蔡朋朋1 李雪松1 王东红1 李 晶2 孙智睿3 孙丽慧4 费洪新4 徐广有5
齐齐哈尔医学院附属三院：1消化科，2药剂科，3心内科；
齐齐哈尔医学院：4组胚教研室，5病理系，齐齐哈尔黑龙江
摘要：目的 研究TGF-β和Smad4在肠癌细胞HCT116中的表达及As2O3 对其变化的影响，探讨肠癌发生的分子机制及As2O3的新作用靶点。方法 肠癌HCT116细胞进行体外培养，将不同浓度As2O3作用于肠癌细胞后，应用免疫组化法观察TGF-β1和Smad4的含量变化；电镜下观察肠癌细胞HCT116超微结构变化。结果 免疫组化显示Smad4：对照组为18.64±0.25，1.5μmol/L As2O3组为34.16±1.28，2.5μmol/L As2O3组为39.64±1.63，与对照组比较均有统计学差异（P<0.05），TGF-β1：对照组为28.47±0.35，1.5μmol/L As2O3组为24.15±0.64，2.5μmol/L As2O3组为21.52±0.87，与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）；电镜下：As2O3作用后的肠癌细胞出现不同程度的体积变小，凋亡改变，伴有细胞的坏死。结论 TGF-β、Smad4在体外培养的肠癌HCT116细胞中存在表达异常，TGF-β/Smads信号通路调节的异常很可能是肠癌发生的重要分子基础，三氧化二砷作用机制之一很可能通过改变TGF-β、Smad4在TGF-β/Smads信号通路中的传导作用，而达到抗肿瘤的作用的。
关键词：As2O3；HCT116细胞；TGF-β；Smad4；电镜
大肠癌严重威胁着人类生命健康，全球大肠癌每年发病新病例数达94万，每年近50万人死于大肠癌，大肠癌死亡居癌症死因第3位[1，2]。大肠癌的发生发展是多因素、多阶段、多步骤的过程，涉及一系列调控基因和因子的变化，其中TGF-β/Smads信号传导通路是控制细胞增殖和诱导凋亡的重要通路，通过对细胞内多条肿瘤相关的重要信号通路的调节，在肠癌演变的各个阶段分别扮演着不同的角色。As2O3是中药砒霜石的主要成分，具有显著的抗肿瘤细胞作用，本研究将As2O3作用于肠癌HCT116细胞，观察TGF-β/Smads信号通路中相关分子变化及电镜下形态的改变，探讨As2O3作用新机制及肠癌发生发展的分子机理。
1材料与方法
1.1 材料与试剂 三氧化二砷购自哈尔滨伊达药业，国药准字H20080664，人肠癌细胞HCT116由中科院上海细胞库购买，透射电镜EM208由荷兰生产，OLYMPUS显微镜由奥地利生产，Smads及TGF抗体购于博奥森公司，其余二抗等购于武汉博士得公司。
1.2 细胞培养 复苏后的HCT116细胞接种于培养瓶中，加入RPMI-1640 培养液中，置于37℃，5%CO2 浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，细胞为贴壁上皮样生长，用0.15%胰蛋白酶消化传代，吹打制成单细胞悬液，取对数生长期细胞用于实验。
1.3 实验分组及其药物处理 将5×104个/mL单细胞悬液接种于96孔培养板中，阴性对照组加入10%的完全培养液，实验剂量组分别加入0.5μmol/L、1.5μmol/L、2.5μmol/L的As2O3培养液，每隔3天更换一次培养液，在不同时间取出细胞做实验。
1.4 免疫组化检测Smad4、TGF-β1蛋白的表达
收集分别经不同浓度的 As2O3处理的细胞，培养 72h后取出，用0.15％胰酶消化成单细胞悬液后，以1×105/ml细胞浓度接种在放有玻片的24孔培养板中，1ml/孔，37℃，5％CO2孵箱中培养72h，待细胞贴壁后，弃去上清液，换成无血清的培养液，继续培养48h后，吸尽上清液，PBS洗5min×3次，取出玻片，中性树胶封片，4℃保存备用，按照免疫组化试剂盒说明进行操作。
1.5 透射电镜观察细胞超微结构，收集对数生长期的HCT116细胞，用含10％小牛血清RPMI-1640培养液配成浓度为1×106个/ml的细胞悬液，取20ml接种在200ml的培养瓶中，37℃，5％CO2孵箱中分别培养24h，细胞贴壁后，弃去含血清的培养液，换成无血清的1640培养液，同时施加药物，不加药物的设为空白对照组，用0.15％胰酶消化，离心，弃去上清液，戊二醛和锇酸固定后，丙酮酸脱水，包埋，醋酸铀枸橼酸染色，观察及摄片。
1.6 统计学方法 数据以（ ±s）表示，组间比较用t检验，以SPSS 13.0 统计软件分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1免疫化学检测Smad4、TGF-β1蛋白表达，见表1。
2.2 透射电镜观察结果 对照组细胞：肿瘤细胞体积较大，细胞形态完整，表面有丰富微绒毛凸起，胞浆丰富，多数细胞器形态正常，高尔基复合体发达，细胞核较大，核仁大且明显，核浆比例较高；As2O3组细胞：很多肿瘤细胞体积皱缩减小，表面微绒毛减少或消失，其中细胞质中出现明显异物颗粒，线粒体早期肿大，晚期崩解，滑面内质网减少，高尔基体减少，晚期染色质边集，形成凋亡小体，部分可见坏死细胞，细胞破裂。
