雪原, 王沛, 齐清会, 倪虹, 马信龙[1]2005年在《淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究》文中研究说明目的检测淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞MC3T3-E1中Smad4mRNA的影响。方法用0、10、20、40ng/ml的淫羊藿甙刺激MC3T3-E1细胞。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。通过四甲基噻唑蓝(MTT)法测绘细胞生长曲线和计算细胞群体倍增时间;描述刺激MC3T3-E1细胞的增殖能力。用速率分光光度法测定ALP的含量,免疫组织化学法观察Ⅰ型胶原的产生,用以判断细胞的分化情况。用RT-PCR测定Smad4mRNA的数量。结果10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可使MC3T3-E1细胞的生长曲线明显上移(P<0.01);0、10、20和40ng/ml组群体倍增时间分别为(39.37±2.35)h、(26.76±1.78)h、(29.30±2.12)h和(36.35±2.34)h,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01);0、10ng/ml可使MC3T3-E1细胞产生ALP和Ⅰ型胶原量增加,刺激ALP作用呈现时间和剂量的依赖性(P<0.01);RT-PCR显示10、20ng/ml浓度淫羊藿甙可以刺激MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的数量增加。上述作用以10ng/ml浓度最强(P<0.01)。结论淫羊藿甙刺激成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化,可能是通过提高MC3T3-E1细胞Smad4mRNA的量而产生作用。
雪原[2]2003年在《淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：检测淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞MC3T3-E1中Smad4的mRNA影响。 方法：MC3T3-E1细胞分成4组，分别加入0ng／ml、10ng／ml、20ng／ml、40ng／ml的淫羊藿甙。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。通过MTT法测绘细胞生长曲线和计算细胞群体倍增时间；描述MC3T3-E1细胞在不同浓度淫羊藿甙刺激下的增殖能力。用速率分光光度法测定培养1，2，3天后细胞ALP的含量；免疫组织化学法观察培养3天后Ⅰ型胶原的产生，用以判断细胞的分化情况。用RT-PCR半定量测定各组Smad4的mRNA数量。 结果：①在淫羊藿甙刺激下，MC3T3-E1细胞呈多角形，紧密全层排列，胞浆丰富，染色质松散，符合成骨细胞特点；②10ng／ml、20ng／ml组的生长曲线较0ng／ml、40ng／ml组上移；方差分析显示10ng／ml、20ng／ml组MTT OD值较40ng／ml和0ng／ml组有显着性差异(P＜0.01)。0ng／ml、10ng／ml、20ng／ml和40ng／ml组的群体倍增时间分别为：39.37±2.35h、26.7±1.78h、29.3±2.12h和36.35±2.34h，各组间差异具有显着性(P＜0.01)；③培养后第1天各组织之间ALP差异不具有显着性(P＞0.05)，第2天10ng／ml和20ng／ml组的ALP值分别为：129.45±14.54u／L和127.58±9.77u／L；40ng／ml和0ng／ml组的ALP值分别为：92.15±5.77u／L和93.23±8.72u／L。10ng／ml、20ng／ml组较40ng／ml、0ng／ml组的差异具有显着性(P＜0.01)。第3天0ng／ml、10ng／ml、20ng／ml和40ng／ml组的ALP含量分别为229.31±23.46u／l、304.65±12.94 淫羊蓝贰对成骨细胞Smad4作用的实验研究天津医科大学博士学位论文u/1、271.39士15.60u/1和208.75士14.74u/1，各组间差异具有显着性 (尸<0.01):④免疫组织化学结果显示ong/血1、long/ml、Zon留inl和40ng/mlI型胶原显色分别为++，一+，+一，++;⑤RT-PCR显示:ong/ml、1 ong/ml、20ng/ml和4ong/ml组sm以m胭A的on值分别为1 .5 x 104、6.4xlo4、4 .5 x 104和l.3xl04。 结论:①细胞生长曲线的上移和群体倍增时间的缩短提示淫羊蕾昔刺激成骨细胞MC3T3一El增殖;②ALP在培养后第叁天明显增高和I型胶原显色增强显示淫羊蕾昔刺激成骨细胞MC3T3一El分化;③淫羊蕾昔可以提高成骨细胞smad4mRNA的量，上述作用以10ng/ml浓度作用最强。
李东晓, 吴瑕, 张磊, 王岚, 邓文龙[3]2009年在《淫羊藿对骨骼系统的药理作用研究进展》文中指出淫羊藿对骨骼系统的药理学研究甚多,涉及从整体到分子的多个层次、多种骨相关细胞和多种作用机理。多数报道显示淫羊藿可改善骨损伤,促进成骨或成软骨,抑制破骨细胞,其机理与调节多种骨相关蛋白及其mRNA表达、提高性激素水平等有关。但不同或相反结论亦见诸报道,且在体外试验中尤多。鉴于此,本文拟就淫羊藿对骨骼系统的药理作用研究现状做一综述,分析存在的主要问题,并就今后的研究提出建议。
高毅[4]2013年在《淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响及机制探讨》文中研究表明颌骨缺损的修复在口腔医学领域是一个前沿课题，祖国医学运用中药促进新骨的形成有着悠久历史，以“肾补骨”理论为指导的对补肾中药的成骨作用机制研究更是成为了一个研究热点。淫羊藿是中国传统的补肾壮骨中药，具有补肾助阳、强筋健骨之功效。淫羊藿苷(Icariin, ICA)为淫羊藿的主要活性成分，目前有关淫羊藿苷对成骨细胞的增殖、分化等方面的研究虽然较多，但是研究结论不一，淫羊藿苷的机制研究不够深入，其具体作用靶点、作用信号通路的具体环节和途径等细胞内信号系统的作用机制尚不清楚。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)是骨修复中最主要的成骨诱导因子，BMPs与其受体BMPR结合通过Smads和p38MAPK等途径进行信号转导并通过下游转录因子Runx2、Osterix等与相应的成骨细胞特异蛋白碱性磷酸酶、骨钙素等基因启动子连接促进细胞向成骨方向分化。本研究从以下四个方面研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响及成骨机制，以阐明该药物作用的分子机制。一是淫羊藿苷对成骨细胞增殖活性的影响，二是淫羊藿苷对成骨细胞分化的影响，叁是淫羊藿苷对BMP2-Smads-Runx2信号通路的影响，四是淫羊藿苷对BMP2-p38MAPK通路的影响。本研究为今后的实验提供科研思路和方法，为临床应用淫羊藿苷促进成骨功能，提供深入的理论依据。第一部分淫羊藿苷对成骨细胞形态及增殖活性的影响目的：本部分实验通过对MC3T3-E1细胞形态观察，MTT法检测不同浓度ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响以及应用Real-Time PCR、Western blot方法检测ICA对MC3T3-E1细胞增殖标志基因PCNA和Ki67表达的变化，系统研究ICA在体外对成骨细胞增殖的影响。方法：体外培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的ICA分别孵育MC3T3-E1细胞24h、48h、72h，用MTT法检测不同浓度的ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响。应用Real-Time PCR法检测增殖标志基因PCNA和Ki67的mRNA表达；Western blot法检测增殖标志基因PCNA和Ki67蛋白的表达。结果：细胞形态学观察，不同浓度的ICA对MC3T3-E1细胞的形态无明显影响；0、0.01、0.1、1μM各浓度组的ICA对成骨细胞的增殖无明显的影响，随着培养时间的延长，细胞增殖能力有所增加但和对照组相比无统计学差异。不同浓度的ICA对MC3T3-E1细胞的增殖标志基因PCNA和Ki67的mRNA和蛋白表达均无明显的影响。结论：ICA对MC3T3-E1细胞的形态无明显影响；对MC3T3-E1细胞的增殖活性无明显的影响，ICA可能是通过对MC3T3-E1细胞分化等其他生物学特征产生影响而发挥作用。