郭妍[1]2004年在《纳米生物技术治疗肝癌：p53-白蛋白纳米粒的制备和转染的研究》文中进行了进一步梳理目的：制备白蛋白纳米粒，评价白蛋白纳米粒做为p53基因载体的可行性。用p53-白蛋白纳米释控系统体外转染HepG2细胞，观察其对肝癌细胞生长的影响。 方法：应用复凝聚法制备白蛋白纳米粒，通过静电吸附作用及化学键耦连作用连接上p53表达质粒DNA，制备成p53-白蛋白释控系统。琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合情况及抵抗NDASE-Ⅰ消化的作用。将同剂量的p53-白蛋白纳米粒，p53—脂质体微粒阳性对照组与裸DNA的阴性对照组及空白的白蛋白纳米粒组分别转染至培养的HepG2细胞中，用RT-PCR及Western Blot测p53的表达并通过其对肿瘤细胞生长的影响观察其抑瘤的作用。 结果：1．粒度分析仪及电镜检测证实白蛋白纳米粒呈均匀分散的球形颗粒，平均粒径为98nm。 2．琼脂糖凝胶电泳结果显示：在PH值较小的酸性条件下，白蛋白纳米粒能有效结合p53基因并能抵抗NDASE-Ⅰ消化的作用。 3．RT—PCR显示：白蛋白纳米粒能将p53基因高效地转染入HepG2细胞中并表达。 4．细胞生长抑制曲线显示：p53-白蛋白纳米粒组能有效地抑制肿瘤细胞的生长，作用优于脂质体载体组。 结论：制备了粒径较小的白蛋白纳米粒，能有效连接上p53表达质粒DNA，并能转染HepG2细胞，有效地抑制癌细胞的生长。ANP可作为DNA转移载体。
张皓[2]2016年在《基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究》文中研究指明肺癌是目前世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且呈明显上升趋势。最新的肿瘤流行病学调查显示,男性肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤首位,女性肺癌死亡率也高居所有恶性肿瘤第二位。肺癌已经成为对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一。在本研究中,我们以肺癌为治疗目标,构建以IFN-y为目的基因的基因电路,以PEI-Fe3O4为基因载体,联合西妥昔单抗设计了靶向载基因磁性白蛋白纳米球,将分子靶向治疗、放疗和免疫基因治疗有效联合起来治疗肺癌。主要研究内容如下：第一章肿瘤治疗基因合成和表达研究：基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒的构建与鉴定及其在细胞内的诱导表达[目的]：构建pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(即p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG)真核表达质粒,并对其进行鉴定。评价其在GLC-82细胞中的诱导表达情况。[方法]：①以pUC57-Simple-cfosp为模板,将cfosp片段酶切下来连接至pYr-adshuttle-8载体得到pYr-ads-8-cfosp典核表达质粒。②以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG片段(IFNG即IFN-y的基因片段),然后将其亚克隆至pYr-adshuttle-8载体,构建pYr-ads-8-IFNG真核表达质粒。③将pUC57-SimpIe-cfosp及目的载体pYr-ads-8-IFNG双酶切,然后进行连接,构建pYr-ads-8-cfosp-IFNG真核表达质粒。④以pUC57-Simple-5HRE为模板,获得5HRE片段,并将其构建至pUC57-Simple-cfosp载体上,获得pUC57-Simple-5HRE-cfosp。再将其酶切,得到5HRE-cfosp片段,然后将其构建至pYr-adshuttle-8载体上,构建pYr-ads-8-5HRE-cfosp真核表达质粒。同时,将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-8-IFNG载体上,得到PYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG真核表达质粒。⑤以pIRES2-ZsGreenl为模板,PCR扩增IRES片段,并将其构建至pYr-ads-1-iNOS载体上,构建pYr-ads-iNOS-TRESc再以pDONR223-IFNG为模板,PCR扩增IFNG基因片段,并将其构建至pYr-ads-iNOS-IRES载体上,得到pYr-ads-iNOS-IFNG。⑥ pUC57-Simple-cfosp为模板,PCR扩增cfosp片段,然后将其构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,得到pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑦将5HRE-cfosp片段,构建至pYr-ads-iNOS-IFNG载体上,获得PYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒。⑧每个步骤后均需挑取阳性克隆,酶切测序鉴定后进行下一步构建,最后大量抽提质粒。⑨将pYr-ads-8-cfosp、pYr-ads-8-IFNG、pYr-ads-8-cfosp-IFNG、 pYr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG、pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG、pYr-ads-iNOS-IFNG、 pYr-ads-5HRE-cfosp-iNOS-IFNG分别转染GLC-82细胞,用2Gy X射线处理后,用QT-PCR分析IFN-y和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)基因的表达量。评价基因电路的放大作用及乏氧序列的增强作用。⑩将P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG质粒转染GLC-82细胞后,2Gy剂量的X射线照射后的6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。分别取转染后的细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射射线照射后24h收集细胞,分析IFN-y和iNOS基因的表达量。[结果]：①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,测序发现插入片段序列无改变,并且开放读码框正确。②用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的相对表达量,结果表明P5HRE-cfosp-iNOS-IFNG与其他质粒相比,表达量最高,与没有乏氧序列的组(⑥pYr-ads-cfosp-iNOS-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.46倍,iNOS的表达量高了2.11倍(p<0.05)。与没有基因电路的组(⑤Yr-ads-8-5HRE-cfosp-IFNG)相比,IFN-y的表达量高了约1.32倍(p<0.05)。③在处理后6h、12h、24h、48h、72h集细胞。用QT-PCR检测IFN-γ和iNOS基因的表达量发现,在诱导6h,IFN-γ和iNOS基因的表达量即开始升高,24h升到最高值。在24h之前,IFN-γ iNOS基因的表达量随时间的延长而增加,之后逐渐减低。④细胞给予0、1、2、4、8Gy五种剂量进行X射线照射后24h用QT-PCR检测IFN-y和iNOS基因的表达量发现,2Gy组的表达量最高,其IFN-y的表达量是1Gy组的4.37倍,4Gy组的1.52倍,8Gy组的2.05倍(p<0.05)。其iNOS的表达量是1Gy组的4.96倍,4Gy组的1.56倍,8Gy组的2.17倍(p<0.05)。[结论1：①成功构建了基于乏氧/辐射双调控基因电路技术的p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG真核表达质粒及中间各用于比较的质粒。并且酶切鉴定、测序鉴定均证实构建成功。