罗孟军[1]2002年在《枯斑盘多毛孢菌生物学特性及毒素的研究》文中研究说明松赤枯病是松树幼龄林上常见的病害，分布广，危害严重，自1974年开始发生危害，到1980年流行以来，已成为四川主要林木针叶病害，居林木病害首位。开展枯斑盘多毛孢菌生物学特性及致病毒素的研究对深入探索松赤枯病的发生发展规律、发病机理、防治方法有重要的理论和实践意义。本研究通过对马尾松赤枯病的生物学特性、毒素特性、致病机理及有毒活性成分的化学结构分析，首次得出如下结论： 1．碳、氮源筛选及生态因子研究表明，枯斑盘多毛孢菌(Pestalotia funera Desm．)适应性强，能在较大的pH范围内正常生长并产孢，其菌丝生长及产孢能力在相对较低的pH条件下有增强的趋势。在设定的碳、氮源条件下，得出其最佳营养生长培养基，即改良的察氏1号培养基(果糖30g KCl0.5g FeSO_40.019 K_2HPO_41.0gMgSO_4·7H_2O 0.5g 蛋白胨3.0g)，在该培养基上枯斑盘多毛孢菌营养生长最快(10.8mm／d)，其最适生长温度为22℃～25℃，且在温度高于35℃时就停止生长；最佳产孢培养基即改良的察氏2号培养基(蔗糖30g KCl0.5g FeSO_40.01g K_2HPO_41.0g MgSO_4·7H_2O 0.5g KNO_32.0g)，在该培养基上，枯斑盘多毛孢菌产孢能力最强且经过短期培养(接种后第8天)即可获得最大产孢量(7.47×10′个孢子／皿)。同时自然光和空气充足有利于枯斑盘多毛孢菌产孢。这些特性的阐明为进一步研究和利用枯斑盘多毛孢菌奠定了生物学基础。 2．枯斑盘多毛孢菌毒素粗提液的基本特性研究表明，毒素的产生与培养条件有关，马尾松赤枯病病菌在PD培养基中产毒最好，在这种培养基中加入松针浸出液对毒素的产生和活性没有促进作用。该菌产生的毒素是一类极性较大的非蛋白类物质，活性碳能对其进行吸附；该毒素能用甲醇将其从培养液中较好地提取出来。这些特性的揭示为深入研究毒素提供了可靠的生化依据。 3．不同的生测材料试验证实马尾松幼嫩的针叶对毒素的反应快而灵敏，且能产生典型的受害症状，是一种理想的生测材料。生测方法研究显示，与浸渍法、涂抹法相比较，针刺法不仅反应速度快，而且用量少，用针刺法处理待测针叶，由于粗提液多为植物材料所吸收，在生测过程中不易长出霉菌，使生测结果更为直观和准确。 4．毒素致病机理研究显示，马尾松针用毒素处理后可诱使寄主细胞膜脂发生过氧化反应，在处理后24小时即使MDA的含量变化达到最大（与对照相比高于对照48％人 最终造成对膜的伤害。处理后寄主组织的 PPO活性也较对照为高，说明毒索处理后寄主体内生理代谢发生了有害变化，组织的细胞膜在一定程度上受到了伤8。 5．分离纯化技术及毒素化学结构研究表明，通过对薄层层析展开剂及柱层析填料的筛选，得出正丁醇：甲醇：水u0：15：30）为最佳展开剂，硅胶 H 60型为最佳填料。以生测为导向，用硅胶 H60型柱反复柱层析，用正丁醇：甲醇：水历015：30）和不同浓度的甲醇水溶液为洗脱液，从松赤枯病菌的毒素中分离出 3种有致病活性的分子量较小的物质，通过质谱（MS＊核磁共振谱卜 HNMR）和红外光谱口皿）等分析手段确定出所分离的活性组分为含氮植物多糖。活性组分1的化学 丫eNH。组成为 C。HllO。N（M＝165），分于结构式为：＼厂活性组分 2 的化学组成为 C10H19O10N（M—3！3），分子结构式为：丫＼一O丫、口一NH。 ＼厂：活性组分 3的化学组成为q。H。。OgN（M ＝＝ H ＞p－t y O＊NHCHICIncffi325），分子结构式为：卜一寸yq