第二部分淫羊藿苷对成骨细胞分化的影响目的：本部分实验应用透射电镜观察ICA对MC3T3-E1细胞超微结构的影响以及通过检测不同浓度的ICA在不同时间对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响，ICA对BMP2以及成骨细胞分化过程中相关基因BGP、OPN、COL1的表达变化，研究ICA对MC3T3-E1细胞分化的影响。方法：体外培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞14d,应用透射电镜观察ICA对MC3T3-E1细胞超微结构的影响。并应用不同浓度（0、0.01、0.1、1μM）的ICA孵育MC3T3-E1细胞，用磷酸苯二钠法检测不同浓度的ICA在不同时间（24h、48h、72h）对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响；应用Real-Time PCR法检测BGP、OPN、COL1、BMP2mRNA的表达；Western blot方法检测ICA对BGP、OPN、COL1、BMP2蛋白表达的影响。结果：扫描电镜下观察MC3T3-E1细胞，细胞表面突起少，细胞质内高尔基体、内质网和线粒体等细胞器不发达，呈前成骨细胞样表型。ICA作用MC3T3-E1细胞14天后，扫描电镜下观察此时的细胞，发现细胞表面突起较多，细胞核位于细胞的一侧，核仁较明显，胞浆中散在丰富的糖元、溶酶体及呈同心圆状排列的髓样化结构，细胞核周围有较多的高尔基体、扩张的粗面内质网和散在的椭圆形线粒体，MC3T3-E1细胞经ICA作用后，呈成骨细胞样表型。经过0.01、0.1和1μM ICA作用后，与0μMICA对照组相比，MC3T3-E1细胞ALP活性显着增加，其中1μM药物组作用效果最明显；并且随着作用时间的延长，药物作用效果显示出显着的时间依赖效应。与0μM ICA对照组相比，0.01、0.1和1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，BMP2的mRNA和蛋白水平呈浓度依赖性上调（P<0.05），其中以1μM ICA的刺激作用最强，可以显着地增加BMP2的mRNA和蛋白表达水平。经过0.01、0.1和1μM ICA作用48h后，MC3T3-E1细胞中BGP、OPN、COL1转录及翻译水平均显着增加（P<0.05）。结论：1. MC3T3-E1细胞经ICA作用后，其超微结构呈成骨细胞样表型。2. ICA在0~1μM浓度范围内，可以时间-剂量依赖性增加MC3T3-E1细胞中ALP活性；3. ICA上调成骨细胞分化的关键基因BGP、OPN、COL1，这些分子表达水平改变以后，会以不同方式直接或间接影响成骨细胞的微环境，促进骨分化和骨形成。4. ICA上调成骨诱导因子BMP2的表达，可诱导成骨细胞的分化。第叁部分BMP2-Smads-RunX2信号通路在淫羊藿苷诱导成骨细胞分化中的作用目的：本部分实验应用Real-Time PCR、Western blot方法，观察ICA对BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2、Osterix表达的影响，从BMP2-Smad-RunX2信号通路入手，研究ICA成骨机制方法:1μM的ICA孵育MC3T3-E1细胞48h，Real-Time PCR、Westernblot方法检测BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2、Osterix的表达；应用RunX2的特异性小干扰RNA沉默RunX2的表达，观察RunX2在MC3T3-E1细胞分化中的作用。结果：与0μM ICA对照组相比，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，BMP2、Smad1、Smad5、Smad8、RunX2和Osterix的mRNA和蛋白表达水平均不同程度增高。RunX2-siRNA对MC3T3-E1细胞中RunX2的mRNA和蛋白表达量均降低；其中40nM RunX2-siRNA转染后可高效抑制RunX2的mRNA和蛋白表达；转染40nM RunX2-siRNA的MC3T3-E1细胞中ALP活力显着下降；40nM RunX2-siRNA下调MC3T3-E1细胞分化相关基因BGP、COL1、OPN的mRNA和蛋白表达。结论：1.BMP2参与了ICA诱导MC3T3-EI细胞的成骨分化过程。2.ICA可能是通过BMP2-Smads-RunX2-Osterix通路促进成骨细胞分化。3.RunX2基因在MC3T3-E1细胞分化过程中，发挥着中枢样的调控作用，直接影响下游ALP活性及细胞分化相关基因BGP、COL1、OPN分子的转录和翻译。第四部分BMP2-p38MAPK信号通路在淫羊藿苷诱导成骨细胞分化中的作用目的：本部分实验应用Western blot方法检测ICA对p38MAPK、ERK、JNK表达及其磷酸化水平变化的影响并应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580阻断其作用，从BMP2-p38MAPK信号通路，研究ICA成骨机制。方法:1μM的ICA孵育MC3T3-E1细胞48h，Western blot方法检测p38MAPK、ERK、JNK表达及其磷酸化水平的变化；应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580阻断其作用，观察ICA对MC3T3-E1细胞分化的影响。结果：与0μM ICA对照组相比，1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，p38MAPK、ERK、JNK表达无显着性差异；细胞中p-p38MAPK的水平显着增加（P<0.05），而p-ERK和p-JNK的水平不受影响（P>0.05）。表明ICA可磷酸化p38MAPK，对ERK、JNK无磷酸化作用。与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞的单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h后，p-p38MAPK的水平明显下降（P<0.05）。表明p38MAPK抑制剂SB203580能够抑制ICA对p38MAPK的磷酸化作用。与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞的单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化后，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h，细胞中ALP活性明显下降（P<0.05）与1μM ICA作用MC3T3-E1细胞单独作用相比，p38MAPK抑制剂SB203580阻断p38MAPK活化后，再给予1μM ICA作用MC3T3-E1细胞48h，细胞中BGP、COL1和OPN的mRNA和蛋白表达则明显下降（P<0.05）。结论：ICA可磷酸化p38MAPK，对ERK、JNK无磷酸化作用，ICA可能是通过BMP2-p38MAPK信号通路促进成骨细胞分化。
任培中[5]2017年在《升陷通络汤对肺纤维化干预作用的实验研究》文中提出研究背景特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)对人类的危害严重,是一种致死率、致残率高的疾病,近年来发病率有增高的趋势。本病的发病机制尚不十分明确,缺乏有效的治疗药物。多数研究认为,肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)过度沉积是IPF的主要病理特征,最终肺泡结构破坏,形成肺泡腔内完全性纤维化和囊泡状的蜂窝肺,导致肺功能持续性和进行性损害。IPF的治疗目前尚无肯定有效的药物,中医中药治疗具有一定优势,可减轻IPF患者的临床症状、延缓肺功能下降,但其作用机制有待阐明。近年来,我们通过临床观察发现,宗气下陷是IPF发生的始动因素,在此基础上发生外邪痹阻,久病入络,与内生痰瘀结合,痰瘀进一步痹阻肺络,终至“宗气虚陷、肺络痹阻、痰瘀内结”的病因病机,临床以“益气升陷、疏通肺络、化痰活血”为主要功效的升陷通络汤来治疗IPF初步取得较好疗效。