②用QT-PCR检测了C-fos启动子的时效性,C-fos启动子在2Gy的X射线诱导24小时后,靶基因的表达量最高。评价了p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG在肺癌细胞内的诱导表达,验证了HRE在缺氧环境中对辐射启动子的增强作用,和基因电路技术的有效性。第二章C225-Fe304/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG(靶向载基因磁性白蛋白纳米球)的制备及靶向性研究[目的]：①制备表征Fe3O4磁性纳米粒,用PEI修饰Fe3O4磁性纳米粒并进行表征,研究PEI-Fe3O4复合物作为基因载体的可行性。②制备载基因磁性白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球。③鉴定靶向载基因磁性白蛋白纳米球的免疫特性(即靶向性)并观察其转染效率。④从体内外水平,探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82细胞的靶向效应。[方法]：①采用化学共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒,聚乙烯亚胺(PEI)对其进行表面修饰。②采用透射电镜(transmission electron microscope, TEM), ZETA SIZER3000激光粒度分析仪,傅立叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)对修饰前后纳米粒进行表征。③琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Fe3O4结合DNA的情况。利用pEGFP-Cl观察PEI-Fe3O4介导外源基因转染的效率。④采用去溶剂化-交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,用异型双功能交联剂SPDP耦连纳米球和西妥昔单抗(C225),制备成靶向载基因磁性白蛋白纳米球,运用TEM^ ZETA SIZER3000激光粒度分析仪对其表征,在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的粒径,评价其稳定性。动态测定其体外释放基因速率。用硫氰酸盐分光光度法测其含Fe量。⑤用靶向载基因磁性白蛋白纳米球转染GLC-82细胞,观察其转染效率。⑥运用玻片凝集实验、免疫荧光染色实验鉴定纳米球的免疫特性。⑦采用普鲁士蓝染色、细胞免疫荧光实验及细胞MRI实验观察靶向载基因磁性白蛋白纳米球与人肺癌细胞体外特异性结合的能力。⑧建立裸鼠肺癌移植瘤动物模型,待肿瘤直径达0.5cm左右用于实验,对裸鼠进行MRI。将裸鼠分成C225靶向组、非C225靶向组和C225抑制组。分别经尾静脉注射靶向载基因磁性白蛋白纳米球、非靶向载基因磁性白蛋白纳米球和靶向载基因磁性白蛋白纳米球+C225。在注射前及注射后2h、8h、24h、72h分别进行7.0 Tesla超高场强实验动物MRI系统成像,观察不同时间点肿瘤的信号变化,成像序列包括SE-TIWI、SE-T2WI、GRE-T2*WI。量化分析肿瘤组织信号改变的程度、范围、随时间的改变。测量感兴趣区(肿瘤、肌肉组织)T2WI及T2*WI信号强度,计算信号变化率。最后用SPSS 18.0统计软件进行统计、分析。病理组织学检查：包括常规HE染色、普鲁士蓝染色。[结果]：①制备的Fe3O4和PEI-Fe3O4磁性纳米粒表征：TEM检测显示磁性纳米粒电子密度高、大小较一致,并且修饰前后形态大小差别不大；FTIR结果显示了修饰后纳米粒的特征峰值,证明了PEI的成功吸附；激光粒度分析仪电位分析显示在pH为7的中性环境,Fe3O4纳米粒的zeta电位值为0±0.5mV,而PEI修饰后纳米粒子的电位值为36.3±0.6mV。②琼脂糖凝胶电泳检测到PEI-Fe3O4与DNA结合情况良好；PEI-Fe3O4可将外源基因转染至GLC-82细胞并高效表达。③自制的空载白蛋白纳米球及靶向载基因磁性白蛋白纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在靶向载基因磁性白蛋白纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。ZETA SIZER3000激光粒度分析仪显示载基因磁性白蛋白纳米球的水合粒径为189.5±2.4nm；靶向载基因磁性纳米球的水和粒径约为211.9±3.1nm。在pH为7的中性环境中,载基因磁性白蛋白纳米球的zeta电位值是-37.9±0.4 mV,而耦联了C225的靶向载基因磁性白蛋白纳米球的电位值为-40.2±0.7 mV。在不同时间点测其在PBS缓冲液和RPMI1640培养液中的纳米球粒径差别不大,稳定性良好。④体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料15小时释放基因为96.45%,曲线平缓；硫氰酸盐分光光度法测含Fe量平均在2.2 mg/ml;转染实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能够有效转染GLC-82细胞,且转染效率高于非靶向载基因磁性白蛋白纳米球。⑤靶向载基因磁性白蛋白纳米球玻片凝集实验与对照组相比,靶向载基因磁性白蛋白纳米球组与抗血清孵育后观察到明显地凝集现象；免疫荧光染色显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球表面发出明亮绿色荧光,而对照组未观察到荧光。⑥普鲁士蓝染色结果显示在靶向组与GLC-82细胞孵育后,细胞内有大量明显蓝染的铁颗粒存在,而非靶向组细胞内少见；细胞免疫荧光染色显示靶向组细胞的表面有绿色荧光,而非靶向组未观察到绿色荧光；细胞MRI实验结果显示靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度不同程度的降低,而非靶向组与GLC-82细胞共孵育后在T2WI上信号强度无明显降低。⑦在体MRI成像结果显示,C225靶向组注射后肿瘤组织不同时间点的T2WI、 T2*WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异(p<0.05)。而非C225靶向组和C225抑制组在注射后8h和24h两个时间点的信号亦有轻度下降,但下降幅度较C225靶向组小,且持续时间较靶向组短。不同时间点的T2弛豫时间,从24h时间点开始,C225靶向组与非靶向组和C225抑制组比较具有明显差异,结果有统计学意义(p<0.05)。⑧常规HE染色结果表明所建立的裸鼠荷肺癌皮下移植瘤动物模型符合小鼠肺癌的形态结构。普鲁士蓝染色结果显示：C225靶向组肿瘤组织内见较多的蓝染的颗粒,代表Fe颗粒多；而非C225靶向组和C225抑制组内少见蓝染的Fe颗粒存在。[结论]：①应用化学共沉淀法已成功制备了Fe304磁性纳米粒且PEI成功地修饰于Fe304磁性纳米粒。②修饰后的PEI-Fe3O4磁性纳米粒可以作为基因的载体。③成功制备了白蛋白纳米球、载基因磁性白蛋白纳米球,成功耦连了西妥昔单抗与载基因磁性白蛋白纳米球。④靶向载基因磁性白蛋白纳米球具有缓释作用,并且能高效转染人肺癌细胞GLC-82。⑤细胞实验和体内磁共振实验都说明靶向载基因磁性白蛋白纳米球对人肺癌细胞GLC-82具有良好的靶向效应。第叁章基于基因和分子靶向治疗技术的靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的体内外实验研究[目的]：①体外水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗人肺癌的作用。②通过动物实验,从体内水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球对肺癌的治疗作用。[方法]：①体外采用CCK8及流式细胞技术测定靶向载基因磁性白蛋白纳米球体外治疗肺癌的效果。并用透射电镜观察细胞超微结构的变化。②建立裸鼠肺癌移植瘤模型,将靶向载基因磁性白蛋白纳米球经尾静脉注射入裸鼠,经辐射3次,6周后处死裸鼠。计算肿瘤体积抑制率和质量抑制率,制作肿瘤组织标本,进行常规病理学检查。③通过血清生化检查和血常规检测及各内脏器官组织病理学观察初步评价靶向辐射基因联合治疗的安全性。