朱天辉[2]2003年在《枯斑拟盘多毛孢菌毒素的研究》文中提出由枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis funera Desm.)引起的松赤枯病是松树幼龄林上常见的病害，分布广、危害严重。该病在四川自1974年开始发生危害，到1980流行以来，已成为主要针叶林木病害，居林木病害首位。本文首次对枯斑拟盘多毛孢菌致病毒素的离体产生条件、毒素基本特性、专化性特点、毒素对寄主细胞质膜的伤害机制和对不同抗性松属植物细胞超微结构的影响及毒素活性成份分离纯化技术及化学结构进行了较系统的研究，以期了解枯斑拟盘多毛孢菌毒素的致病机理、不同松属植物的抗性反应及毒素活性物质的化学成份，从而为松属植物抗赤枯病育种和科学利用抗赤枯病树种提供可靠的理论基础。 本研究从四川松属植物分布区8个松属树种上采集松赤枯病样本，经单孢分离获得21个枯斑拟盘多毛孢菌菌株，所产毒素的致病性具明显的多样性。用马尾松、华山松、油松、云南松、湿地松、火炬松、辐射松、黑松一月龄左右的切根苗作生测材料，筛选出较强毒力的松赤枯病菌菌株(PF-1)作毒素产毒条件的研究，结果表明：枯斑拟盘多毛孢菌在七种参试培养基中，以PD培养基产毒最好，在培养基中加入敏感寄主马尾松松针浸出汁不能对毒素的产生和活性起促进作用。枯斑拟盘多毛孢菌在18-22℃、pH6.5-7.0、黑暗、静止状态下产毒最佳(15-27d)，这些条件与其菌丝生长、产孢有一定差异，表明枯斑拟盘多毛孢菌的生长与产毒条件不完全一致。 枯斑拟盘多毛孢菌毒素粗提液的基本特性研究显示：(1)毒素粗提液在80℃以下的温度有较高的稳定性，在高温(90-100℃)条件下，有失活现象发生；酸碱度(pH4-9)对其致病活性没有较为明显的影响。(2)该毒素不溶于乙酸乙酯等非极性溶剂，易溶于乙醇、甲醇等极性较大的溶剂。在氯仿与甲醇按不同比例提取时，随着甲醇比例的提高，提取液的致病活性也不断增强，据此可以推测枯斑盘多毛孢菌毒素可能为一类极性较大的物质(非蛋白类)，活性碳能对其吸附，并能用甲醇将其从培养液中较好地提取出来，这些特性的揭示为深入研究毒素提供了可靠的生化依据。 选用12种不同科属木本植物和15种不同科属杂草对毒素专化性研究表明，松属植物中，马尾松、油松、云南松对毒素最敏感、湿地松、火炬松次之，华山松、辐射松、黑松有较强的抗毒素能力，而不同科属的木本植物柳杉、杉木、南洋杉、兰桉对毒素也有不同程度的反应，说明该毒素为非专化性毒素。同时，不同生测材料试验证实松幼嫩的针叶对毒素的反应快而敏感，且能产生典型症状，是一种理想的生测材料。生测方法研究显示，与浸渍法、涂抹法相比，针刺法不仅反应快，而且用量少，用针刺法处理待测针叶，由于粗提液易为植物材料所吸收，在生测过程中不易长出霉菌，使生测结果更为直观和准确。本研究还表明枯斑盘多毛抱菌毒素能使十五种杂草中的九种产生不同程度的伤害，一方面反应出这种非寄主专化性毒素在除草上有一定选择性，另一方面，也表现出广谱的除草能力，这对于开发新型生物除草剂有一定的参考价值。 毒素对不同松属植物细胞膜的伤害通过离子渗漏(电导率换算成膜伤害指数)和丙二醛(州DA)含量变化评估:(l)马尾松(29.5/24h)、油松(28.5/2 4h)、云南松(25.7/24h)细胞膜伤害指数最大，湿地松(9 .0/2 4h)、火炬松(8 .0/24h)次之，华山松(3.9/2 4h)、辐射松(4.6/2 4h)、黑松(4.3/2 4h)最小，这种差异在一定程度上反映了不同松属植物在抗病性上的差异，同时研究还发现，随着毒素浓度的降低，寄主膜伤害指数(电导率)显着下降，感病树种(马尾松、油松、云南松)在24h时膜伤害指数达最大值，而抗病树种(华山松、辐射松、黑松)的膜伤害指数达最大值的时间有所推迟(48h)。 (2)不同松属植物在毒素处理后，针叶中的MDA含量变化趋势有显着差异，抗病树种针叶中MDA含量变化情况不如感病树种(马尾松、油松、云南松)明显，从而说明抗病树种(华山松、黑松、辐射松、湿地松、火炬松)细胞膜脂过氧化较低，对毒素的忍耐力较强，这实际上是一种抗病性在细胞膜的反应。 毒素对不同抗病性松属植物愈伤组织破坏的扫描电镜试验表明，正常愈伤组织表面结构丰满、圆滑，而毒素可造成松属植物愈伤组织表面结构的破坏，细胞皱缩、空瘪，这种破坏作用，随处理时间的延长而增大;并且，马尾松对毒素较华山松更为敏感，马尾松愈伤组织表面的毁坏程度比华山松大得多。另一方面，透射电镜显示，感病树种马尾松针叶经毒素处理后，细胞壁肿胀，细胞壁多处部分消解，细胞质膜断裂，散落在细胞中，细胞发生严重的质壁分离，叶绿体膜破坏、片层无序化，或片层模糊，线粒体脊模糊、无序化，脊消解;但抗病树种华山松针叶细胞结构破坏相对较小，常在同一视野中有的细胞受害而有的细胞基本正常，说明华山松对枯斑拟盘多毛菌毒素有一定的抗性。 毒素分离纯化及化学结构研究表明:(l)通过对薄层层析展开剂及柱层析填料的筛选，得出正丁醇:甲醇:水(60:巧:30)为最佳展开剂，硅胶H60型为最佳填料。(2)以生测为评判指标，用硅胶H60型柱反复柱层析，用正丁醇:甲醇:水(60:15:30)和不
黄丽丹[3]2006年在《茶藨生柱锈重寄生菌（Pestalotiopsis sp.）的生物学特性及毒素研究》文中进行了进一步梳理华山松疱锈病(Armandii pine blister rust)是由茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola J.C.Fischer)引起的一种毁灭性松干锈病,主要危害华山松中幼林,导致受害华山松高生长、径围生长和材积量明显下降,当病部溃疡斑环绕树干周长一半以上时造成枝干枯萎,最终整株死亡。化学防治在华山松疱锈病中一直占据主导地位,此方法虽然在一定时间和一定程度上能取得较好的防治效果,但往往由于操作困难、难以持久及环境污染等问题使得大部分病区的华山松疱锈病仍未得到有效控制且有继续蔓延扩张的趋势,严重威胁着长江上游防护林体系建立,给生态恢复带来极大困难。重寄生菌是一类对植物病原菌有控制作用的重要微生物资源,广泛用于植物病害生物防治的生防菌多数是植物病原菌的重寄生菌。《洱源枝顶孢侵染华山松疱锈菌机理研究》项目组成员在过去的研究中筛选出一株华山松疱锈病病原茶藨生柱锈的重寄生菌——MM011菌株,该菌对锈孢子具有很强的伤害作用,且以毒素伤害为其作用机理。开展该重寄生菌生物学特性及毒素的研究对开发新型生防制剂防治华山松疱锈病有重要的理论和实践意义。本研究对重寄生菌MM011的生物学特性、产毒条件、毒素的提取和基本性质及活性成分的分离纯化进行了较系统的初步分析和研究,并对MM011活菌体及毒素原液对华山松幼苗的安全性和对华山松疱锈病感病枝干的室内、室外防治效果进行了评价。主要研究结果如下:(1)营养物质对MM011菌丝生长的影响:不同碳源对菌丝生长存在显着差异,多糖比单糖或二糖更有利于MM011生长,可溶性淀粉、玉米粉对菌丝生长最为有利,而对乳糖利用最差。