目的:观察升陷通络汤对实验性肺纤维化大鼠肺组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)信号通路和基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMPs)系统的调控作用,以及对Ⅰ型胶原(Type Ⅰ Collagen Protein,Col Type Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Type Ⅲ Collagen Protein,Col Type Ⅲ)、Ⅳ型胶原(Type Ⅳ Collagen Protein,Col Type Ⅳ)、透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)、纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)等 ECM蛋白水平的影响,揭示mTOR/p70S6K信号通路和MMPs/TIMPs系统与ECM蛋白沉积的关系;观察在造模后不同时间节点进行干预,大鼠肺组织中ECM蛋白、mTOR/p70S6K信号通路、MMPs/TIMPs系统的表达差异;观察升陷通络汤对大鼠肺功能的影响。方法:选取健康雄性SD大鼠96只,随机分为空白对照组12只、模型组12只、升陷通络汤第3天干预组12只、升陷通络汤第14天干预组12只、升陷通络汤第28天干预组12只、N-乙酰半胱氨酸第3天干预组12只、N-乙酰半胱氨酸第14天干预组12只、N-乙酰半胱氨酸第28天干预组12只。升陷通络汤和N-乙酰半胱氨酸组大鼠分别于造模后第3、14、28天起予相应剂量的升陷通络汤中药或N-乙酰半胱氨酸连续治疗90天。疗程结束后,观察各组大鼠肺功能指标(FVC、FEV0.3/FVC%、PEF、MVV、Cdyn)变化,并取大鼠右肺中叶进行病理学观察。HE染色观察升陷通络汤、N-乙酰半胱氨酸对肺纤维化大鼠肺泡炎及肺纤维化程度的影响;免疫印迹法及反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)法检测各组大鼠肺组织中 mTOR、p70S6K、MMP2、TIMP1、ColTypeⅠ、Col Type Ⅲ、Col Type Ⅳ、HA、FN蛋白量和基因表达水平。结果:肺功能结果显示,升陷通络汤可以改善大鼠肺功能Cdyn指标(P<0.05),但对肺功能FVC、FEV0.3/FVC、PEF、MVV指标改善不明显(P>0.05);病理结果显示,模型组大鼠肺泡结构破坏、间质纤维增生、多量炎症细胞浸润,升陷通络汤组和N-乙酰半胱氨酸组较模型组有所减轻;免疫印迹及RT-PCR结果显示,升陷通络汤各组大鼠肺组织中ECM蛋白(Col Type Ⅰ、Col Type Ⅲ、Col Type Ⅳ、HA、FN)、mTOR/p70S6K信号通路和MMPs/TIMPs系统的mRNA相对表达量较模型组均有降低(P<0.01),并且升陷通络汤第3天干预组大鼠ECM蛋白、mTOR/p70S6K信号通路和MMPs/TIMPs系统的蛋白量较模型组也均有降低(P<0.01),中药第3天、第14天干预组HA的mRNA相对表达量低于对应西药组(P<0.05),中药第14天、第28天干预组Col Type Ⅰ、FN的mRNA相对表达量显着低于对应西药组(P<0.05),中药第3天干预组MMP2、TIMP1的mRNA相对表达量低于中药第14天、第28天干预组(P<0.01)。结论:升陷通络汤可通过调控mTOR/p70S6K信号通路、MMPS/TIMPs系统等相关机制来抑制ECM的沉积,并且能改善大鼠炎性细胞浸润和纤维组织的增生、减轻肺纤维化程度、延缓肺功能中Cdyn值的下降,在造模后第3天开始干预的作用较其余各组更加明显。
吴涛[6]2009年在《仿生组装淫羊藿苷控释型骨修复材料的构建与应用基础研究》文中研究指明背景中医药治疗骨折和骨不连具有数千年的历史,用药独到、简便灵验,但由于成分复杂、基础研究落后,其优势尚未得到充分发掘。中药与生物材料的复合及其在组织工程骨构建中的应用,国外尚未见正式报导,国内在此方面的研究也处于刚刚起步的阶段。已有研究表明:中药淫羊藿来源的植物黄酮——淫羊藿苷(C_(33)H_(40)O_(15),分子量:676.67)可促进成骨细胞BMP和Cbfa1基因的表达,抑制间充质细胞的成脂分化;可通过发挥雌激素样作用,增加去卵巢大鼠的骨形成、抑制骨吸收。这些结果都暗示:淫羊藿苷可作为一种骨诱导活性因子用于骨再生研究。此外,淫羊藿苷来源广泛、提取工艺相对简单、性质稳定、易于储存、可耐受消毒灭菌,这些特性亦为组织工程支架材料的载药提供了方便。目的1.研究传统中药淫羊藿有效药理成分——淫羊藿苷对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs)增殖和成骨分化等生物学行为的影响,探讨其促进成骨分化的作用机制,评价淫羊藿苷作为一种新型成骨诱导信号分子替代生长因子应用于骨组织工程的可行性;2.构建仿生组装淫羊藿苷—壳聚糖/羟基磷灰石(淫羊藿苷—CS/HA)骨修复材料,探讨其理化性质和生物相容性;3.研究淫羊藿苷—CS/HA复合材料的体外释药行为和释药动力学;4.研究淫羊藿苷—CS/HA复合材料的体内成骨效能。方法1.淫羊藿苷对hBMSCs成骨分化的影响和机制研究hBMSCs的分离培养和鉴定健康志愿者经知情同意后,于髂骨抽取骨髓,经全骨髓培养、扩增后,对第二代细胞进行表型标志物鉴定和成脂、成软骨和成骨叁向诱导,取第3代细胞用于试验。淫羊藿苷的细胞毒性试验将hBMSCs接种至96孔板中进行培养,5000细胞/孔,贴壁后加入150μl浓度为10~(-9)M～2.0×10~(-4)M的淫羊藿苷培养基和0.05%(v/v)DMSO培养基进行培养,用普通培养基作为对照,干预48h后采用MTT法检测各浓度淫羊藿苷对hBMSCs活力的影响。细胞增殖试验将hBMSCs接种于96孔板中进行培养,2000细胞/孔,贴壁后吸出原培养基,分别加入150μl浓度为10~(-9)～10~(-4)M的淫羊藿苷培养基进行培养,以DMSO培养基作为对照。于加液后第1、3、5、7和9d MTT法测定OD值,绘制细胞生长曲线。hBMSCs成骨分化试验将hBMSCs植入6孔板中进行培养,2×10~7细胞/孔,贴壁后加入1.5ml浓度为10~(-9)M～10~(-4)M的淫羊藿苷培养基进行培养,以DMSO培养基作为阴性对照,rhBMP-2培养基作为阳性对照。于加液后3、7、11d裂解细胞,采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒和BCA试剂盒分别检测ALP和蛋白浓度,根据公式ALP(U/g)=ALP/总蛋白量换算ALP含量;同上法培养细胞,于7、14、21d裂解细胞,骨钙素(OCN)Elisa试剂盒检测OCN表达量;采用NBT/BCIP染液对培养11d的hBMSCs进行ALP染色;采用茜素红染液对培养28d的hBMSCs进行钙化结节染色并定量。淫阳藿苷促进hBMSCs成骨分化的机制研究将hBMSCs植入6孔板中进行培养,2×10~7细胞/孔,贴壁后加入DMSO培养基、10~(-6)M淫羊藿苷培养基、rhBMP-2培养基和10~(-6)M淫羊藿苷+rhBMP-2培养基进行培养。分别于1、4、7d采用RT-PCR方法对成骨相关基因ALP、OCN、OPN、Col-Ⅰ、Cbfa1、BMP-2、BMP-4和BMP-7mRNA的表达进行检测。将hBMSCs植入φ10cm培养皿中进行培养,5×10~7细胞/皿,贴壁后加入4ml DMSO培养基、10~(-6)M淫羊藿苷培养基、rhBMP-2培养基和淫羊藿苷+rhBMP-2培养基连续培养14d,经提取总蛋白后进行Westernblot检测成骨相关蛋白Cbfa1、OCN、BMPs的表达;细胞爬片后进行OCN免疫细胞荧光检测。2.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的构建仿生组装CS/HA复合材料的构建、表征和生物相容性采用原位复合和冷冻干燥方法制备CS/HA复合材料,通过扫描电镜(SEM)、切片染色观察材料的孔隙结构,采用常规方法评估材料的密度、孔隙率、孔径;采用X线衍射仪(XRD)和傅立叶红外光谱(FTIR)分析材料的理化性质;制备材料浸提液,采用MTT法观察其对hBMSCs增殖的影响,将hBMSCs接种至材料表面,分别于第3d和第10d采用SEM观察细胞的数量和形态;将CS/HA复合材料植入新西兰兔背部肌袋,分别于术后1、4、8、12 w行组织切片观察材料的组织相容性和降解情况。仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的制备、表征和生物学相容性在CS/HA复合材料的制备过程中掺入淫羊藿苷,制备载药剂量分别为10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)mol的淫羊藿苷-CS/HA复合材料。采用同上方法分析淫羊藿苷-CS/HA复合材料的理化性质,万能材料试验机测试材料的力学性能;制备材料浸提液,采用MTT法观察其对不同密度接种的hBMSCs增殖和成骨分化(ALP表达)的影响,采用SEM对其表面接种10d的细胞进行观察;通过溶血试验考查淫羊藿苷-CS/HA复合材料对红细胞的影响;通过热原试验考查淫羊藿苷-CS/HA复合材料热原性。3.