3.讨论
大肠癌严重威胁着我国人民的身体健康，研究和探索肠癌的发生分子机制和有效化疗药物对控制肿瘤患者病情发展，改善生活质量，延长生存期有着重要意义。TGF-β/Smads信号传导通路是控制细胞增殖和诱导凋亡的重要通路，激活后的TβRI进一步启动细胞内信号传导途径，与磷酸化的Smad2或Smad3进入细胞核，然后和Smad4结合，形成复合物，然后再与核内的各类转录因子结合，调控靶基因的转录。目前多数研究表明[3-5]：TGF-β在多种肿瘤组织中起到了一个复杂的双向作用：在肿瘤形成的初期，TGF-β充当肿瘤抑制因子的角色，抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，在肿瘤发生的晚期阶段，具有促进肿瘤增值的作用，同时TGF-β有明显的免疫抑制作用[6]，是迄今发现的最强的肿瘤诱导产生的免疫抑制因子，能抑制T细胞和B细胞生长。TGF-β以大分子无活性的蛋白前体形式潜态TGF-β（latent TGF-β）存在，由正常细胞和转化细胞分泌，需激活后才能发挥其生物学活性。一般来说，在细胞分化活跃的组织中，常含有较高水平的TGF-β，如成骨细胞、肾脏、骨髓和胎肝的造血细胞中。本研究将As2O3作用于体外肠癌HCT116细胞后，免疫组化显示空白对照组TGF-β1表达值为28.47±0.35，0.5μmol/L As2O3组为28.48±1.61，两组比较无统计学差异P＞0.05，随着As2O3浓度的增高TGF-β1 表达逐渐降低，当As2O3为2.5μmol/L时，TGF-β1为21.52±0.87，与对照组比较P<0.05，差异有统计学意义。即TGF-β1随着三氧化二砷对肠癌细胞抑制程度的增加，在肿瘤细胞的表达逐渐降低。Douglas[7，8]等对35例头颈部肿瘤组织及配对正常黏膜组织进行研究，发现约58%的肿瘤组织中TGF-β1的表达增强1.5～3.8倍，这与该结果研究相似。上述研究提示TGF-β1 在肿瘤增值活跃时表达较高，相对静止时表达较少，本人认为可能是肿瘤晚期很多肿瘤细胞对TGF-β的作用变得耐受，肿瘤细胞增殖活跃时自身分泌大量TGF-β1，或者肿瘤细胞激活了大量潜在的TGF-β前体，导致肿瘤细胞内出现表达增多，同时TGF-β1又可抑制宿主免疫监视功能，大量的TGF-β抑制了机体NK细胞对肿瘤的杀伤作用，使得肿瘤细胞发生免疫逃脱，导致其大量增值，故TGF-β1很可能是肠癌细胞增殖活跃的重要分子标记物。Smad4 最早在胰腺癌中被发现缺失，活化的Smad2、Smad3 蛋白只有在与Smad4 结合形成转录复合物，才能进入细胞核调节靶基因的转录，TGF-β1 和Smad4 是TGF-β 转导通路中起瓶颈作用的关键因子，恶性肿瘤尤其是胰腺癌、结肠癌、胃癌等存在TGF-β1 失活以及Smad 基因的变异，且与肿瘤临床病理特征及患者预后密切相关［9］。本研究结果空白对照组Smad4为18.64±0.25，As2O3为1.5μmol/L组为34.17±1.28，As2O3为2.5μmol/L时Smad4为39.64±1.63，与对照组比较均P<0.05，差异有统计学意义。可能是TGF-β1高表达，其下游的Smad4对其敏感性下降，导致TGF-β1反应性增高，李巧稚［10］在子宫颈癌的研究中亦表明，Smad4随着子宫颈病变的进展阳性率逐渐降低。上述提示Smad4 随着肿瘤发展，其表达逐渐减少，可能导致TGF-β信号通路的中断，减弱TGF-β1 的调节效应，但TGF-β1和Smad4两者在肿瘤中表达的相互影响尚不能确定。电镜下与对照组细胞比较，As2O3组细胞：很多肿瘤细胞体积皱缩减小，表面微绒毛减少或消失，细胞质中出现明显异物颗粒，线粒体早期肿大，晚期崩解，滑面内质网减少，高尔基体减少，晚期染色质边集，形成凋亡小体。上述超微结构变化表明肿瘤细胞呼吸链受损、合成蛋白质能力下降，部分坏死细胞，细胞破裂。说明三氧化二砷能够使体外培养的肠癌细胞出现坏死和凋亡等改变，具有明显的抑制肿瘤细胞作用。
综上所述，TGF-β/Smads信号通路在体外培养的肠癌HCT116细胞中存在重要分子TGF-β、Smad4的表达异常，TGF-β/Smads信号通路调节的异常很可能是肠癌发生的重要分子基础，及重要的临床分子标记物，三氧化二砷作用机制之一很可能通过改变TGF-β、Smad4在TGF-β/Smads信号通路中的传导作用，而达到抗肿瘤的作用的，具体机制有待进一步研究。
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作者简介：蔡朋朋，女，1981年出生，硕士，副主任医师（讲师），研究方向：消化道肿瘤的基础与临床。
基金项目：2012年黑龙江省教育厅项目：TGF-β/Smads信号通路在肠癌细胞HCT116中的表达及AS2O3对其作用的研究 编号12521634
论文作者:蔡朋朋,李雪松,王东红,李晶,孙智睿,孙丽慧,费
论文发表刊物:《健康世界》2015年6期供稿
论文发表时间:2015/10/29
标签：细胞论文; 肿瘤论文; 肠癌论文; 作用论文; 培养液论文; 信号论文; 对照组论文; 《健康世界》2015年6期供稿论文;