MM011能有效利用有机氮中的蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粉和各类氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸),但对无机氮中的铵态和硝酸态氮利用较差。无机盐离子明显影响MM011菌丝生长,以磷酸二氢钾、磷酸二氢钠最好,其中又以磷酸二氢钠最佳,并极显着高于其它几种无机盐处理。不同生长因子对MM011菌丝生长存在一定的差异,但促进作用不明显,仅复合VB处理后,菌落直径较对照组大,而其余各种维生素对菌丝生长促进作用不大。(2)环境因子对MM011菌丝生长的影响:MM011对温度的适应范围较广, 5~35℃下均能生长,但以20~30℃生长较好。低温(<15℃)或高温(>35℃)菌丝生长都会受到抑制。光照与MM011菌丝生长关系不密切,不同光照条件下菌丝生长速度差别不大。MM011在pH2～9范围内都能够生长,但以pH为4～7的微酸性环境内生长较好,过碱(pH大于7)或过酸(pH小于4)对菌丝的生长都不利。在-0.23～-6.487MPa水势下,菌丝均能生长,低于-8.0MPa,菌丝完全不能生长。MM011是一种好气性真菌,摇床速度达到150r/min最有利于该菌生长;接种量对菌丝最大产量影响不大,
袁川[4]2012年在《四川两种林木真菌病害病原的分子检测技术研究》文中研究说明由枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis funerea Desm.)引起的松赤枯病是松树幼龄林常见的病害,已成为我省主要针叶林木病害。云杉叶疫病是由一种根球壳孢菌(Rhizosphaera kalkhoffii Bubak.)引起的重要林木真菌病害,在云南香格里拉、川西地区均有发生。本研究以枯斑拟盘多毛孢菌、根球壳孢菌为研究对象,通过设计特异性引物扩增松树(Pinus.sp.)、云杉(Picea.sp)针叶基因组DNA的方法来快速、高效地检测松赤枯病病原、云杉叶疫病病原,为林木病害病原的快速分子诊断及其病害防控措施的制定提供参考。本研究以rDNA的ITS区序列在真菌分类上的应用为基础,针对枯斑拟盘多毛孢菌共合成引物7对,筛选出一对最优引物,标号为AF,其序列为：F(5'-3'):GTCAACCAGCGGAGGGAT18bpR(5'-3'):CGCCGTTGTATTTCAGGAG19bp针对根球壳孢菌共合成引物6对,筛选出一对最优引物,标号为EU2,其序列为：F(5'-3'):CCAACCAAACTCTTGTATTAA21bpR(5'-3'):GGGTATCCCTACCTGATCCGA21bp在松赤枯病病原菌的分子检测过程中,2011年3月前高山松(P.densata)、华山松(P.armandi)、马尾松(P.massoniana)和云南松(P.yunnanensis)的针叶上均没有检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在；2011年3月,在石象湖地区的马尾松松针和二郎山地区的云南松针尖部、中部开始检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在；2011年6月,在二郎山地区的云南松松针基部也检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在。