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体外释药行为将载药量分别为10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)mol的淫羊藿苷-HA/CS材料置于盛有5mlPBS的密闭玻璃离心管中,37℃恒温振荡,分别于1、2、3、10、15、20、30、60、90 d定时收集全部溶液进行超高效液相色谱(UPLC)检测。通过精密度试验、重复性试验、加样回收率试验、稳定性试验考查设备的精密度、灵敏度和淫羊藿苷的稳定性,通过标准曲线换算供试品每次释药量,并将其进行累积绘制成释药曲线;采用Logarithmic模型对释药行为进行曲线拟合。4.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体内成骨效能60只雄性新西兰大白兔随机分为5组(n=12),麻醉后于右侧桡骨中段截骨制作长度为1.5 cm的骨缺损模型,将CS/HA和载10~(-7)、10~(-6)、10~(-5)mol淫羊藿苷—CS/HA复合材料随机植入骨缺损处,骨缺损模型组不植入材料。放射性核素骨扫描(ECT)检查:术后4 w各组随机选取4只动物于耳缘静脉注射~(99m)Tc-MDP,3 h后置单光子核素扫描仪上检测骨缺损部位~(99m)Tc-MDP浓聚情况,采集结束后在图像上选取相同面积的感兴趣区域(ROI)进行定量计数,ROI均值=计数/面积。大体标本观察和X线检查:术后4、8、12 w处死动物后收集右前臂尺桡骨进行大体观察和X线拍片检查。骨密度(BMD)检查:取各组术后12 w标本行骨密度检查,于电脑上选取桡骨缺损区域并计算该区域的骨矿含量(BMC),BMD(g/cm~2)=BMC/选取面积。组织学观察:各时间点组织标本经固定、脱钙、切片后行HE染色观察。结果1.淫羊藿苷对hBMSCs成骨分化的影响和机制研究全骨髓培养的第二代hBMSCs表面标志物鉴定结果分别为:CD29(93.98±6.32)%、CD44(85.98±3.87)%、CD71(72.19±4.66)%、CD105(79.28±7.37)%、CD166(97.42±7.43)%、CD14(0.95±0.06)%、CD34(1.45±0.38)%、CD45(0.73±0.11)%;经成脂、成软骨和成骨叁向诱导后全骨髓培养法分离的细胞可分别向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化。高于10~(-4)M的淫羊藿苷具有一定的细胞毒性;培养基中0.05%(v/v)DMSO用量安全、无细胞毒性,可用于淫羊藿苷的助溶。浓度为10~(-8)M淫羊藿苷可促进hBMSCs的增殖。淫羊藿苷的促成骨分化作用(ALP表达)与剂量有关,浓度过低时(＜10~(-8)M)不能促进hBMSCs的成骨分化,浓度过高时(＞10~(-5)M)则抑制了hBMSCs的成骨分化。浓度在10~(-8)～10~(-5)M的淫羊藿苷可促进OCN的表达;在第11d的ALP染色和第28d的钙化结节染色和茜素红定量也说明10~(-8)～10~(-5)M的淫羊藿苷可促进hBMSCs向成骨方向分化。各试验均以10~(-6)M为最佳浓度,但是从整体上看,淫羊藿苷的成骨诱导能力不及rhBMP-2。10~(-6)M淫羊藿苷可促进成骨相关基因ALP、OCN、OPN、Col-Ⅰ、Cbfa1、BMP-2、BMP-4和BMP-7 mRNA的表达和成骨相关蛋白Cbfa1、OCN、BMPs的表达,与rhBMP-2具有协同作用。2.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的构建采用原位复合和冷冻干燥技术可构建出CS/HA复合材料,扫描电镜观察发现该材料表面具有均匀分散的200～700nm HA颗粒,XRD和FTIR分析表明合成的HA是含CO_3~(2-)弱结晶纳米晶体;该材料的孔隙率、孔径和密度分别为:88.70±2.27%、112.63±20.52μm和71.51±2.55 kg/m~3;材料浸提液对细胞生长曲线无干扰,其表面接种的细胞亦可自由生长;肌袋埋植试验表明,8w后组织炎性反应消退,12w时CS/HA复合材料已基本降解,材料被纤维组织爬行替代。淫羊藿苷载药过程对CS/HA复合材料的理化性质无显着影响,对其力学性能的影响与载药剂量相关:10~(-5)和10~(-6)mol载药量降低了材料的弹性模量(与CS/HA比较,P＜0.05);该材料细胞相容性良好,可诱导hBMSCs向成骨方向分化;溶血试验表明淫羊藿苷-CS/HA复合材料血液相容性良好,不会导致溶血;热原试验亦证明淫羊藿苷-CS/HA复合材料无热原性。3.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体外释药行为超高效液相色谱(UPLC)的精密度试验和重现性试验的RSD分别为0.636%和3.245%;加样回收率试验的平均回收率为96.667%,RSD为2.139%;稳定性试验RSD为1.286%;在1～2000ng质量范围内,淫羊藿苷的色谱峰面积与进样量之间呈良好的线性关系,回归方程为:Y=7877.3X+202422,R~2=0.9976。通过释药累积曲线可知,释药初期(0～3d),药物从支架材料中爆发性地释放出来,约达载药量的25%,而后释药速度迅速下降,至第20d约有40%～60%左右的药物释出,之后以低速持续释放,90d后仍有部分药物存留于支架材料中。叁种载药量的释药拟合方程分别为,载10~(-7)mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=6.267+13.468 ln(X) R~2=0.901;载10~(-6)mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=5.668+16.846 ln(X)R~2=0.916;载10~(-5)mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料:Y=6.322+18.466 ln(X)R~2=0.923,释药行为符合一级方程。4.仿生组装淫羊藿苷-CS/HA骨修复材料的体内成骨效能骨缺损模型组的各项检测结果表明:骨缺损部位自身修复能力低下,造模后两断端骨髓腔逐渐闭合,至12 w时髓腔完全封闭形成骨缺损。第4 w进行的ECT检测结果表明:4个材料植入组的ECT值均显着高于骨缺损模型组(P＜0.001),载药量为10~(-6)mol和10~(-5)mol的淫羊藿苷-CS/HA组显着高于单纯CS/HA植入组(P＜0.01);大体观察和X线检查结果表明,在第4w植入淫羊藿苷—CS/HA材料可观察到明显的骨痂桥接断端,植入8w后骨痂大量生长,骨缺损基本愈合,到12 w时髓腔再通,骨愈合进入塑形期。BMD检测结果:4个材料植入组的BMD值均显着高于骨缺损模型组(P＜0.001),载药量为10~(-6)mol和10~(-5)mol的淫羊藿苷-CS/HA组显着高于单纯CS/HA植入组(P＜0.001)。从组织学切片的观察发现,淫羊藿苷-CS/HA植入骨缺损后,材料的降解速度随载药剂量的增加而明显加快,4 w时材料即发生明显的崩解、碎裂,其周围可见大量新生软骨形成并逐渐向材料的中央长入;8 w时材料进一步降解,被分割的材料间隙有大量软骨组织形成,部分发生骨化;至12 w时材料完全降解,软骨被骨组织替代,新生的骨组织排列紊乱,中央可见细小的骨髓腔结构,骨修复速度快于单纯应用CS/HA复合材料。结论1.淫羊藿苷可促进hBMSCs的增殖和成骨分化,这两种作用与淫羊藿苷的浓度相关;淫羊藿苷诱导成骨效能逊于rhBMP-2。2.淫羊藿苷可诱导hBMSCs成骨相关基因和蛋白的表达,与rhBMP-2具有协同作用。3.采用原位复合和冷冻干燥方法可制备出CS/HA复合材料,该材料具有良好的孔隙率和生物相容性,化学构成与天然骨近似。4.淫羊藿苷载药过程对CS/HA复合材料的理化性质无显着影响,对其力学性能的影响与载药剂量相关;载药过程不会影响CS/HA复合材料的生物相容性。5.淫羊藿苷-CS/HA复合材料在体外释药缓慢,释放时间可达90d以上,释药行为遵循一级方程。6.淫羊藿苷-CS/HA复合材料具有骨传导性和骨诱导活性,可促进原位骨再生。