[结果]：①CCK8实验结果显示靶向载基因磁性白蛋白纳米球能明显抑制人肺癌细胞GLC-82的增殖,FCM检测显示其能诱导GLC-82细胞的凋亡,且其效果较其他组显着。透射电镜下可观察到各组细胞均有不同程度的凋亡,细胞内可见磁性材料沉积。②靶向辐射基因联合治疗组的肿瘤质量抑制率和肿瘤体积抑制率分别为82.54%和85.72%,明显高于单抗治疗组(36.51%、34.33%)、辐射放疗组(42.06%、40.89%)、辐射基因联合治疗组(64.29%、65.64%)和靶向辐射联合治疗组(70.63%、72.57%)(p<0.05)。③各治疗组肿瘤有不同程度坏死,部分坏死灶可见炎性细胞浸润。其中靶向辐射基因联合治疗组坏死程度最严重。可见大片坏死灶,坏死区域呈红染,肿瘤细胞崩解,胞核消失,部分细胞核固缩。其它治疗组也均有不同程度的坏死,程度较靶向辐射基因联合治疗组轻,但也可见肿瘤细胞的密度下降,细胞排列松散,胞浆呈红染。阴性对照组与各治疗组的心肝脾肺肾等内脏组织均没有发现明显的病理学变化。④建模前和治疗结束后各组裸鼠血细胞计数,各实验组与阴性对照组及建模前之间均无统计学差异(p>0.05)。提示建模和各治疗对骨髓造血系统无明显抑制作用。[结论]：①靶向辐射基因联合治疗能显着抑制培养人肺癌细胞GLC-82的增殖,诱导细胞凋亡。②分子靶向治疗、放疗和基因治疗叁者联合治疗肺癌具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌的生长,效果优于单一治疗也优于两两联合治疗。第四章靶向载基因磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的分子机制研究[目的]：从分子水平探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制。[方法]：①采用免疫组织化学方法检测治疗后各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、 survivin、VEGF、EGFR、PCNA、p53、Ki67蛋白的表达。②采用western blot检测各治疗组中Bcl-2、Ki67、survivin、caspase-3与caspase-8的表达量,使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。从分子水平上探讨靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的分子机制。[结果]：①单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bax蛋白均有升高,但靶向辐射基因联合治疗组上升最明显。而单抗治疗组、辐射放疗组、辐射基因联合治疗组、靶向辐射联合治疗组、靶向辐射基因联合治疗组的Bcl-2、Ki67、p53、PCNA和survivin蛋白均有下降,其中靶向辐射基因联合治疗组下降得最明显。② Wesrern blot的结果显示,各治疗组与阴性对照组相比Bcl-2、Ki67、survivin均有下调,而caspase-3与caspase-8的表达上调。其中以靶向辐射基因联合治疗组最为显着。[结论]：靶向载基因磁性白蛋白纳米球介导的分子靶向联合基因治疗肺癌的机制可能与下调PCNA、Ki67蛋白表达而抑制肿瘤增殖；抑制Bcl-2、p53、survivin蛋白表达,上调Bax蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤新生血管的形成,抑制EGFR表达有关。
李刚[3]2008年在《阿霉素白蛋白纳米粒介入治疗肝癌实验研究》文中认为纳米粒作为药物载体,具有颗粒小,比表面积大,粘附性能好等特性,容易透过血管壁进入靶组织间隙,增加药物与肿瘤接触时间与接触面积。由于比表面积越大,溶解性能越好,纳米粒作药物载体能大大提高药物的生物利用度,从而提高了疗效,降低了花费。纳米粒载体因体积超微小,可以直接作用于细胞,通过控制药物与靶基因的持续缓慢释放可有效延长作用时间,维持有效药物浓度,并可提高基因转染效率和转染产物的生物利用度。在保证疗效的前提下,可减少给药剂量,减轻或避免毒副反应,并提高药物及基因的稳定性,形成较高的局部浓度。实验表明,磁性阿霉素白蛋白纳米粒,在外加磁场作用下,60%以上分布于动物肝脏,且肝癌明显受到抑制,动物生存期延长。但是外加磁场的强度、定位难于把握,有一定应用局限性,如何选择一种精准的输送方法一直是纳米药物靶向治疗的研究课题。经过20多年的发展,介入治疗已成为内外科治疗之外的第叁种治疗方法,其中以肝动脉选择性栓塞化疗为主的介入技术已成为肝癌非手术治疗的首选方法。然而,介入治疗的疗效也远非理想,如何改进方法,提高患者生存期乃介入治疗的重要研究方向。本研究以白蛋白纳米粒作为药物载体,与抗癌药物阿霉素结合,制备阿霉素白蛋白纳米粒,并通过的介入输送技术,将纳米药物直接注入肝癌供血动脉内治疗肝癌,希望通过纳米生物技术与介入治疗技术直接结合,提高肝癌治疗的疗效。研究内容包括:①阿霉素白蛋白纳米粒的制备及性质研究;②阿霉素白蛋白纳米粒的生物相容性研究;③阿霉素白蛋白纳米粒药物代谢动力学研究;④阿霉素白蛋白纳米粒介入治疗肝癌。阿霉素白蛋白纳米粒制备及性质的研究,获得了达到静脉用药标准的阿霉素白蛋白载药纳米粒,其平均粒径201±26mm,载药量53.62±5.34ug/mg,包封率96.61±3.73%,平均回收率为99.55%±1.62%,而且体外释放实验证明阿霉素载药纳米粒具有明显缓释性。阿霉素白蛋白纳米粒的生物相容性实验结果显示,此纳米粒载体无毒性,无抑菌性,不引起溶血,无热原理性,对皮肤无刺激性,肌肉长期植入试验中动物伤口愈合好,组织反应小,证明材料有良好的细胞和组织相容性。阿霉素白蛋白纳米粒药物代谢动力学研究证实,在平均血药浓度—时间曲线中,白蛋白阿霉素纳米粒下降的斜率比阿霉素的大;白蛋白阿霉素钠米粒血药浓度较长时间维持在一个较稳定水平0.0778±0.0015mg/l,而阿霉素的血药浓度呈缓慢下降趋势。此外,白蛋白阿霉素纳米粒的清除率是阿霉素的0.5369倍,白蛋白阿霉素纳米粒的血药浓度一时间曲线下面积(AUC)是阿霉素的1.3679倍。在研究阿霉素白蛋白纳米粒的制备,生物相容性及药代动力学的基础上,我们进一步探讨了应用介入技术下阿霉素白蛋白纳米粒对人肝癌大白兔移植瘤的治疗作用。结果表明,游离阿霉素组(B组)与阿霉素白蛋白纳米粒组(C组)肿瘤增长显着减缓(P＜0.01),但B组、C组之间比较也有明显统计学差异(P＜0.05)。对照组(A组)平均生存期为27天,B组平均生存期38天,C组为54天。统计学分析表明,B组和C组与A相比,生存期显着延长(P＜0.01);而C组生存期最长,显着长于B组(P＜0.01)。通过本研究,我们认为阿霉素白蛋白纳米粒是安全无毒,无热原性,有良好的细胞和组织相容性。而且具有明显缓释性,符合纳米粒载体抗癌药物的要求,应用介入技术可将阿霉素白蛋白纳米粒准确释放在靶组织内,提高了治疗肝癌的疗效。本研究作为技术平台的基础,还可应用于其他基因药物和其他恶性肿瘤治疗的研究。
王玲[4]2016年在《载基因荧光金微泡联合US/NIR双模态成像、双辐照—光热—基因治疗肝癌及其机制的研究》文中指出第一部分纳米金棒、荧光金微泡及载基因荧光金微泡的制备、表征及生物相容性研究[目的]研究纳米金棒(gold-nanorods, AuNRs)、荧光金微泡(AuNRs loaded fluorescent microbubbles, fluorescent AuMBs)和载基因荧光金微泡(gene-loaded fluorescent AuMBs)的制备、表征、生物相容性及光热动力学特性,为后续的肝癌的双模态成像和综合治疗研究奠定基础。[方法]①以酚类物质为还原剂的改良的无种子法制备AuNRs,运用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)、马尔文激光粒度仪(Malvin laser particle size analyzer)、紫外可见近红外分光光度计对其大小、形态、分散性、水合粒径、zeta电位及紫外吸收光谱进行表征；②采用薄膜水化-机械震荡法制备NIR797标记的荧光金微泡；运用TEM和光学显微镜观察荧光金微泡的形态、分散度及均一性；利用马尔文激光粒度仪检测其平均水合粒径及表面电位；运用紫外可见近红外分光光度计检测近红外荧光染料偶联状况；之后通过静电吸附作用进一步结合质粒DNA制备载基因荧光金微泡；③采用MTT (methyl thiazolyl tetrazolium)试验和体外溶血试验检测载基因荧光金微泡的体外生物相容性和血液相容性；④在近红外(near-infrared, NIR)激光器的作用下观察不同浓度的AuNRs和载基因荧光金微泡的体外光热升温情况。