首都医科大学大兴医院儿科 北京 102600
摘要：目的 探索足月儿RDS肺组织SP-B表达。方法 选择无血缘关系的汉族足月新生儿RDS 20例作为RDS组，汉族20例其它病例作为对照组，并在年龄、体重、性别、孕母年龄、分娩方式等方面与RDS组无统计学差异。采用免疫组化技术检测SP-B蛋白在肺组织的表达。结果 RDS组足月儿肺组织SP-B蛋白表达阳性细胞数（18.5±10.7）显著低于对照组（94.9±31.8）（t＝10.191，P＜0.001）。RDS组足月儿肺组织SP-B蛋白表达阳性细胞越少，则RDS胸部X线显示严重性的级别越高，即二者具有很好的依从性。RDS组有7例SP-B蛋白缺陷。结论 肺部SP-B表达减少参与汉族足月NRDS发病，SP-B蛋白缺陷可能参与汉族足月儿RDS发病。
关键词：呼吸窘迫综合征，新生儿；表面活性蛋白B；肺表面活性物质
Expression of surfactant protein B in lung tissues of full term infants with respiratory distress syndrome（RDS） XIE Lu1，Qu Wen-Wen2，WANG Yu2，WEI Wei2，YIN Xiao-Juan2. 1. Department of Pediatrics，Daxing Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing，102600；2. Neonatal Intensive Care Unit，Bayi Children’s Hospital Affiliated to the Army General Hospital of the Chinese People’s Liberation Army. Beijing 100700，China
Corresponding author：YIN Xiao-Juan：yyinxiaojuan@163.com
［Abstract］ Objective To explore the）in lung tissues of full term infants?expression of surfactant protein-B（SP-B with neonatal respiratory distress syndrome（RDS）. Methods Unrelated 20 cases with RDS of full term infants in Han ethnic population were selected as RDS group while unrelated 20 other cases in Han ethnic population were selected as control group. There was not significant difference between two groups below items including gestational age，birth weight，gender，maternal age and mode of delivery. Expression of SP-B in lung tissue was tested with immunohistochemical technique. Results The numbers of positive cells（18.5±10.7）expressing SP-B protein in lung tissue of RDS group were also significantly lower than that（94.9±31.8）in control group（t＝10.191，P＜0.001）. The less were the positive cells expressing SP-B protein in lung tissue，the more severe were types of RDS on dependent of chest X-ray diagnostic criteria，that is，there was a good compliance among them. RDS group had seven cases with SP-B deficiency. Conclusions The lower expression of SP-B in lung tissue was involved in pathogenesis of RDS in full term infants in Han ethnic group. SP-B deficiency was impossibly involved in pathogenesis of RDS in full term infants in Han ethnic group.
［Key words］ respiratory distress syndrome，newborn；surfactant protein-B；pulmonary surfactant