冯艳铭[7]2008年在《慢病毒介导的亲环素A(CyPA)siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究》文中指出肺癌是常见的恶性肿瘤,被认为是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。全球每年新增120万病例,中国每年有60万人死于肺癌,在中国肺癌5年生存率仅8.9%,非小细胞肺癌占肺癌的85%以上,而非小细胞肺癌中85%以上又都属中晚期肺癌而失去根治性手术治疗的机会。肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果,多种基因在肺癌的发生和发展中均起到了非常重要的作用,蛋白组学的发展使得在非小细胞肺癌(Non-small celllung cancer,NSCLC)发现了许多高表达和低表达蛋白,亲环素A(Cyclophilin A,CyPA)就是众多相关蛋白之一。CyPA是本课题组应用双向电泳技术(2-DE)在肺腺鳞癌组织中发现的特异性高表达的差异蛋白,CyPA是功能相关的蛋白家族成员之一,具有肽基脯氨基顺反异构酶活性,能催化细胞内蛋白质的折迭、装配和运输,起分子伴侣的作用。新近研究表明,CyPA参与了许多癌的发生和发展过程,其促进癌细胞生长的作用在胰腺癌研究中,取得了很有说服力的结果。RNA干扰(RNAi)技术具有快速、高效、易行的特点,在基因功能研究、基因治疗方面显示了巨大的前景。慢病毒载体介导的短发夹RNA(shRNA)表达载体能感染非分裂细胞和终末分化细胞,并且在感染后整合到宿主细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,适合体内实验研究。研究目的1.假设特异性地沉默CyPA基因可能是抑制非小细胞肺癌生长的有效方法,为此,本课题首先构建慢病毒介导的CyPA siRNA系统。2.本课题旨在研究CyPA在NSCLC发生中的作用,以寻求其作为基因治疗新靶点的依据。因此,采用慢病毒介导的CyPA siRNA,分别在体内体外水平研究CyPA基因沉默对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用,对已筛选的肺癌相关蛋白CyPA的基因进行生物学功能研究。材料与方法1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1采用双链嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术,设计特异性引物,提取NSCLC A549、H1299及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞的总RNA,反转录获得cDNA进行PCR,低熔点琼脂糖凝胶回收纯化PCR扩增产物,取1μl的纯化产物,作10倍系列稀释共9个梯度,取后6个稀释梯度的模板做标准曲线,分别建立内对照β-actin和目的基因CyPA定量标准曲线。检测A549、H1299及BEAS-2B细胞CyPAmRNA的表达水平,以BEAS-2B细胞作为对照,用2~(-ΔΔCt)计算CyPAmRNA相对表达量,通过PCR产物的熔解曲线评价其特异性。1.2收集45例NSCLC手术病人切除的肺癌组织,22例对应的癌旁组织,33例对应的正常肺组织制成组织芯片,其中鳞癌25例,腺癌20例;按TNM分期标准Ⅰ+Ⅱ期27例,Ⅲ期18例,用SP免疫组化方法和组织芯片技术,观察CyPA在NSCLC癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达和分布情况以及与临床病理指标的关系。2.构建并筛选慢病毒介导的CyPA siRNA有效靶点和制备病毒颗粒2.1首先设计并合成4对CyPA基因siRNA靶序列寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生Lv-shCyPA慢病毒质粒载体,PCR及测序筛选鉴定阳性克隆。2.2将阳性克隆Lv-shCyPA慢病毒质粒载体与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装制备5个假包装病毒颗粒(Lv-shCyPA)并感染NSCLC A549、H1299细胞,Western Blot分析CyPA蛋白表达水平,筛选CyPA siRNA有效靶点并进行该靶点高滴度病毒包装,命名为Lv-shCyPA。2.3待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,将Lv-shCyPA分别按照MOI值为2、5、10、20、40感染A549细胞、H1299,根据表达荧光的细胞百分数优化MOI值。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的体外研究3.1待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,按照优化的MOI值,加入适量的病毒,每孔细胞加Polyberne(5μg/ml),正常培养传代4～5次,以GFP为报告基因镜下筛选GFP强表达的克隆,分离培养,建立了CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA。3.2将Lv-shCyPA分别按照A549细胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染NSCLC A549、H1299细胞,感染第5天提取细胞总RNA,采用荧光定量RT-PCR检测CyPA mRNA表达水平。3.3取对数生长期的CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA,胰酶消化后重悬成2×10~4/ml的细胞悬液,每孔接种100μl于96孔板,分别在培养1d、2d、3d、4d、5d、6d时终止培养,MTT法检测细胞增殖情况。3.4将Lv-shCyPA按照A549细胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染A549、H1299细胞,用不含EDTA的0.25%胰酶消化感染第5天的细胞培养物,4℃70%乙醇固定细胞,加1mlPI(50μg/ml)染色,4℃避光30min,进行细胞周期及凋亡检测。3.5阴性对照病毒颗粒按上述步骤进行平行实验,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的作用4.1 A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞悬液(5×10~7/ml),注射于裸鼠协腹皮下,每组5～6只裸鼠,注射体积为100μl/只。4.2裸鼠成瘤后每四天测量1次移植瘤体积,从注射起测量到第38d,肿瘤体积=(长×宽~2)×0.5,根据移植瘤体积绘制移植瘤生长曲线。4.3阴性对照病毒颗粒感染的A549、H1299按上述步骤进行致瘤,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。5.统计学处理利用SPSS12.0软件对数据进行统计分析,采用t检验对不同感染条件下细胞CyPA蛋白、mRNA、细胞增殖率、细胞周期分布、凋亡率以及裸鼠移植瘤瘤体、重量与对照组比较;秩和检验比较不同组织CyPA蛋白表达水平的差异,以α=0.05为检验水准。结果1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1荧光定量RT-PCR检测A549、H1299、BEAS-2B细胞中CyPA mRNA的表达水平,结果显示:肺腺癌细胞A549、H1299中CyPA mRNA呈高表达,其表达水平与BEAS-2B细胞相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。1.2组织芯片免疫组织化学技术检测,结果显示:CyPA蛋白的阳性信号见于肺癌细胞浆、肺泡上皮细胞浆,呈棕色颗粒状,其分布以广泛性表达为主,偶见局灶性或散在性分布;正常肺组织未见或少见棕色颗粒沉着。NSCLC癌组织及癌旁组织中CyPA的表达水平明显高于正常肺组织中CyPA蛋白的表达水平,其差异有统计学意义(P＜0.05),CyPA蛋白在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的阳性表达率分别为9.09%(3/33)、53.62%(12/22)、82.22%(37/45),CyPA在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的表达水平依次呈递增趋势;肺腺癌与肺鳞癌组织中CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);不同TNM分期的的癌组织CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。2.慢病毒介导的CyPA siRNA的有效靶点有效的CyPA siRNA靶序列是5'-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3',根据该序列制备的CyPA siRNA假包装病毒颗粒滴度为2×10~9TU/ml。