[结果]①制备的AuNRs在TEM下显示为长棒状、大小较一致、分散性好；其平均水合粒径长径约为110nm,短径约为22nm,长径比约为5；平均zeta电位值为+25.6 mV；紫外吸收光谱显示AuNRs的横向吸收峰在520nm附近,纵向吸收峰在880nm附近；②自制的荧光金微泡TEM下呈圆球形外观,外包被一薄层脂质膜,内充有透亮的SF6气体,磷脂薄膜内外侧及膜上可见纳米金棒附着。平均水合粒径约为1.8um,平均zeta电位值为-17.7mV。紫外近红外吸收光谱显示NIR797被偶联上。生物相容性和血液相容性试验显示载基因荧光金微泡的毒性评价为0-1级,无毒性；无溶血发生；③在功率为2.5 W,波长为808 nm的NIR激光照射下,不同浓度的纳米金棒能升温到38℃-53℃不等,且加热30 min后温度能恒定在某一水平不发生改变；而在同等条件的NIR激光照射下,载基因荧光金微泡溶液能升温到39.5℃-51℃不等,且加热30min后温度能恒定在某一水平不发生改变。[结论]①应用以酚类物质为还原剂的改良的无种子法成功制备了AuNRs;②应用薄膜水化-机械震荡法成功制备了NIR797标记的荧光金微泡并在此基础上进一步制备了具有良好生物相容性的载基因荧光金微泡；③自制的AuNRs和载基因荧光金微泡具有良好的光热吸收特性,具备吸收光能而升温并达到恒温(44℃)的能力,可用于肿瘤的近红外光热疗。第二部分pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK质粒构建及鉴定[目的]①构建用于肝癌基因治疗的、以COX2p为启动子,融合自杀基因(yCDglyTK)为治疗基因的重组真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK;②检测超声靶向微泡击破(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技术增强载基因金微泡的基因转染能力,评价两者联合作为基因转运载体的可行性。[方法]①合成人COX2启动子,用MluI+EcoRI酶切pUC19-Kan-COX2p,获得COX2p片段,然后将其构建至pCDNA3.1-EGFP载体上,取代原有的CMVp片段,构建pCDNA3.1-COX2p-EGFP;②将yCDglyTK构建至pDoubleEx-EGFP,获得pDoubleEx-EGFP-yCDglyTK。用COX2启动子替换pDoubleEx-EGFP-yCDglyTK上的CMV启动子,获得pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK。所有构建的重组真核质粒都经过测序和酶切鉴定；③载基因金微泡联合UTMD技术体外转染人肝癌Bel-7402细胞(裸质粒、Lipofectamine 2000和裸质粒联合UTMD作为对照),并用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染情况和检测转染效率。[结果]①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入载体位置正确,测序发现插入片段序列无改变,且开放读码框正确。②载基因金微泡联合UTMD技术体外转染Bel-7402细胞,可将外源基因传递到细胞内,转染6h后细胞内即可出现绿色荧光,48h达最强,其转染效率可达79.73%。[结论]①pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK抗肿瘤基因质粒被成功构建并被鉴定,为后续肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。②载基因金微泡联合UTMD技术可将外源性基因成功转染至Bel-7402细胞系并高效表达,为基因治疗实验中pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK质粒的细胞转染提供了有效的基因载体。第叁部分载基因荧光金微泡的US/NIRF双模态成像研究[目的]①从体外水平观察载基因荧光金微泡的超声造影成像及UTMD试验；②在体水平观察载基因荧光金微泡在正常兔肾和人肝癌裸鼠移植瘤的超声造影成像；③从体外水平观察载基因荧光金微泡的近红外荧光(near-infrared fluorescence, NIRF)成像；④在体水平观察载基因荧光金微泡联合UTMD在人肝癌裸鼠移植瘤的NIRF成像。[方法]①体外超声造影成像：采用自制的体外超声成像模型进行。直径2mm的塑胶管被固定在盛有1升脱气水的水槽中；超声探头紧贴管子表面垂直放置；充满管腔内的脱气水二维超声图像首先被采集,随后不同浓度的载基因荧光金微泡和临床经济可得的声诺维(SonoVue(?))造影剂随机从管子的一端注入,注入的同时启动造影模式(Contrast-Tuned Imaging, CnTITM)对流动的微气泡进行超声造影成像。待造影图像达最强时,采用治疗性超声辐照管腔,随后对辐照后的管腔进行超声造影观察；②体内超声造影成像：首先经兔耳缘静脉注射载基因荧光金微泡对正常兔肾进行超声造影成像,SonoVue造影剂用作对比。随后经荷瘤成功的裸鼠尾静脉注射载基因荧光金微泡对肝癌移植瘤进行超声造影成像。体内、外超声造影成像均采用临床用MyLab Twice超声诊断仪,LA332探头(百胜公司,意大利),所有图像均被采集和存贮,并采用Image J软件对图像感兴趣区(ROI)的平均灰度值进行定量分析,并描绘时间-强度曲线。SPSS 18.0统计软件用于统计分析；③体外NIRF成像：不同浓度的载基因荧光金微泡置于Eppendorf管后进行NIRF扫描,SonoVue(?)造影剂和生理盐水用作对比：④体内NIRF成像：裸鼠移植瘤被随机分为UTMD组和非JTMD组,前者于造影剂注入的同时外加超声辐照肿瘤区,两组均于造影剂注入后0h、1h、2h、4h、6h、24h和48h进行NIRF扫描。另于实验结束后颈椎脱臼处死裸鼠,摘取裸鼠心、脑、肝、脾、肺、肾、小肠及肿瘤组织进行活体脏器离体NIRF扫描。体内外NIRF成像均采用近红外活体多光谱成像分析系统(美国CRi公司, Maestro系统),NIR序列激发(670 nm-900 nm或740 nm-950nm,间隔10 nm)。特异性信号应用MaestroTM EX 2.10软件进行光谱分离。[结果]①体外超声造影显示,相比脱气水的无回声,载基因荧光金微泡和SonoVue(?)注入后管腔均显示为强回声,两者回声强度相似,且均呈现为浓度依赖性的回声增加。体外UTMD试验显示,超声辐照后管腔强回声瞬时变成了无回声；②正常兔肾超声造影显示,载基因荧光金微泡能够对兔肾进行有效的超声造影增强显像,造影效果和SonoVue(?)相似；裸鼠移植瘤超声造影显示,载基因荧光金微泡注入1s左右时肿瘤声像图即开始出现增强,12s左右达最强,大约1 min后开始慢慢减退；③体外NIRF成像显示,不同浓度的载基因荧光金微泡组均可探测到明亮的荧光信号,且随着造影剂浓度的增加,其荧光信号强度逐渐增强。而SonoVue(?)和生理盐水组则探测不到任何荧光信号；④体内NIRF成像显示,联合UTMD组在整个观察时间段内肿瘤区均能探测到荧光信号,而未联合UTMD组肿瘤区仅于造影剂注入后一段时间内观察到荧光信号,1h以后的观察时间段内均未探测到荧光信号。活体脏器离体NIRF成像显示辐照组肿瘤区可探及荧光信号,而非辐照组肿瘤区探测不到。[结论]①载基因荧光金微泡同时具有超声对比增强和近红外荧光成像的能力,可作为US/NIRF双模态影像对比剂用于肿瘤诊断成像；②UTMD技术被证实能有效击破微泡并将所载物质传递到靶区,因此为后续的超声辐照下的裸鼠移植瘤的靶向治疗实验提供了可行性的依据。第四部分载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因治疗肝癌的体内外实验及其机制研究[目的]研究载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因对肝癌的体内外治疗作用,并从分子水平上探讨其治疗机制。[方法]①将Bel-7402细胞接种在6孔板中,随机分成以下5组：(1)阴性对照组；(2)载基因荧光金微泡组(基因治疗组)；(3)载基因荧光金微泡+NIR辐照组(光热-基因治疗组)；(4)载基因荧光金微泡+US辐照组(US-基因治疗组)；(5)载基因荧光金微泡+US/NIR双辐照组(双辐照-光热-基因治疗组)。