新生儿呼吸窘迫综合征（Neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是肺表面活性物质（Pulmonary surfactant，PS）缺乏引起的常见危重病，此病多发生于早产儿和极低体重儿，也有一定数量的足月儿发生该病，而且近年来发现临床上越来越多的足月新生儿出现典型的NRDS临床症状及肺部X线表现。表面活性物质蛋白B（Surfactant protein B，SP-B）是PS最关键的蛋白组分，不仅能降低肺泡表面张力和防止肺泡塌陷，还具有抗菌性能［1］。我们前期研究采用酶联免疫吸附法发现足月儿NRDS发生与支气管肺泡灌洗液SP-B的表达减少有关［2］，现进一步采用免疫组化法对本院新生儿监护病房（NICU）足月新生儿RDS死亡患者肺组织SP-B的表达进行了初步研究，报告如下。
一、对象和方法
1．研究对象：于2010年04月至2011年12月在北京市汉族群体中选择彼此无血缘关系的足月RDS病例 20例作为RDS组，20例患儿均为治疗无效死亡患者，出生胎龄38+1～41+6周，体重2501～3861克，男13例，女7例，入选RDS均符合《实用新生儿学》第4版诊断标准［3］；并选择彼此无血缘关系的汉族20例其它新生儿病例作为对照组，出生胎龄38+1～41+3周，体重2515～3712克，男11例，女9例，这些病儿可患有先心病、持续肺动脉高压、坏死性小肠结肠炎、休克等疾病，并在年龄、体重、性别、孕母年龄、分娩方式等方面与RDS组无统计学差异（具体见表1）。NRDS组患儿生后30 min至3h发病，临床表现为进行性呼吸困难，血气分析示高碳酸血症和低氧血症，初次胸部X线片为Ⅰ～Ⅳ级RDS，即Ⅰ级：双肺透亮度降低，均匀散在细小颗粒和网状阴影；Ⅱ级：Ⅰ+延伸至肺野中外带的支气管充气征；Ⅲ级：肺野透亮度更加降低，心缘膈缘模糊；Ⅳ级：白肺，支气管充气征更加明显，呈秃叶树枝状（Ⅰ级4例，Ⅱ级4例，Ⅲ级5例，Ⅳ级7例）。住院期间反复使用猪肺磷脂治疗，按每次200mg/kg给药，用药3～4次，均需高频振荡机械通气，并在10～14天内死亡。RDS组和对照组在患儿死后1小时内取肺组织。以上研究对象在父母签署同意书、并经中国人民解放军陆军总医院伦理委员会同意后方可参加本研究。
2．研究方法：于患者死亡后1小时内取肺组织，置4%多聚甲醛固定，沉底后石蜡包埋成蜡块，备用于免疫组化。
（1）SP-B蛋白在肺组织的表达：采用常规SABC免疫组织化学法，DAB显色，苏木素淡染细胞核，用PBS液替换一抗作阴性对照。按试剂盒说明书操作。兔抗人SP-B多克隆抗体购自香港Abcam公司；DAB显色试剂盒及SABC兔鼠通用试剂盒购自北京中杉公司。免疫组化结果在400倍视野下观察采集图像（胞质呈棕黄色着色为阳性细胞）。
（2）SP-B蛋白阳性表达细胞的定性定量标准：胞浆染成棕黄色者为SP-B阳性表达细胞，在400倍显微镜下选择一个视野进行细胞计数。每个样本观察5张切片，每张切片选择10个视野，这样，每个样品共观察50个视野，计算出每个样品一个视野平均阳性细胞数，从而确定两组SP-B表达阳性细胞数。
（3）SP-B蛋白缺陷确定：SP-B蛋白表达阳性细胞数正常下限（个数）=均值-2个标准差（-2s）。对SP-B蛋白表达阳性细胞数明显低于对照组正常下限的个体判为SP-B蛋白缺陷。
3. 统计学分析：采用SPSS13.0软件进行统计分析，两组胎龄、出生体重、母亲年龄及肺部SP-B蛋白表达阳性细胞数等计量资料均采用两个独立样本t检验；肺部SP-B蛋白表达阳性细胞数与胸部X线诊断标准分型关系比较采用单因素方差分析；两组性别比、分娩方式等计数资料均采用c2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1． 两组肺部SP-B蛋白表达免疫组化形态学观察：SP-B蛋白位于细胞胞浆中，部分分泌至气道及肺泡表面，被DAB染成黄色，着色深浅、范围不一，因组别、疾病严重程度有差异。RDS患儿肺部SP-B蛋白表达明显少于对照组患儿，有些特别严重的RDS患者肺组织的有些部位甚至看不到SP-B蛋白表达（图1）。
三、讨论
NRDS为肺表面活性物质（PS）缺乏所致，多见于早产儿，随着新生儿医学的发展，足月儿RDS也呈上升趋势。病因多为早产儿、糖尿病母亲婴儿、剖宫产儿、围产期窒息儿、重度Rh溶血病患儿、SP-A基因变异患儿、SP-B基因缺陷患儿等等［3］。临床特征为生后数小时出现进行性呼吸困难、青紫和呼吸衰竭，遗传因素引起的RDS症状更重，特别是SP-B缺陷纯合子患者，对PS和机械通气治疗效果差，通常于生后数天内死亡［4］。病理特征为肺部出现嗜伊红透明膜和肺不胀。PS是一种脂类（90%）和蛋白（10%）的复杂混合物，分布于肺泡表面，具有降低气液界面表面张力特性，预防呼气末肺泡塌陷，同时也是肺先天防御系统的重要组成部分，有助于控制炎症和预防肺部感染［5］。