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299中CyPA基因的沉默作用Lv-shCyPA感染A549、H1299细胞,CyPA mRNA和蛋白表达水平均下降,与对照组相比,CyPA mRNA相对表达量分别为0.048和0.1452,CyPA mRNA的沉默效率分别为95.2%和85.48%,CyPA蛋白水平相对表达量分别为13.48%和14.7%,其表达抑制效率分别为86.52%和85.3%,CyPA mRNA与蛋白的表达水平具有一致性,其表达水平与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。阴性对照A549/NC、H1299/NC组CyPA mRNA和蛋白的表达水平与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的抑制作用MTT法分析不同条件下A549、H1299细胞的生长状态,结果显示:A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞生长明显平缓,感染第5d细胞增殖率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术分析不同条件下细胞各周期分布,结果显示:不同条件下细胞G_0-G_1期、S期细胞比例与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞G_2-M期细胞相对减少,细胞凋亡率增加,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);而A549/NC、H1299/NC组G_2-M期比例、细胞凋亡率与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。5.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用未感染病毒组及阴性对照病毒颗粒感染组的细胞接种裸鼠后,移植瘤在第4d出现可见肿瘤,然后生长迅速,而A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA感染组可见肿瘤在接种后6d出现,移植瘤生长明显迟缓。接种后第38d,A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA组移植瘤体积小、重量轻,与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),CyPA基因沉默组移植瘤瘤体重量平均降低了77.76%和78.85%。而A549/NC、H1299/NC组细胞接种后形成的移植瘤体积、重量与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论1.CyPA蛋白在正常肺组织、NSCLC癌旁组织及癌组织中的表达水平依次呈递增趋势,尤其是在癌组织中呈高表达水平;同时在NSCLC A549、H1299细胞中CyPA mRNA亦呈高表达水平,CyPA mRNA的表达水平与BEAS-2B细胞相比差异有统计学意义,提示CyPA可能参与了非小细胞肺癌的发生发展。2.筛选出有效的CyPA siRNA靶序列为5'-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3',制备的Lv-shCyPA经体外观察对NSCLC A549、H1299中CyPA基因的表达有沉默作用,对NSCLC A549、H1299生长有抑制作用。3.慢病毒介导的CyPA siRNA在裸鼠移植瘤实验中也显示出一定的抑瘤作用,为肺癌的基因治疗和药物治疗提供新的治疗策略。
朱晓峰[8]2009年在《淫羊藿素对MC3T3-E1Subclone14细胞分化及相关信号通路的影响》文中研究指明目的:淫羊藿素为补肾强骨中药淫羊藿的主要成分淫羊藿苷在动物体内代谢后脱去糖基的活性成分,可能是淫羊藿口服吸收后主要发挥药理活性的成分,对其研究更符合淫羊藿临床多口服给药的用药方式。目前其对成骨细胞作用机理的研究尚未见报道。本研究观察淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14前体成骨细胞株增殖、分化的影响,以及观察它对与分化相关的雌激素受体信号通路、p38MAPK信号通路、BMPs/smads信号通路的影响,明确淫羊藿素作用于成骨细胞而影响骨代谢的具体靶点,对于评价淫羊藿治疗骨质疏松等骨代谢疾病的有效性提供细胞分子学依据。方法:1.MC3T3-ElSubclone14前体成骨细胞株的培养及活性观察。2.运用MTT法检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14的细胞毒性,确定实验用的药物剂量。3.应用WST-8细胞活力方法、BrdU流式细胞仪方法检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞增殖的影响。4.应用pNPP方法检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞碱性磷酸酶活性的影响,运用双抗夹心ELISA方法检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞Ⅰ型胶原和骨钙素的影响,运用茜素红染色计数矿化结节的方法评价淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞矿化的影响。5.运用ER受体阻断剂ICI182780阻断ER受体信号后,检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原和骨钙素的影响,评价ER受体信号在淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞分化过程中的作用。6.运用p38MAPK受体阻断剂SB203580阻断p38MAPK信号后,检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原和骨钙素的影响,评价p38MAPK信号在淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞分化过程中的作用。7.实时荧光PCR检测淫羊藿素对BMP-2、4、7mRNA的表达。运用BMPs受体阻断剂Noggin阻断BMPs/Smads信号后,检测淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞表达碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原和骨钙素的影响,评价BMPs/Smads信号在淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞分化过程中的作用。8.Western-blot检测ER受体阻断剂ICI182780阻断ER受体信号后,淫羊藿素对p38和Smad1/5/8的蛋白磷酸化情况,评价它们和ER受体信号的关系。结果:1.MC3T3-ElSubclone14前体成骨细胞株,在具有分化条件的培养基中可以向成骨细胞分化。2.淫羊藿素对MC3T3-ElSubclone14细胞毒性的检测发现,IC50浓度为10~(0.154)mol/L,10~(-5.93)mol/L浓度以下则对细胞基本上无抑制作用,因此实验药物浓度选择10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)mol/L 0.01μM、0.1μM、1μM)为梯度浓度。3.WST-8和BrdU流式细胞仪检测发现,淫羊藿素0.01μM、0.1μM、1μM浓度组的MC3T3-ElSubclone14的细胞活力和细胞增殖指数与对照组比较,在统计学上无显着差异(P＞0.05)。4.在作用48或72小时后,淫羊藿素0.01μM、0.1μM、1μM浓度组MC3T3-ElSubclone14细胞的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素与对照组比较,在统计学上有显着差异(P＜0.01或0.05);淫羊藿素作用10天或14天后,各组的矿化结节计数和对照组比较,在统计学上有显着差异(P＜0.01)。5.运用ER受体阻断剂ICI182780阻断ER受体信号后,1μM浓度的淫羊藿素促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化的特性明显下降,和单纯应用淫羊藿素组在统计学上有显着差异(P＜0.01);运用p38MAPK受体阻断剂SB203580阻断p38MAPK信号后,1μM浓度的淫羊藿素促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化的特性明显下降,和单纯应用淫羊藿素组在统计学上有显着差异(P＜0.01);运用BMPs受体阻断剂Noggin阻断BMPs/Smads信号后,1μM浓度的淫羊藿素促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化的特性明显下降,和单纯应用淫羊藿素组在统计学上有显着差异(P＜0.01)。