在云杉叶疫病病原菌的分子诊断过程中,全年共采样9次,在2011年7月前,二郎山地区云杉针叶上均没有检测到根球壳孢菌,之后,开始检测出根球壳孢菌,但以8月的检测效果为佳。将每次检测到病原菌的PCR产物进行测序,所得序列经BLAST比对后均确定为该病原菌。试验结果表明,根据GenBank库已有的枯斑拟盘多毛孢菌、根球壳孢菌序列,通过其ITS区序列设计特异性引物,对松针、云杉基因组DNA进行PCR扩增的方法来检测松赤枯病、云杉叶疫病是可行的。使用这种方法可以提前两个月检测出松赤枯病病原菌,也可以初步推定二郎山地区云杉落针非云杉散斑壳菌[Lophoderm ium Piceae(Fuckel) V.Hohn]引起而是由根球壳孢菌所致,并发现该地区常见的川西云杉(P. likiangensis)和粗枝云杉(P.asperata)针叶组织中均有根球壳孢菌的存在。该方法可以在病害表现出症状前一定时间内快速准确地检测出病原菌是否存在,对林木病害的提前快速诊断方法与技术进行了有益探索,也为病害的进一步防控措施的拟定提供了依据。
李向彬[5]2008年在《草莓根腐病菌致病物质的初步研究》文中研究说明草莓根腐病是当前草莓生产园区的毁灭性病害之一。世界草莓主要的生产园区均有发生。进入80年代后,我国草莓栽种面积迅速扩大,每年都因该病害遭受巨大的经济损失。本文以草莓根腐病优势致病菌——石楠拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis photiniae (Thuem) Y. X. Chen)为对象,首次对其致病物质的生化特征、产生毒素的条件、产毒能力、毒素的基本特性以及分离纯化致病组分进行了初步研究,为进一步研究草莓根腐病菌毒素的致病机理和毒素致病活性物质的化学成分提供理论基础,同时也为利用毒素进行草莓品种的抗病性筛选和草莓根腐病的生物防治提供依据。本试验经硫酸铵沉淀法得蛋白类物质,用乙酸乙酯萃取毒素类物质,然后采用离体叶片针刺法测定致病活性。结果表明,蛋白类物质与无菌水对照相同,对草莓叶片无致病活性；而粗毒素(浓度为0.355mg/mL)在第2d就可见发病症状——褐色病斑,对草莓叶片表现出很强的致病活性。初步确定了草莓根腐病菌致病物质为毒素类物质。对影响石楠拟盘多毛孢菌产毒的条件进行了研究,结果表明,石楠拟盘多毛孢菌在培养基初始pH值为自然pH值(大约为6.2),温度为25℃,黑暗条件下静置培养5～7d产生的毒素致病性最强。最适产毒条件与其生长条件不完全一致。草莓根腐病菌毒素致病类物质是一种相对分子质量在10kD以下的小分子物质；且能忍耐100℃的高温处理,不同pH值条件下致病活性差异显着；在波长200nm处有较大的紫外吸收峰。草莓根腐病菌粗毒素的初步分离试验结果表明,极性不同的3种有机溶剂石油醚、乙酸乙酯和氯仿对粗毒素的萃取效果差异显着。乙酸乙酯萃取效果最好,回收率可高达97.8%,可见用中等极性的有机溶剂乙酸乙酯进行初步分离是行之有效的。采用柱层析和薄层层析相结合的方法,对草莓根腐病菌粗毒素进一步分离纯化。先采用硅胶柱层析分离,按极性由弱到强的顺序确定了8组不同的溶剂洗脱系统,其中只有石油醚：乙酸乙酯=1：1的溶剂系统洗脱下来的组分有致病活性。然后通过薄层层析法(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=1：5)对有致病活性的组分进行分离,发现还可以分成9种成分,其中分离物Ⅴ(Rf=0.59)和Ⅵ(Rf=0.55)有致病活性。