SP-B是PS最关键的蛋白组分，为特异性的疏水性肺表面活性物质结合蛋白。成熟SP-B含有2个亚基，每个亚基为79个氨基酸残基多肽链，含有3个二硫化物桥（Cys8和Cys77，Cys11和Cys71，Cys25和Cys46），两亚基Cys48形成二硫键构成同源二聚体。SP-B基因（SFTPB）位于2号染色体（2p12-p11.2），长950bp，包含10个intron和11个exon，exon 11不被翻译。exon 6和7编码成熟SP-B肽。甲状腺转录因子-1（TTF1）调节SP-B转录，SFTPB被转录成2kb mRNA，在内质网翻译成40kd 381个氨基酸残基前蛋白原，经切除信号肽和糖基化后生成42kd SP-B前体蛋白（proSP-B），转运途径高尔基体和多泡体，被蛋白水解去N端和C端，生成23～26kd和9kd proSP-B中间体，最后生成8kd 79个氨基酸残基的成熟SP-B肽，在板层小体形成18kd同源二聚体。SP-B生物学特性［6］：SP-B具有促进表面活性磷脂在气液界面吸附、扩展并与磷脂首基交联、增加磷脂单分子层的横向稳定性以及是参与板层小体形成等功能，还与SP-A、磷脂和钙离子形成管髓体、促进Ⅱ型肺泡上皮细胞摄取磷脂小囊泡、结合磷脂双分子层、具有溶膜和成融性质，促成表面活性磷脂膜在板层小体组织和包装；也参与免疫调节、对气道宿主防御和稳定起重要作用。
足月新生儿肺部SP-B表达与NRDS的关系。通常足月新生儿RDS不同于早产儿RDS，几乎不因为肺发育不成熟而引起PS不足或缺乏，因此足月新生儿RDS发生机制更可能系PS组成成分的改变而使其表面活性功能下降，从而导致NRDS的发生。本研究以足月新生儿为研究对象，RDS足月新生儿肺组织SP-B表达阳性细胞数显著低于对照组，提示足月新生儿肺部SP-B表达减少，从而导致PS表面活性功能降低，从而导致NRDS的发生。本研究还发现肺组织SP-B表达阳性细胞数越少，NRDS胸部X线诊断分型越重，有些特别严重的RDS患者肺组织的有些部位甚至看不到SP-B蛋白表达，提示肺组织SP-B表达与NRDS临床严重度有关。这与我们前期的研究以及国内报道相一致［2，7］。
足月新生儿肺部SP-B表达与遗传性SP-B的关系。本研究还发现7例胸部X线Ⅳ级RDS死亡患儿肺组织SP-B蛋白表达阳性细胞数低于对照组正常下限，判为SP-B蛋白缺陷，提示遗传性SP-B缺陷可能参与了足月新生儿RDS的发病。遗传性SP-B缺陷是一种常染色体隐性遗传病，目前可以识别40多种SP-B基因的不同突变。外显子4的121ins2突变占目前SP-B基因突变的三分之二，而余下1/3包括无义突变、错义突变、移码突变和剪接位点突变以及插入或缺失，这些突变导致SP-B蛋白完全缺失或功能丧失，引起足月新生儿生后发生RDS，呈进展性加重，临床和影像学与早产儿RDS相一致，于生后3~6月致死［8］。虽然使用表面活性剂替代和/或皮质类固醇激素治疗可瞬时或轻微改善，但肺移植是目前唯一有效的根治选择［9］。
本研究对象局限于死亡患儿，样本收集困难，导致样本量不很充足，研究结果及结论不能代表中国总体，仅只能说明肺组织SP-B 表达与研究范围的汉族足月儿RDS发病相关联，但也提示遗传性SP-B缺陷可能为足月儿RDS的遗传发病机制，需要我们继续收集标本，扩大样本量，进一步从基因水平探索足月儿RDS的发病机制。
参考文献：
［1］Ma CC，Ma S. The role of surfactant in respiratory distress syndrome. Open Respir Med J. 2012，6：44-53.
［2］谢露，王钰，曲雯雯，等. 足月新生儿呼吸窘迫综合征支气管肺泡灌洗液表面活性蛋白B的表达[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2012，6（9）：2496-2498.
［3］陈超．新生儿呼吸窘迫综合征. 见：邵肖梅，叶鸿瑁，丘小汕，主编. 实用新生儿学．4版．北京：人民卫生出版社，2011：395-398．
［4］尹晓娟，谢露，池婧涵，等. SP-B遗传缺陷导致足月儿新生儿呼吸窘迫综合征三例[J]. 中国新生儿科杂志，2011，26（4）：268-268.
［5］Halliday HL. Surfactants：past，present and future[J]. J Perinatol，2008，28（Suppl 1）：S47–56.
［6］谢露，尹晓娟. 新生儿肺表面活性物质研究新进展[J]. 中国儿童保健杂志，2012，20（3）：235-237.
［7］尹晓娟，罗分平，李爱华，等. 20例汉族新生儿呼吸窘迫综合征肺表面活性物质蛋白B遗传缺陷的研究[J]. 中华儿科杂志，2008，46（1）：9–12.
［8］Nogee LM. Genetic mechanisms of surfactant deficiency. Biol Neonate，2004，85（4）：314-318.
［9］Faro A，Hamvas A. Lung transplantation for inherited disorders of surfactant metabolism[J]. NeoReviews，2008，9（10）：e468–e476.
?基金项目：国家自然科学基金（30871397）
作者单位：1. 102600北京，首都医科大学大兴医院；2. 100700北京，中国陆军总医院附属八一儿童医院新生儿科
论文作者:谢露1,曲雯雯2,王钰2,巍巍2,范含笑2,尹晓娟
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第3期
论文发表时间:2018/4/13
标签：蛋白论文; 新生儿论文; 阳性论文; 组织论文; 汉族论文; 肺部论文; 活性论文; 《中国误诊学杂志》2018年第3期论文;