5组细胞分别处理后48 h,利用CCK-8法和流式细胞术(FCM)评估体外治疗实验治疗效果；②荷瘤裸鼠随机分成5组(5只／组),分组同上。尾静脉注射载基因荧光金微泡后按体外实验要求对每组动物实施治疗。治疗后每5天称重一次裸鼠并观察肿瘤的生长情况,每周重复一次治疗,共4次。30天后处死裸鼠,通过肿瘤体积抑制率、裸鼠体重、瘤组织及内脏器官组织切片HE染色评估抑瘤效果；采用免疫组织化学方法、Western blot和实时荧光定量PCR检测瘤组织中与凋亡相关的指标(如Survivin、Bax、Bcl-2和P53)。[结果]①CCK-8结果显示对照组,基因治疗组、光热-基因治疗组、US-基因治疗组和双辐照-光热-基因治疗组的平均细胞增殖率分别是100%、73.19%、45.97%、31.24%和18.56%。相对应的平均凋亡率分别为4.19%、14.2%、26.04%、38.94%和50.6%。细胞电镜检测发现,各治疗组细胞均出现了不同的凋亡形态学变化,但双辐照-光热-基因叁联靶向治疗组细胞呈现了较为明显的凋亡形态学变化；②体内抑瘤实验结果显示双辐照-光热-基因治疗组的平均肿瘤体积抑制率高达97.03%,较其它各组有统计学差异(P<0.05),而裸鼠体重较其它组没有明显减轻。HE染色病理组织学检测显示所有肿瘤组织均出现不同程度的坏死,其中US/NIR双辐照-光热-基因治疗组坏死程度最严重；而各组裸鼠内脏器官未出现病理改变。免疫组化结果显示,与对照组相比,各治疗组的Bcl-2、P53和Survivin表达均有所减弱,而Bax表达有所增强。实时定量PCR和Western blot检测结果示双辐照-光热-基因叁联靶向治疗组能够明显下调Bcl-2, P53和Surviv in的mRNA及蛋白的表达,上调Bax的mRNA及蛋白的表达。[结论]载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因治疗肝癌,能够发挥协同增效作用,有效抑制肝癌细胞的增殖和肿瘤组织的生长。
赵青青[5]2010年在《壳聚糖/聚乙烯亚胺构建新型非病毒基因载体及其评价》文中研究表明目的:依据载体材料聚乙烯亚胺(PEI)和壳聚糖的自身特点,构建PEI修饰的壳聚糖,并进一步连接靶向性多肽,通过物理化学和生物学手段评价新型载体的基本性能、基因转染效率、安全性与体内药效。方法:1、孵育法制备PEI/壳聚糖/DNA纳米粒,考察不同N/P下纳米粒的形态、粒径、分布及与DNA的结合程度。MTT法考察对HeLa细胞的毒性,转染试验考察复合纳米粒的转染效率,以获得PEI,壳聚糖,DNA的最佳配比。2、合成法制备PEI/壳聚糖新型材料(CP)。考察材料及纳米粒在HeLa、A549、HepG2叁种细胞的毒性。测定纳米粒的粒径,电位及凝胶电泳下与DNA的结合程度。采用虫荧光素酶质粒pGL3及绿荧光蛋白EGFP质粒考察CP在HeLa、A549、HepG2叁种细胞的转染,并考察其入胞机制。3、合成法制备靶向性多肽/PEI/壳聚糖新型材料(CPT),考察其在不同细胞上转染效率的差异及加入多肽后的竞争性抑制实验。4、将CP,CPT携载趋化性细胞因子CCL22质粒和白介素IL-12质粒。分别采用ex vivo和in vivo的方法,考察载体携载治疗基因对H22鼠源肝肿瘤的抑制效果。结果:当PEI/壳聚糖/DNA的N/P为10:4:1时,孵育法制得的复合纳米粒有较高的生物安全性及转染效率,且血清对复合纳米粒转染效果影响不大。通过合成反应成功地将小分子PEI连接在壳聚糖上形成新型材料,此材料在叁种细胞上均未显示毒性,与PEI 25KDa相比,能够长时间地高效转染。结果显示CP/DNA的入胞为能量依赖型,转染4小时后即可入核。连接有靶向肽段的CPT在特异性的肝癌细胞HepG2上表达强于其他肿瘤细胞,有一定的靶向效果。当加入竞争性多肽后,转染效率呈现一定程度的降低。在ex vivo和in vivo实验中,携载治疗基因的CP和CPT均成功地抑制了肿瘤细胞的生长,显示显着的抑瘤效果。结论:采用壳聚糖和聚乙烯亚胺构建高效低毒新型载体,在基因治疗中显示了一定的效果,具有很好的应用潜力。
刘媛媛[6]2015年在《基于普鲁兰多糖的纳米药物递送系统靶向抗肝癌作用研究》文中研究指明目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,且有逐年上升趋势。化疗是治疗肝癌的常用方法之一,然而大部分肝癌易对化疗药物产生多药耐药性,从而严重限制了其在临床上的应用。因此,探索有效的肝癌治疗策略意义重大。普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵产生的水溶性多糖,具有许多优良的生物学性质,还是肝癌细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的天然配体,可以用作肝癌靶向载体材料。本研究构建了两种基于普鲁兰多糖的肝癌靶向纳米共载体系,用于不同作用机制的抗肿瘤药物或基因与化疗药物的有效共载,以期联合多种治疗方法实现对肝癌的高效作用。研究方法:第一部分:合成p H敏感的普鲁兰多糖衍生物URPA;将抗肿瘤药物甲氨蝶呤(MTX)以酯键与URPA偶联,形成高分子前药MTX-URPA;采用红外光谱(IR)与核磁共振氢谱(1H NMR)对URPA与MTX-URPA进行化学结构表征。利用自组装技术制备MTX-URPA前药型纳米粒;将抗血管生成药物康普瑞汀(CA4)物理包埋于MTX-URPA纳米粒;采用透射电镜(TEM)观察纳米粒的形貌;采用动态激光散射法检测其粒径;采用Zeta电位测定仪考察其表面荷电性质;采用紫外分光光度法(UV)考察纳米粒的载药能力。利用MTT法检测载药纳米粒对肝癌Hep G2细胞的毒性,并通过流式细胞术检测其在细胞中的摄取量。构建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,采用高效液相色谱法(HPLC)考察尾静脉注射给药后荷瘤小鼠体内MTX与CA4的血药浓度与组织分布及其肿瘤生长情况与肿瘤组织中血管密度,综合评价该纳米共载体系的抗肿瘤活性。第二部分:通过迈克尔加成反应合成聚氨基酯PBAE。以绿色荧光蛋白质粒(p EGFP)为模型基因,制备PBAE/p EGFP纳米复合物;采用琼脂糖凝胶电泳考察两者的复合情况,确定最佳PBAE/p EGFP质量比。将MTX通过酯键与普鲁兰多糖偶联形成高分子前药MTX-PL,采用IR与1H NMR技术对其进行化学结构表征,采用UV法检测前药分子中MTX的含量。将MTX-PL吸附包裹于PBAE/p EGFP纳米复合物的表面,形成亲水多糖外壳,制备纳米共载体系。采用TEM观察纳米体系的形貌;采用动态激光散射法检测其粒径与粒径分布;利用Zeta电位测定仪考察其表面荷电性质。采用激光共聚焦显微镜与流式细胞术考察纳米共载体系对Hep G2细胞的亲和性以及p EGFP在细胞中的转染效率;采用CCK-8试剂盒检测纳米共载体系的细胞毒性;通过小动物活体成像技术观察纳米共载体系在Hep G2荷瘤小鼠体内的分布,评价其对肝癌的靶向作用。结果:第一部分:成功合成了URPA,其中尿刊酰基取代度为5.2%。URPA具有显着的p H敏感性,响应p H值为6.5。MTX高效偶联于URPA多糖骨架,形成高分子前药MTX-URPA;MTX的含量约为17.8%。成功制备了球状形态的MTX-URPA纳米粒,平均粒径为187.1 nm;该纳米粒表现出对肝癌Hep G2细胞的高亲和性。CA4被包载于MTX-URPA纳米粒中,表现出显着的p H敏感体外释药特征。体外及动物体内实验均显示该纳米共载体系能够实现两种治疗剂的有序释放,并有效蓄积于肝癌PLC/PRF/5荷瘤小鼠的肿瘤病灶,还具有显着增强的抑瘤效应与肿瘤血管生成抑制作用,有利于对肝癌的靶向联合治疗。第二部分:成功合成了PBAE与MTX-PL,并对其化学结构进行了表征;MTX-PL分子中MTX的含量约为15.2%。PBAE表现出对p EGFP高效的复合压缩能力;制备PBAE/p EGFP纳米复合物的最佳质量比为50/1。MTX-PL成功包覆于基因纳米复合物的表面,形成具有“核壳结构”的MTX-PL/PBAE/p EGFP纳米粒,从而实现了基因与化疗药物的有效共载。共载纳米粒的平均粒径为172.9 nm,分布较均匀,表面呈电中性。通过纳米共载体系的携载,实现了p EGFP在Hep G2细胞中的高效转染以及对肝癌细胞生长的显着抑制。尾静脉注射给药后24 h,MTX-PL/PBAE/p EGFP纳米粒主要分布于Hep G2荷瘤小鼠的肿瘤组织,具有较好的肝癌靶向性。结论:本研究设计并构建了两种基于普鲁兰多糖的肝癌靶向纳米药物或基因/药物共载体系。一种是携载血管生成抑制剂与化疗药物的纳米共载体系,实现了对两种不同作用机制药物的肝癌靶向递送以及高效的抗肝癌协同作用。另一种是携载基因(模型)与化疗药物的纳米共载体系,实现了基因与药物的高效共载、细胞水平的协同作用以及动物体内的肝癌靶向递送。这两种纳米共载体系的构建有利于对肝癌的联合治疗,为解决临床肝癌治疗难题提供了新的策略。
