23/44)、90.32%(28/31),其中中、重度异型增生组中β-catenin的异常表达率明显高于轻度异型增生组及正常大肠黏膜组(P<0.05),重度异型增生组β-catenin蛋白异常表达率明显高于中度异型增生组(P<0.05)。β-catenin的异常表达率随着腺瘤异型增生程度的升高其阳性率逐渐升高(P<0.05)。3.2β-catenin蛋白的表达与临床病理特征关系3.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中β-catenin蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中β-catenin蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关(χ2=34.942,P<0.05);而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关(P>0.05)。3.2.2管状腺瘤癌变组中β-catenin蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中β-catenin蛋白的异常表达率淋巴结转移和浸润深度密切相关(χ2=11.190及χ2=6.374;均P<0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位及Dukes分期无关(P>0.05)。4CDK4在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系4.1CDK4蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示,CDK4蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高,分别是8.10%(3/37)、41.32%(50/121)、88.54%(85/96),其中管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组(P<0.05),而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组(P<0.05)。CDK4的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高,分别为15.22%(7/46)、36.36%(16/44)、87.10%(27/31),其中中、重度异型增生组明显高于轻度异型增生组(P<0.05),重度异型增生组高于中度异型增生组(P<0.05)。4.2CDK4蛋白的表达与临床病理特征关系4.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CDK4蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CDK4蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关(χ2=43.791,P<0.05);而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关(P>0.05)。4.2.2管状腺瘤癌变组中CDK4蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中CDK4蛋白阳性表达率与淋巴结转移、Dukes分期及浸润深度密切相关(χ2=15.638、χ2=6.269及χ2=5.998;均P<0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤发生部位无关(P>0.05)。5CyclinD1在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系5.1CyclinD1蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示,CyclinD1蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高,分别是18.92%(7/37)、53.72%(65/121)、92.71%(89/96),其中管状腺瘤伴不同程度异型增生组及管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组,而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组(P<0.05)。CyclinD1的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高,分别为21.74%(10/46)、59.09%(26/44)、93.54%(29/31),其中中、重度异型增生组明显高于轻度异型增生组(P<0.05),重度异型增生组高于中度异型增生组(P<0.05)。5.2CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征关系5.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CyclinD1蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关(χ2=39.214,P<0.05);而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关(P>0.05)。5.2.2管状腺瘤癌变组中CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中CyclinD1蛋白阳性表达率与淋巴结转移、Dukes分期及浸润深度密切相关(χ2=15.638、χ2=6.269及χ2=5.998;均P <0.05);而与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤发生部位均无关(P>0.05)。6在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中,HMGA2与Wnt2/β-catenin信号转导通路相关蛋白(Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1)关联性分析相关分析结果显示,在散发性大肠管状腺瘤伴异型增生组及腺瘤癌变组中HMGA2与Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1均呈正性相关(r=0.285,r=0.414,r=0.229,r=0.215,均P<0.05)。结论:第一部分:1沉默Wnt2或β-catenin均可抑制HMGA2的表达,而沉默β-catenin更能有效的抑制HMGA2的表达,提示Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin可能对HMGA2起主要调控作用。2HMGA2可以参与调控β-catenin及其下游分子,提示HMGA2与β-catenin之间存在相互调控。第二部分:1HMGA2可能参与了散发性大肠管状腺瘤癌变的发生,并且其表达水平与淋巴结转移及TNM分期密切相关。2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中,HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路可能发挥协同作用。
赵磊[10]2014年在《黑线仓鼠RFRP-3克隆及其对繁殖的调控机制研究》文中研究指明我国农田鼠害问题严重,给农业生产造成了极大困扰;并且害鼠能传播疾病,对人类生存也是一个严重威胁。因此鼠害治理工作的开展显得尤为必要,其成功防治将具有重要且深远的意义。黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是我国农田的主要鼠种,繁殖力强且危害严重,并具有季节性暴发的特点。本研究旨在通过检测黑线仓鼠繁殖候选基因RFRP-3在中枢组织及外周组织的表达模式,期望揭示黑线仓鼠繁殖的内在分子调控机制,为进一步深入阐明黑线仓鼠种群动态年际波动机理提供理论依据。研究选取黑线仓鼠为实验材料,采用RT-PCR技术克隆了繁殖相关基因RFRP cDNA序列;利用实时荧光定量PCR技术检测了RFRP mRNA在黑线仓鼠成体不同组织的表达情况;并在此基础上对两个重要的通路节点基因RFRP和GnRH在不同发育时期、不同发情时期及不同季节繁殖轴组织中的表达水平进行了研究,获得如下结果:1、克隆获得黑线仓鼠RFRP基因cDNA共643bp,包括570bp的ORF,共编码SPAPANKVPHSAANLPLRF-NH2(黑线仓鼠RFRP-1)和TLSRVPSLPQRF-NH2(黑线仓鼠RFRP-3)两种RF酰胺相关肽(RFRPs)序列。RFRP基因序列生物信息学分析显示,RFRP是一种跨膜蛋白,且其结构在进化过程中相对保守,预示了RFRP具有保守且重要的生物学功能。2、RFRP mRNA在黑线仓鼠表达较为广泛,下丘脑、子宫、卵巢、睾丸组织中均有RFRP mRNA表达,提示RFRP-3功能的多样性,且RFRP mRNA在下丘脑的表达量极显著高于其他组织(P<0.05),提示RFRP-3的作用可能主要通过脑内机制实现。3、黑线仓鼠不同发育时期、不同发情时期RFRP mRNA的表达量存在显著差异,呈现出以中枢组织(下丘脑)表达为主、外周组织(卵巢、子宫、睾丸)表达为辅的特点。与雌性老体相比,雌性成体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著降低(P<0.05);与雄性亚成体和老体相比,雄性成体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。结果表明RFRP mRNA在雌性黑线仓鼠的表达与RFRP-3抑制生殖的功能相一致,RFRPmRNA在雄性个体的表达与RFRP-3抑制生殖的功能不完全一致。同时RFRP mRNA在雌性成体发情期的表达量显著低于成体其他发情时期(P<0.05),这一结果也进一步表明了RFRP-3可能抑制雌性黑线仓鼠的生殖。4、四季黑线仓鼠下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著高于外周性腺组织(P<0.05)。与春季、秋季和冬季的雌性个体相比,夏季雌性个体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05);与春季、夏季和秋季的雄性个体相比,冬季雄性个体下丘脑中RFRP mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。结果提示在不同季节RFRP mRNA的表达可能受到光周期的影响,并且光周期对RFRP-3的调控机制可能存在性别差异。同时,研究发现血清中MT与RFRP-3浓度的变化表现出了一致性,表明RFRP-3的合成分泌可能依赖于体内光信号MT的释放,并且RFRP-3可能受到MT的直接调节。雌性夏季下丘脑中RFRP mRNA的表达量高于秋季(P<0.05),雌性夏季下丘脑中GnRH mRNA的表达量低于秋季(P<0.05);雄性冬季下丘脑中RFRP mRNA的表达量高于春季(P<0.05),雄性冬季下丘脑中GnRH mRNA的表达量低于春季(P<0.05)。结果表明RFRP mRNA在黑线仓鼠的表达与RFRP-3抑制黑线仓鼠季节性繁殖的功能相一致,这暗示了黑线仓鼠季节性繁殖可能存在“光周期-MT-RFRP-3-GnRH”调控通路。
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