6.淫羊藿素可以提高BMP-2mRNA的表达,并随着浓度的增高而增高,和对照组比较,在统计学上有明显差异(P＜0.01或0.05),1μM浓度的淫羊藿素可以提高BMP-4mRNA的表达(P＜0.05),但对BMP-7mRNA无作用(P＞0.01)。7.Western-blot检测发现运用ER受体阻断剂ICI182780阻断ER受体信号后,p38和Smad1/5/8的磷酸化明显减弱。结论:1.一定浓度(0.01μM、0.1μM、1μM)的ICT对MC3T3-ElSubclone14细胞增殖无明显促进作用。2.一定浓度(0.01μM、0.1μM、1μM)的ICT可以促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化,促进其矿化。3.ICT促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化和ER受体信号通路、p38MAPK信号通路、BMPs/Smads信号通路密切相关。4.在ICT促进MC3T3-ElSubclone14细胞分化的过程中,ER受体信号通路在p38MAPK信号通路和BMPs/Smads信号通路的上游。5.实验结果提示ICT在MC3T3-ElSubclone14细胞分化过程中所显示的主要作用可能和它的类雌激素样活性有关。
曾郁敏[9]2009年在《毒热平注射液抗流感病毒作用及免疫调控机制的实验研究》文中研究说明实验目的:流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病,好发于冬、春季节。尤其是甲型流感病毒,由于其极易产生变异,制备有效的疫苗困难重重,而针对流感病毒感染的西药既有较强的毒副作用,又容易诱导病毒产生耐药性。这种现状下,在我国的中医药宝库中寻找有效药物、创造新型药剂来防治流感就成为一项很有意义的研究工作。毒热平注射液是由黄芩、栀子、灯盏花、猪胆粉等四味药物组成的中药复方制剂,根据中医理论“毒损肺络”病机理论配伍研制而成,具有清热燥湿、凉血解毒、活血通络的功效。本实验采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM_1)感染小鼠作为模型,观察毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠的抗病毒作用及其对免疫功能的影响,以天然免疫中重要的模式识别受体Toll样受体为切入点,探讨其抗病毒作用及免疫调节作用的分子机制,为毒热平注射液的临床应用提供理论依据。实验方法:1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、双黄连组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次,连续7天;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。自造模当日起连续观察14天,计算各组死亡率及平均生活日。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响将ICR小鼠随机分为七组:正常组、模型组、利巴韦林组、痰热清组、毒热平注射液大、中、小剂量组,以4LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL/只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次;正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。按照要求在不同时间点处死小鼠,摘取肺脏,计算肺指数,同时各组取肺组织分别进行固定和匀浆,作病理形态学检测和肺组织中病毒滴度的检测。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,无菌取脾脏做脾脏T、B淋巴细胞增殖活性的检测,采用MTT法;摘取小鼠肺脏进行匀浆,和小鼠血清一起用ELISA试剂盒检测炎症因子TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-4、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10等的含量。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究动物分组、造模、给药方法同上。按照要求在不同时间点处死小鼠,冰浴条件下无菌迅速摘取小鼠肺脏,置于无RNase EP管中,立即投入液氮中冷冻。每组取5个肺组织。用PCR法检测肺组织中TLR3及PKR mRNA的表达,用Western-blot法检测TLR3及PKR蛋白的表达。实验结果:1.毒热平注射液对FM_1感染小鼠死亡保护率的影响模型组的死亡率为75%,平均生存时间为8.69d。毒热平注射液中剂量组死亡率为36.3%,与模型组比较,经x~2检验差异显着,P＜0.05;毒热平注射液大剂量组平均生存时间为10.8d,与模型组比较P＜0.05;毒热平中剂量组平均生存时间为11.81d,与模型组比较P＜0.01。2.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠肺损伤及病毒增殖的影响2.1在不同时间点观察受试动物,可见正常组小鼠体重稳步上升,模型组小鼠的体重在叁个时间点表现出先增加再下降的趋势,且均显着低于正常组。用药组中,利巴韦林组体重逐渐增加,痰热清组及毒热平各剂量组趋势同模型组。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,发现毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,毒热平小、中剂量组与模型组比较有明显差异,P＜0.05或P＜0.01。2.2在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组的肺指数均呈现逐步升高的趋势。在每个时间点上,造模72h后,与模型组比较,利巴韦林组肺指数有显着性差异,P＜0.01;毒热平中、大剂量组有明显差异,P＜0.05;造模120h后,与模型组比较,发现利巴韦林组肺指数有极为显着性差异,P＜0.001;毒热平中剂量组有明显差异,P＜0.05。2.3在不同时间点观察受试动物,可见模型组及各用药组肺组织中病毒滴度呈现逐步上升的趋势。感染120h后,与模型组相比,利巴韦林对肺脏中的病毒杀伤效果最明显,P＜0.001;毒热平注射液中剂量组对肺脏中的病毒亦有明显杀伤作用,P＜0.01,其余用药组与模型组比较无差异。2.4 HE染色光镜观察正常组小鼠肺泡结构完整清晰,腔内未见渗出。模型组造模24h可见弥漫性肺泡壁增厚,肺泡壁血管扩张充血,有少量单个核细胞浸润,部分肺泡有少量出血。造模72h后可见弥漫性肺泡壁增厚,部分区域较前次显着增厚,有明显单个核细胞浸润。造模120h后可见支气管管腔内有出血及炎性渗出,支气管周围有多量淋巴细胞浸润;弥漫性肺泡壁增厚,局灶性肺泡实变。各用药组病变明显减轻,但随时间变化而病变均逐渐加重。利巴韦林120h组仍只见轻度病变;痰热清组、毒热平大、中、小剂量组病变均呈进行性加重,但均轻于同时期模型组。3.毒热平注射液对FM1不同时相感染小鼠免疫功能的影响3.1不同时间点观察受试动物,可见模型组脾脏T、B淋巴细胞增殖活性随时间变化呈现逐渐下降的趋势,造模后小鼠的T细胞增殖活性比B细胞增殖活性抑制更为明显。在叁个时间点,模型组T细胞的增殖活性均明显受抑,P＜0.001,各用药组对其均有不同程度的恢复;造模24h后可见除利巴韦林组外的各中药组还表现出免疫促进的作用,与正常组相比显着增高,P＜0.001。造模72h后和120h,各用药组对小鼠的免疫抑制也有了不同程度的恢复,与模型组相比P＜0.001～P＜0.05,但均未恢复到正常组水平。各组B细胞增殖活性变化与T细胞近似,但变化程度较为缓和。3.2不同时间点检测各组动物血清及肺匀浆中的细胞因子,可见模型组除IL-4水平随时间变化逐渐降低外,TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-12以及趋化因子IL-8、MIP-2、RANTES、IP-10均呈现逐渐升高的趋势。各用药组对其有不同程度的干预作用。总体来说,相比而言,对各细胞因子的干预效果,痰热清组＞利巴韦林组＞毒热平大剂量组＞毒热平中剂量组,毒热平小剂量组一般来说效果较差。4.