聂宇[7]2007年在《可静脉注射新型纳米复合物载IL-18基因传递系统的研究》文中研究说明人类基因组计划的顺利完成，加速了功能基因的阐明和疾病相关基因的发现，也加深了人类从医学和生理学角度对自身的认识，使方兴未艾的基因治疗，成为21世纪生物医药领域的研究热点。随着肿瘤发生发展的分子机制研究不断深入，人们逐渐认识到肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的复杂过程。其中细胞因子是一类由免疫细胞(淋巴细胞、单核巨唾细胞等)和相关细胞(成纤维细胞、内皮细胞等)产生的调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子，能激发、增强机体产生显着的抗肿瘤免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的，因此在肿瘤免疫基因治疗中已经被广泛用于实验治疗研究。但如果这类蛋白全身性给药，往往会因为外源性蛋白的免疫原性导致过于强烈的免疫反应而产生毒副反应。DNA疫苗由来自病原微生物或肿瘤细胞有编码基因的非复制型DNA质粒组成。将编码不同蛋白的质粒接种于体内，可导致机体T细胞和相应抗体对这些蛋白的应答，因而提供了一种特异性免疫手段。优点有：①没有导入可能与“减毒”疫苗相关的强毒力病毒的危险性；②易于大量制备，价格便宜：③可以干粉形式长期保存；④小剂量适当的基因构建于即可诱导保护性免疫；⑤使用一次即能产生长期免疫力。虽然近20年来基因治疗取得了很大的发展，但当前基因治疗研究中还存在很多技术性的难题，其中之一就是治疗基因的有效传输。目前的基因传递系统主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然其有比较高的转染效率，但是它们的生物安全性问题至今尚未得到很好的解决。非病毒载体安全性高，易于大规模生产，研究主要集中在脂质体和高分子载体系统上。这两种载体作为给药系统，在药剂学领域已经有了广泛的研究。脂质体主要由磷脂组成，生物相容性好，对所携带的遗传物质没有片断大小的限制，可以通过内吞和融合等作用方式进入细胞，转染效率相对较高，但稳定性较差和主要带正电荷限制了其在静脉注射中的应用。而高分子基因传递系统，也具有很好的生物相容性，很低的生物毒性，生物降解性的特点，且其生产成本低，稳定性高，便于结构修饰，是一类更具开发潜力的载体系统。本课题用聚阳离子多肽—多聚赖氨酸(PLL)与DNA形成缩合物，再采用复乳—溶剂挥发法制备PELGE为载体材料的纳米多聚复合物载药系统PPDs(polymeric-polycationic peptide-DNA，PPDs)，较为系统地研究了载基因的制备处方工艺条件，详尽地考察了其物理化学性质，体外转染能力及细胞毒性，并建立了小鼠肺转移肿瘤模型，用PPDs携带治疗基因mIL-18，进行了体内药效学研究。在此基础上，我们还对PPDs进行了叶酸修饰，提高了其对肿瘤细胞的靶向性。首先，我们制备了非病毒表达载体，对合成的传递载体材料(PELGE)进行了细胞毒性评价，筛选出适合以后实验的材料，诣在将其应用于载基因纳米粒静脉注射。实验利用转化的大肠杆菌DH5-α分别扩增了需要的报告基因和治疗基因，按照试剂盒说明用阴离子交换树脂分离纯化了质粒DNA，采用紫外分光光度法测定了其含量，通过计算A_(260)／A_(280)的比值，证明其纯度符合要求；我们又采用琼脂糖凝胶电泳进一步考察了质粒DNA的纯度和构型，结果表明纯化产物的纯度和构型均符合要求。由载体材料PELGE的细胞毒性试验可以得出，在实验给药的浓度条件下，材料纳米粒对血管内皮细胞相容性最好，如静脉注射后被动浓积于肝脏，毒性也很小，宜于用于血管使用，即静脉注射。并且鉴于PELGE系列聚合物细胞毒性和血液相容性研究的综合考虑，我们选用材料PELGE73进行后面的实验。随后，我们采用荧光分光光度法，利用荧光染料Hoechst 33258与DNA结合发出荧光的原理，建立了DNA的含量测定方法。我们通过琼脂糖凝胶电泳和zeta电位的检测，确定了PLL与DNA的最佳比例(1：1，w／w)和混合介质(葡萄糖注射液)，成功地用PLL缩合了质粒DNA，为下一步的包封做了必要的准备。我们采用复乳—溶剂挥发法，以粒径和多分散指数(PDI)以及包封率为指标，通过单因素试验筛选了处方工艺条件，以PELGE与PLL／DNA缩合物一起制备了PPDs。用筛选后的处方工艺条件制得的PPDs为较规则的圆球，平均粒径为150.92±9.04nm，PDI为0.15±0.01，zeta电位为-27.31±2.02mV，包封率为87.99±1.61％。DNA在制备过程中能保持其完整性，制备成PPDs后能有效抵抗核酸酶的降解，质量优良。对PPDs载体系统物理化学性质的进一步考察表明了，该种多聚复合NP制备的过程中加入了PLL，不仅能有效压缩DNA，还能在一定程度上保护DNA免受制备过程中超声的伤害，并且能有效地防止DNA被体内核酸酶降解，更能加强DNA在酸性条件下的稳定性，并使得以其为内核的PPDs在不同pH条件下带不同电荷。这都为基因传递提供了很好的前提。当pDNA与PLL以静电吸引力作用形成核，再包裹在以生物可降解的mPEG-PLGA-mPEG为壳的纳米粒中，就构成一种核壳结构的新型载基因系统—PPD(PELGE-PLL-DNA)。这种以PELGE为外壳的载基因系统也具有了更好的生物相容性好，更低的细胞毒性，在血浆中也有了更强的稳定性。我们运用体外细胞培养技术，成功地利用β-半乳糖苷酶和荧光素酶(luciferase)两种报告基因，考察了PPDs介导外源基因的体外细胞转染能力。以β-半乳糖苷酶为报告基因的转染定性地表明了，我们设计制备的PPDs都能成功的转染HepG2和Hela细胞，其在显微镜下计数测得的转染率分别大约为3±0.9％和1.2±0.5％，而不含PLL的PELGE纳米粒和裸DNA转染的细胞中没有观察到转染成功的蛋白表达。以荧光素酶为报告基因的转染定量地表明了，PPDs转染的HepG 2和Hela细胞其表达出的荧光素酶具有较强的活性，明显高于裸DNA和不含PLL的PELGE纳米粒(p＜0.05)，有了数量级的提高，进一步证明了PPDs联合应用多聚阳离子肽和生物可降解的大分子复合物的优越性。随后，我们用MTT法考察了空白纳米粒的细胞毒性。为了检测我们构建的质粒能否准确表达目的基因，我们用pEGFP-C1-IL-18 PPDs转染了肿瘤细胞，考察了其在肿瘤细胞中的表达情况。我们以外观、色泽以及再分散性为指标，筛选了PPDs的冻干粉针剂处方，制备出的PPDs冻干粉针剂达到了设计要求。初步稳定性试验结果表明，PPDs冻干粉针剂在-20℃冰箱中储存放置1周之后，其粒径、zeta电位、包封率以及对核酸的保护能力与冻干前相比均无明显变化。我们建立了小鼠肺转移肿瘤模型，通过尾静脉给药，评价了PPDs冻干粉针剂携带治疗基因mIL-18在体内的抗肿瘤效果，并通过与化疗药物顺铂(DPP)联用，进一步评价了基因药物与化疗药物的联合治疗效果。试验结果表明，荷瘤小鼠经mIE-18-PPDs冻干粉针剂治疗后，生存期显着长于PBS组、空白纳米粒组和阳性对照组；mIL-18-PPDs冻干粉针剂与DPP联合治疗组小鼠的生存期均又显着长于mIL-18-PPDs冻干粉针剂单独治疗组，说明联合治疗取得了成功。病理学及肿瘤组织的检测结果表明，在PBS组、空白纳米粒组和裸DNA组小鼠的肺脏中，肿瘤转移灶数量多、面积大，说明肿瘤的转移较为严重，并且新生灶的生长较快；而在mIL-18-PPDs组、DPP组以及联合治疗组小鼠的肺脏中，转移灶数量少、面积小，说明小鼠经治疗后，肿瘤的生长得到了明显的控制；其中联合治疗组几乎没有观察到明显的转移灶，组织形态与正常小鼠未见明显区别，说明联合用药达到了很强的抑瘤作用。此后，鉴于新型构建的PPDs载体对传统纳米粒的转染效果提高明显，我们在PPDs系统中引入叶酸来赋予其靶向性。我们将生物可降解材料换为PELGE的类似物PELGA，由PEG和PLGA聚合形成，再通过酯键与叶酸连接，然后按照同样的复乳-溶剂挥发法制成多聚复合物基因给药系统。利用细胞荧光吞噬试验以及报告基因的表达考察了系统的靶向性。结果表明叶酸修饰过的PPDs在Hela细胞中的摄取明显提高，报告基因的转染更是有了显着性的差异，这都表明叶酸的连接，增加了载体系统的靶向性。综上所述，我们联合应用了多聚阳离子肽和生物可降解的大分子复合物，可望将其作为一种平台技术，用于制备非病毒基因传递系统。本课题制备的新型纳米多聚复合物基因传递系统能有效介导目的基因的体内外转染，为设计构建种新型、有效的载体系统提供了新的思路。