匙明强[6]2012年在《水杉赤枯病发生规律及防治技术研究》文中研究指明水杉（Metasequoia glyptostroboides）是我国尤其是长江中下游地区重要的城市绿化树种。随着水杉种植面积的不断扩大，水杉病虫害也日趋加剧，严重影响了水杉的生长成材和绿化效果。水杉赤枯病是一种重要的病害，发生范围广，并且有逐年加重的趋势。鉴于此，本实验对水杉赤枯病的症状和发病规律进行了调查，确定了水杉赤枯病的病原菌，并对病原菌的生物学特性进行了研究，对水杉赤枯病的防治方法进行了初步的研究。主要研究结果如下：水杉赤枯病主要危害水杉的叶片，导致水杉叶片从叶尖开始发生干枯变褐，或在叶片其它部位产生褐色斑点。该病在病健交界处有黄色晕圈，后期病叶表面产生黑色的小点，严重时导致水杉提前落叶。该病于5月份温度回升时开始发生，随温度升高病害逐渐加重；7、8月份温度达到全年最高温，而此时伴随雨量增加，病害出现了蔓延的高峰期；9月份后，随着气温下降，病害基本停止发展。单行种植和单棵零星分布的水杉的感病程度相对于已经郁闭成林的水杉要严重的多；用作行道树的水杉抗病能力较弱，易受病害的侵染，发病情况相对于农田中的水杉较为严重；生长势弱的水杉植株容易发生赤枯病，这一现象在行道树中表现尤为明显。引起水杉赤枯病的病原菌为细极链格孢（Alternaria tenuissima）和异角状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis heterocornis）。两种病原菌能够生长的温度范围为10~35℃，最适生长温度均为28℃。两种病原菌在pH为4~11的范围内都能生长，对生长环境酸碱度的适应性较强。不同光照处理仅对P. heterocornis的产孢量产生明显影响，在黑暗条件下培养的P. heterocornis产孢量明显少于其它处理。A. tenuissima在以葡萄糖为碳源的培养基上生长最快，而P. heterocornis在以甘露醇为碳源的培养基上生长最快。A. tenuissima在以甘氨酸为氮源的培养基上生长最快，而P. heterocornis在以硝酸铵和硫酸铵为氮源的培养基上生长最快。随相对湿度的降低两种病原菌分生孢子萌发率降低，P. heterocornis孢子萌发对湿度更加敏感，在相对湿度低于85%时基本停止萌发。病原菌主要以分生孢子和菌丝的方式在落叶中越冬，落叶上的分生孢子是主要的初侵染源。分生孢子借助空气和雨水进行传播，A. tenuissima的分生孢子于4月中旬开始飞散，数量逐渐增多，而P. heterocornis的分生孢子于7月中旬雨水增多时出现，且在阴雨天飞散数目较多。刺伤接种潜育期短于喷洒接种，随着温度的升高，病原菌的潜育期逐渐缩短。苯醚甲环唑对A. tenuissima菌丝生长的抑制效果最好，EC50为0.3892μg/ml，其次是代森锰锌，EC50为8.7644μg/ml。多菌灵对P. heterocorni菌丝生长的抑制效果最好，EC50为2.3948μg/ml，其次是苯醚甲环唑，EC50为2.7059μg/ml。在室外防治中，苯醚甲环唑和纯白多菌灵防治效果最好，在稀释1000倍时，抑制率能达到80%以上，其次为甲基硫菌灵和腐霉利。平板对峙中，木霉JK-TS5对两种病原菌的抑制作用最强，其次为木霉Cfa-82907，两种真菌对病原菌的抑制作用都在30%以上。洋葱伯克霍尔德菌NSM-05对两种病原菌的抑制作用分别达到72.6%和84.2%，JK-007对病原菌的抑制作用也达到了59.8%和79.8%。拮抗真菌的摇培滤液对孢子萌发的抑制率为20~30%，而拮抗细菌的摇培滤液原液对病原菌的孢子萌发有较强的抑制作用，而且随着稀释倍数的增加，滤液对孢子萌发的抑制作用明显减弱。