毒热平注射液对FM1病毒感染小鼠免疫调控分子机制的研究与正常组相比,模型组小鼠不同时相感染FM1后对肺组织中TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平造成了不同程度的增高,药物亦发挥了不同程度的干预作用。总体而言,TLR3及PKR mRNA及蛋白的表达水平随时间变化呈现先升高(72h)、后下降(120h)的趋势,除毒热平小剂量组外,其他各用药组均可抑制其升高的水平,与模型组相比,P＜0.01或P＜0.05,但均不能恢复到正常组水平。结论1.毒热平注射液具有抗病毒作用通过观察药物对肺脏中病毒滴度的影响发现,毒热平注射液中剂量组可明显抑制肺脏中病毒的增殖,具有一定的抗病毒作用。2.毒热平注射液对FM_1感染小鼠的死亡和肺组织损伤具有保护和改善作用:毒热平注射液中剂量组可明显降低FM1感染小鼠的死亡率,降低肺指数,改善肺脏病理变化,对FM_1感染小鼠的死亡和病毒引起的肺组织损伤具有保护作用。3.毒热平注射液对FM_1感染小鼠免疫功能具有调节作用:3.1流感病毒FM_1感染小鼠后,对脾脏T、B淋巴细胞的增殖活性具有明显的抑制作用,而毒热平注射液可对其有明显的恢复作用。3.2毒热平注射液对FM_1感染小鼠血清及肺组织匀浆中细胞因子水平具有调节作用,可显着升高因病毒感染引起的IL-4下调以及抑制其他细胞因子和趋化因子的上调,减轻炎性病理损伤,进而恢复机体免疫功能的稳定和平衡,并帮助机体抵御病毒的侵害作用。4.毒热平注射液可通过调节肺组织中TLR3和PKR的表达水平来发挥免疫调节作用。
刘佳[10]2010年在《人参皂苷Rb1与小檗碱对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其分子机制的比较研究》文中研究表明近年来2型糖尿病炎症学说备受关注,许多研究表明在2型糖尿病患者和肥胖的糖尿病动物模型中多种炎症因子和炎症标志物,例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant-1,MCP-1)等的表达和分泌增加。这些表达和分泌增加的炎症因子和炎症标志物可以通过干扰正常的胰岛素信号转导途径,引起胰岛素抵抗,还可以直接损伤胰岛β细胞。脂肪不仅是储存能量的组织,也是重要的内分泌器官,是上述炎症因子产生的重要场所之一。因此,调节脂肪细胞炎症因子的表达和分泌有望成为治疗2型糖尿病,改善胰岛素抵抗的新手段。补气药人参和清热药黄连是中医临床常用的治疗2型糖尿病的中药,常单独或配伍使用。虽然两味中药性味不同,功效迥异,但是都能发挥降糖、调脂,改善胰岛素抵抗等作用。深入研究它们对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其分子机制的异同点,有助于我们深化对中药药性理论的认识,也为它们更好的被应用于临床提供理论基础和运用指导。目的：运用体外培养3T3-L1脂肪细胞,观察人参皂苷Rb1和小檗碱对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其作用的分子机制,并比较两者作用的异同点。方法：1)将诱导分化成熟的脂肪细胞加或不加10ng/ml的TNF-α诱导24小时后,分别加入10umol/L的人参皂苷Rbl和小檗碱,干预12小时后提取RNA,逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR(QRTPCR)法检测人参皂苷Rb1与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞TNF-α、IL-6、leptin、visfatin、MCP-1、脂联素mRNA表达水平的影响；或干预24小时后提取蛋白,蛋白免疫印迹(western blotting)法检测人参皂苷Rbl与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞IKK-β、NF-κB P65蛋白的表达和IKK-β(ser181)磷酸化水平的作用；或干预24小时后,激光共聚焦显微镜下观察人参皂苷Rb1与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞NF-κB P65蛋白向细胞核内转位的影响；2)将诱导分化成熟的脂肪细胞分别加入10umol/L的人参皂苷Rb1和小檗碱,干预24小时,留取细胞上清,酶联免疫吸附(ELISA)法检测人参皂苷Rbl与小檗碱对3T3-L1脂肪细胞TNF-α、IL-6和脂联素分泌的作用。结果：1)10umol/L的小檗碱作用于3T3-L1脂肪细胞12小时降低TNF-α、IL-6、leptin和MCP-1 mRNA的表达,增加visfatin mRNA的表达,但没有增加脂联素的表达,而10umol/L的人参皂苷Rb1作用12小时降低TNF-α、MCP-1的表达,增加visfatin、leptin、脂联素mRNA的表达,对IL-6的表达没有明显的作用；2) 10ng/ml的TNF-α诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时引起TNF-α、IL-6、leptin、MCP-1的mRNA表达增加,visfatin和脂联素表达下降,加入10umol/L的小檗碱干预12小时后TNF-α、IL-6、leptin、MCP-1表达下降,visfatin mRNA的表达增加,脂联素的表达没有增加,而加入10umol/L的人参皂苷Rb1干预12小时后TNF-α和MCP-1 mRNA的表达下降,脂联素的表达增加,IL-6、leptin、visfatin mRNA的表达没有发生明显改变；3) 10umol/L的小檗碱作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时降低TNF-α、IL-6的分泌,没有增加脂联素的分泌；而10umol/L的人参皂苷Rb1作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24小时不仅降低TNF-α、IL-6的分泌,还显着增加了脂联素的分泌；4)蛋白免疫印迹结果显示10umol/L的小檗碱作用24小时能够降低基础和TNF-a诱导后3T3-L1脂肪细胞IKK-β(ser181)的磷酸化水平,但是没有改变IKK-β和NF-κB p65蛋白的表达；而10umol/L的人参皂苷Rb1作用24小时对基础和TNF-a干预后IKK-β、NF-κB p65蛋白的表达以及IKK-β(ser181)的磷酸化水平均没有明显的作用；5)激光共聚焦显微镜下观察到10ng/ml的TNF-α诱导24小时后3T3-L1脂肪细胞NF-κB P65蛋白向细胞核内的转位明显增加,用10umol/L的小檗碱干预24小时能抑制NF-κB P65蛋白向细胞核内的转位,而10umol/L的人参皂苷Rbl没有这一作用。结论：1)小檗碱可能通过作用于IKK/NF-κB信号通路发挥调节炎症因子表达和分泌的作用；2)人参皂苷Rb1对基础和TNF-α刺激的3T3-L1脂肪细胞NF-κB信号通路的激活没有明显的作用,但是其显着增加基础和胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞脂联素的表达,降低TNF-α和MCP-1的表达,同时也能降低基础状态下3T3-L1脂肪细胞TNF-α和IL-6的分泌,增加脂联素的分泌,说明其可能通过不同于小檗碱作用的信号通路发挥调节炎症因子表达和分泌的作用。
参考文献：
[1]. 淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究[J]. 雪原, 王沛, 齐清会, 倪虹, 马信龙. 中华骨科杂志. 2005
[2]. 淫羊藿甙对成骨细胞Smad4 mRNA作用的实验研究[D]. 雪原. 天津医科大学. 2003
[3]. 淫羊藿对骨骼系统的药理作用研究进展[J]. 李东晓, 吴瑕, 张磊, 王岚, 邓文龙. 中药药理与临床. 2009
[4]. 淫羊藿苷对成骨细胞增殖分化的影响及机制探讨[D]. 高毅. 河北医科大学. 2013
[5]. 升陷通络汤对肺纤维化干预作用的实验研究[D]. 任培中. 中国中医科学院. 2017
[6]. 仿生组装淫羊藿苷控释型骨修复材料的构建与应用基础研究[D]. 吴涛. 南方医科大学. 2009
[7]. 慢病毒介导的亲环素A(CyPA)siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究[D]. 冯艳铭. 郑州大学. 2008
[8]. 淫羊藿素对MC3T3-E1Subclone14细胞分化及相关信号通路的影响[D]. 朱晓峰. 暨南大学. 2009
[9]. 毒热平注射液抗流感病毒作用及免疫调控机制的实验研究[D]. 曾郁敏. 北京中医药大学. 2009
[10]. 人参皂苷Rb1与小檗碱对脂肪细胞炎症因子表达和分泌的作用及其分子机制的比较研究[D]. 刘佳. 南京中医药大学. 2010