田步宁[8]2007年在《PLA-CS纳米粒介导Survivin反义寡核苷酸增强阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的体外研究》文中认为目的肝癌(hepatocelular carcinoma，HCC)，是我国最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后差，严重威胁着人类生命与健康。目前，手术切除仍是治疗肝癌首选和较有效的方法。化疗是肝癌一项重要的辅助治疗手段，但对正常细胞的毒性和肿瘤细胞的耐药性是化疗面临的两大难题。研究表明，Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，并具有抑制细胞凋亡和调节细胞周期双重功能，与肿瘤的化疗耐药性密切相关。纳米颗粒基因转运体是近年发展起来的一种新型的安全、有效并具有优良特性的非病毒基因转运载体。本研究：1．制备聚乳酸壳聚糖纳米粒，分析其性质和体外转染效率；2．利用新型的活细胞检测技术分子信标直接检测并证实人肝癌细胞系Bel7402高表达Survivin；3．利用聚乳酸壳聚糖纳米粒介导Survivin反义寡核苷酸研究增强阿霉素诱导肝癌细胞凋亡。方法1．采用乳化溶剂挥发法，优化工艺条件，成功制备粒径较小、分布均匀的PLA-CS纳米颗粒，用Malvern Zetasizer 3000E(Malvern，UK)检测PLA-CS纳米粒和PLA-CS／DNA复合物的Zeta电位以及粒径分布。使用原子力显微镜(Asylum Research MFP-3D AFMSystems)来检测PLA-CS纳米粒粒径大小和形态。然后利用电泳的方法观察PLA-CS NP与DNA的结合情况和对DNA的保护，MTT实验和流式细胞仪检测PLA-CS NP在体外细胞转染效率和细胞毒性；2．针对Survivin设计的分子信标通过PLA-CS纳米粒介导入正常肝细胞系HL7702细胞和肝癌细胞系Bel7402中，检测Survivin转录产物的差别，台盼兰实验检测分子信标对细胞的生长情况的影响，RT-PCR证实分子信标检测的准确性；3．通过PLA-CS纳米粒转染Survivin反义寡核苷酸进入肝癌细胞，运用RT-PCR和Western blot检测Survivin的变化，MTT检测细胞的增殖抑制，流式细胞仪检测肝癌细胞的凋亡率。用阿霉素处理后，MTT检测细胞的增殖抑制，流式细胞仪和AO／EB染色观测细胞的凋亡指数的变化。结果1．采用Malvern Zetasizer 3000E激光粒度分析仪进行粒径及分布的检测结果显示，制备PLA-CS NP的平均粒径值为87nm。粒径大小分布呈正态分布，分布均匀。原子力显微镜进行观测。纳米颗粒呈圆球形，表面平滑完整，分散良好，无粘附团聚现象。PLA-CS NP和DNA耦合后，其表面电位为＋10mV±1.5mV。从电泳的结果分析知，纳米粒和质粒DNA能有效的结合起来。MTT显示PLA-CS NP在低于3μg／μl浓度时，细胞生长的抑制率小于10％。流式细胞仪检测转染效率可达43.5％。2．分子信标经PLA-CS纳米粒转染细胞后发现正常的肝细胞系HL7702中几乎没有荧光信号；而肝癌细胞系中Bel7402细胞系内有较强的的绿色荧光信号。台盼兰实验显示细胞的活力基本未受影响。RT-PCR证实Bel7402细胞中Survivin mRNA表达高于HL7702细胞系。3．在转染了Survivin的反义寡核苷酸24小时后，反义寡核苷酸Survivin各组均显示mRNA和蛋白的表达下调，以800ng／ml组最为明显，与对照组比较有显着性差异(P＜0.05)；MTT发现Survivin ASODN处理后各组细胞增殖活性均有不同程度降低；流式细胞仪检测发现Bel7402细胞在400ng／ml，600ng／ml，800ng／ml组的ASODN在作用24小时后凋亡率可分别为7.88±0.15％，14.16±0.35％，32.73±0.78％，与对照空白组0.50±0.06％和SODN转染组0.57±0.09％比较有显着性差异(P＜0.05)。在加用阿霉素后，600ng／mlASODN组的细胞凋亡率可达40.34±0.78％，与单独使用ADM和转染ASODN后的凋亡率16.94±0.54％和15.07±0.35％比较有显着性差异。在AO／EB染色中也可以发现ADM＋ASODN组内的比较多的细胞则发生了核固缩，浓染，破裂，出现了细胞凋亡的核形态变化，而MTT实验显示空白对照组与ADM组和ASODN组在转染细胞24小时后，细胞增殖抑制有明显的差异(P＜0.05)，而ADM＋ASODN组与其余叁组比较均有显着性差异(P＜0.05)。结论1．成功制备平均粒径87nm、分布均匀的PLA-CS纳米颗粒。用壳聚糖修饰该纳米颗粒表面，使其带正电荷从而可逆的结合质粒DNA，组装成PLA-CS纳米颗粒基因转运体系，并对细胞生长毒性低。转染效率较高。2．利用分子信标建立了一种能在单细胞水平上检测活体细胞中基因转录产物的方法，有望发展成为一种能早期检测肿瘤标志物的方法。3．采用PLA-CS纳米基因载体介导转染针对Survivin设计的ASODN，转染效率较高，ASODN发挥了高效的封闭作用，PLA-CS纳米基因载体是一种安全，高效的新型的纳米基因载体。采用PLA-CS纳米基因载体介导转染SurvivinASODN,能有效的封闭Survivin基因，下调Survivin蛋白及mRNA的表达，并促进Bel7402细胞的凋亡。采用ASODN封闭Survivin的表达确实有效地抑制肝癌细胞的生长，增加细胞的凋亡。从而增加ADM的化疗敏感性，改善常规化疗的效果，具有临床应用的潜能。
尹美珍[9]2006年在《羟基磷灰石纳米粒子抑制肝癌细胞增殖及其机理研究》文中指出纳米粒子由于其独特的纳米生物学效应，已成为目前肿瘤防治研究工作的热点。羟基磷灰石纳米粒子具有抗癌活性，又具有良好的生物相容性，因而在抗肝癌研究中，受到越来越多的关注。本文选用均匀沉淀法成功制备出粒径范围主要为44.6nm～86.8nm(HAP_1)、301.6nm～1339.3nm(HAP_2)、843.2nm～2443.0nm(HAP_3)叁种羟基磷灰石粒子。用0.14mmol／L、0.28mmol／L、0.56mmol／L的HAP_1纳米粒子以及0.56mmol／L浓度的HAP_2和HAP_3粒子与肝癌细胞作用，通过光镜观察和MTT法、生长曲线及集落形成率定量测定，结果显示HAP_1纳米粒子对肝癌细胞的增殖能力有剂量和时间依赖性抑制作用，以0.56 mmol／L浓度处理肝癌细胞4d可达到显着的抑制作用；而0.56 mmol／L浓度的HAP_2和HAP_3粒子对肝癌细胞的作用都很弱。由此推断HAP_1纳米粒子的抑制肝癌细胞增殖作用与粒径、浓度及作用时间有关，这为其体内外抗癌研究提供了依据。通过叁种不同粒径的HAP粒子与肝癌细胞相互作用，经形态学观察与分析可知HAP_1纳米粒子很容易与肝癌细胞膜结合，肝癌细胞以非网格蛋白介导的细胞膜穴样内陷途径胞吞HAP_1纳米粒子进入肝癌细胞，而HAP_2和HAP_3粒子不易与肝癌细胞膜结合，因而很少进入肝癌细胞。通过Fluo-3荧光探针标记细胞内游离Ca~(2+)，经荧光显微镜观察，HAP_1纳米粒子使肝癌细胞的荧光增强，这说明HAP_1纳米粒子进入肝癌细胞后，胞浆成份促进其降解。通过Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫细胞化学PCNA染色，光镜观察以及图像分析软件的定量测定，HAP_1纳米粒子使肝癌细胞的平均细胞核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱，从分子生物学角度证实了HAP_1纳米粒子体外抑制肝癌细胞的作用，同时也揭示了HAP_1纳米粒子的抑癌机理①通过抑制DNA合成，主要是通过抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干扰DNA的合成；②通过抑制rDNA的转录活性，抑制rRNA的合成，进一步抑制细胞内蛋白质的合成；③通过抑制PCNA的活性，影响细胞增殖周期的顺利进行，延长细胞增殖时间。流式细胞术检测结果也证实肝癌细胞被阻滞于增殖周期的G1期。通过形态学观察以及定量测试方法，可知HAP_1纳米粒子体外抗肝癌作用缓慢，并不能快速杀死肝癌细胞，而首先是作为一种抑制肝癌细胞增殖作用的药物，通过逐渐影响其功能，最终导致细胞死亡。推测HAP_1纳米粒子是通过其降解产物以及粒子本身共同影响细胞的功能，表现出肝癌细胞由局部到整体的超微结构变化，最终诱导肝癌细胞以非程序性死亡的方式死亡—胀亡。成功建立了符合肝癌形态学特征的人肝癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤内局部注射途径，HAP_1纳米粒子能明显抑制肝癌移植瘤生长，治疗1周和2周的抑瘤率分别为77.21％和51.32％。能明显延长荷瘤鼠的生存时间。对肝癌移植瘤组织做石蜡切片，Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫组织化学PCNA染色，通过光镜观察和图像分析软件定量测定，HAP_1纳米粒子使移植瘤组织肝癌细胞的平均核DNA含量下降、核仁内AgNOR数量减少以及PCNA表达减弱，从分子生物学角度证实HAP_1纳米粒子能明显抑制移植瘤的肝癌细胞增殖，同时也揭示了抑制机理。通过电镜观察发现移植瘤组织的肝癌细胞内有HAP_1纳米粒子，推测其与进入体外培养肝癌细胞的方式相同，并在胞质内降解，可能同样是以降解产物及粒子本身影响细胞的功能，最终导致移植瘤组织的肝癌细胞死亡。由于体内是实体瘤组织，HAP_1纳米粒子在肝癌组织的浓度高低分布不同，诱导肝癌细胞以程序性以及非程序性两种方式死亡—凋亡及胞体割裂。总之，HAP_1纳米粒子体内抗肝癌的机理是：首先，①抑制肝癌细胞增殖，通过抑制DNA合成，主要是抑制DNA合成过程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干扰DNA的合成。通过抑制rDNA的转录活性，抑制rRNA的合成，进一步抑制蛋白质的合成。通过抑制PCNA的活性，阻滞细胞增殖周期。最终起到明显抑制肝癌细胞增殖的作用；②可能也具有诱导肝癌细胞分化的作用；③肝癌细胞被诱导以凋亡和胞体割裂两种方式死亡。
梁劲康[10]2016年在《共载化学药物和CpG ODN的GA-PEI-PLGA纳米给药系统研究》文中研究表明近年来,大量研究报道了共载化疗药物和基因药物的阳离子纳米载体,该载药纳米载体能同时达到化疗和基因治疗的目的,相互协同抑制肿瘤的生长。基于此,本文在课题组前期研究的基础上进一步开展共载化学药物和CpG ODN的GA-PEI-PLGA纳米给药系统的研究。在前期的研究中,本课题组已成功利用EDC·HCl以及NHS的催化作用,将肝靶向性分子GA、疏水性PLGA和亲水性PEI通过化学合成方法形成GA修饰的PEI-PLGA共聚物——GA-PEI-PLGA。本文应用TNBS法测定GA-PEI-PLGA中PLGA和GA的取代度分别为(11.48±0.48)%和(19.26±1.89)%。酸碱滴定法结果也表明虽然其质子缓冲能力不如PEI,但GA-PEI-PLGA仍保留较好的质子缓冲能力。本文以大鼠血浆中AST、ALT、TP及CRE的含量为指标,结合组织切片观察,考察了GA-PEI-PLGA和PEI-PLGA纳米粒对肝脏和肾脏的毒性。结果表明,经多次注射后两种纳米粒在一定程度上均会影响肝脏的功能,但与PEI-PLGA纳米粒相比,经GA修饰后的GA-PEI-PLGA纳米粒的肝毒性则大大降低。而PEI-PLGA纳米粒和GA-PEI-PLGA纳米粒均不会影响肾脏的功能。为了进一步研究GA-PEI-PLGA纳米粒共载化学药物和基因药物后的性质,本文选择了羟基喜树碱(HCPT)和CpG ODN作为模型药物。HCPT可选择性地抑制拓扑异构酶I而干扰DNA的复制,从而有效抑制肝癌细胞的生长。CpG ODN作为免疫佐剂可以诱导Th1型免疫反应,激活巨噬细胞、DC细胞和NK细胞等免疫细胞分泌TNF-α、IFN-γ及IL-12等细胞因子杀伤肿瘤细胞,并能够逆转肝癌免疫抑制状态。采用超声乳化-减压溶剂挥发法制备HCPT/GA-PEI-PLGA纳米粒,并以载药量和包封率为考察指标对其制备工艺进行优化。优化后的处方工艺为:药物/载体比3:10、油相/水相体积比1:9、超声功率60%、超声时间15min。制得的载药纳米粒包封率高达(87.52±3.91)%,载药量为(20.10±4.72)%。采用动态透析法考察hcpt/ga-pei-plga纳米粒的体外释药特性,结果表明ga-pei-plga纳米粒可延缓hcpt的释放,药物释放符合higuchi方程。凝胶电泳结果也表明,当cpgodn与ga-pei-plga比例为1:10(w/w)时,cpgodn能充分包载到hcpt/ga-pei-plga纳米粒中。所制得的cpg/hcpt/ga-pei-plga纳米粒呈类球形,粒径大小均一,分布均匀,稳定性好,平均粒径为(145.7±13.5)nm,zeta电位为(23.11±2.29)mv。本文选用人源性bel-7402肝癌细胞、hepg2肝癌细胞和spc-a-1肺腺癌细胞作为细胞模型来验证cpg/hcpt/ga-pei-plga纳米粒能否协同抑制肿瘤细胞的生长。结果表明,hcpt/ga-pei-plga纳米粒和hcpt/pei-plga纳米粒对叁种肿瘤细胞的抑制作用均显着强于游离hcpt药物。无论是单载hcpt还是共载hcpt和cpgodn,ga-pei-plga纳米粒组对hepg2细胞和bel-7402细胞的抑制作用显着高于pei-plga纳米粒组,但是载药后的ga-pei-plga纳米粒和pei-plga纳米粒对spc-a-1细胞的抑制作用却没有显着性差异,这表明ga-pei-plga纳米粒具有一定的肝靶向作用。虽然cpgodn对肿瘤细胞没有直接杀伤作用,但是其能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,因此,cpg/hcpt/ga-pei-plga纳米粒和cpg/hcpt/pei-plga纳米粒对叁种肿瘤细胞的抑制作用显着强于hcpt/ga-pei-plga纳米粒和hcpt/pei-plga纳米粒,也显着强于hcpt和cpgodn游离药物的混合溶液。此外,选择鼠源巨噬细胞raw264.7细胞考察了载药纳米粒的免疫刺激活性。由于hcpt能直接杀伤raw264.7细胞,cpg/hcpt/ga-pei-plga纳米粒刺激raw264.7细胞分泌tnf-α的量不如cpg/ga-pei-plga纳米粒,但cpg/hcpt/ga-pei-plga纳米粒仍能保持较好的免疫刺激活性。hcpt/ga-pei-plga纳米粒在小鼠体内分布实验结果表明,尾静脉注射给药后,hcpt/pei-plga纳米粒组和hcpt注射液组中药物随着血液分布至全身各器官,而hcpt/ga-pei-plga纳米粒组中药物主要积聚在肝脏部位,肝脏的药物浓度始终远远高于血浆、心、脾、肺和肾等器官组织,表明ga-pei-plga纳米粒具有明显的趋肝性,不仅能延长hcpt在肝脏部位的作用时间,同时也能降低HCPT对其他脏器的毒性。GA-PEI-PLGA纳米粒是一种具有广阔应用前景的主动肝靶向纳米给药系统。
参考文献：
[1]. 纳米生物技术治疗肝癌：p53-白蛋白纳米粒的制备和转染的研究[D]. 郭妍. 中南大学. 2004
[2]. 基于基因和分子靶向治疗技术的C225/p5HRE-cfosp-iNOS-IFNG磁性白蛋白纳米球治疗肺癌的实验研究[D]. 张皓. 东南大学. 2016
[3]. 阿霉素白蛋白纳米粒介入治疗肝癌实验研究[D]. 李刚. 中南大学. 2008
[4]. 载基因荧光金微泡联合US/NIR双模态成像、双辐照—光热—基因治疗肝癌及其机制的研究[D]. 王玲. 东南大学. 2016
[5]. 壳聚糖/聚乙烯亚胺构建新型非病毒基因载体及其评价[D]. 赵青青. 浙江大学. 2010
[6]. 基于普鲁兰多糖的纳米药物递送系统靶向抗肝癌作用研究[D]. 刘媛媛. 天津医科大学. 2015
[7]. 可静脉注射新型纳米复合物载IL-18基因传递系统的研究[D]. 聂宇. 四川大学. 2007
[8]. PLA-CS纳米粒介导Survivin反义寡核苷酸增强阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的体外研究[D]. 田步宁. 中南大学. 2007
[9]. 羟基磷灰石纳米粒子抑制肝癌细胞增殖及其机理研究[D]. 尹美珍. 武汉理工大学. 2006
[10]. 共载化学药物和CpG ODN的GA-PEI-PLGA纳米给药系统研究[D]. 梁劲康. 广东药科大学. 2016
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