李姝江[7]2013年在《杂交竹梢枯病菌蛋白毒素及其精确作用机制研究》文中研究表明暗孢节菱孢菌是引起四川栽培区杂交竹梢枯病的新病原,其致病机理研究不深入,特别在该菌蛋白毒素方面的研究尚为空白。本论文以该病原为对象,在研究其蛋白毒素诱导因子基础上,对蛋白毒素进行分离纯化、组分和分子结构、基本性质的分析,探索蛋白毒素对杂交竹生理代谢影响规律,弄清其作用浓度临界值,比较病菌与蛋白毒素对杂交竹伤害的生理学差异；并通过毒素免疫化学方法标记分析蛋白毒素结合位点和探索蛋白毒素对杂交竹嫩枝离体线粒体生物物理特性及呼吸作用的影响。获得以下主要研究结果：1.在采用单因素筛选最佳培养基及其成分的基础上,运用正交试验确定诱导暗孢节菱孢产蛋白毒素的温度、时间、pH、光照、瓶装量、接种量六个因素,从而得出最优诱导方案为：在改良Fries培养基+杂交竹煎汁为基础培养基中,乳糖等量代替葡萄糖；温度25℃,pH7,黑暗条件下,1块菌丝块(5mm)接种于80mL培养液(300mL叁角瓶)振荡培养15d。在此诱导方案下,梢枯病菌产毒能力显着提高,杂交竹嫩枝感病指数在96h时高达85.69%。2.采用硫酸铵分级沉淀法对暗孢节菱孢的发酵上清液进行盐析,生测结果显示上清液没有活性,沉淀有活性,其盐析的最适饱和度为50%。此粗提物经SephadexG-50分子筛层析、High Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析后获得1个活性峰,SDS-PAGE电泳检测该峰为单一条带,以相对迁移率(mR)算得该蛋白的分子量为34.5kDa。将该峰进一步用RP-HPLC的方法进行纯度检验,经洗脱后得到2个峰,活性检测表明出峰时间为21min的峰2具有致萎活性,并命名为AP-toxin。采用Edman降解法成功测定了AP-toxin的N端13个氨基酸序列,即H2N-Pro-Pro-Ser-Gln-Val-Gln-Arg-Ala-Pro-Glu-Leu-Thr-Ser。经NCBI蛋白质数据库比对分析,推断该蛋白毒素与Phytophthora sojae的hypothetical protein PHYSODRAFT_563177氨基酸残基序列100%同源。对AP-toxin'性质研究的结果表明,该毒素耐温度范围为0-80℃、耐酸碱的范围为pH4-10、耐白炽光却不耐紫外线照射,对蛋白酶K和胰蛋白酶具有较好的耐受性,有一定专化性、介于专化性与非专化性毒素之间。3.采用针刺法对AP-toxin进行田间致病力检测,结果显示不同浓度AP-toxin处理的杂交竹针刺处均出现不同大小的褐色菱形病斑,与用A.phaeospermum菌悬液处理的一致,但反应快于病原菌；40、80μg/mL AP-toxin处理从15d开始与A.phaeospermum菌悬液处理的差异不显着。在不同杂交竹品种中,AP-toxin有效起始作用浓度不同：对抗病品种(3号和6号杂交竹)的有效起始作用浓度为10-20μg/mL；对感病品种(8号和30号杂交竹)的有效起始作用浓度为5-10μg/mL。4.采用浸渍法测定AP-toxin对4个杂交竹品种生理代谢的影响。毒素处理后,酚代谢的总酚和类黄酮含量先上升后下降,大小顺序均为6#>3#>30#>8#；核酸代谢中的总核酸、DNA、RNA含量均下降且DNase和RNase活性增加,但抗病品种中二者的降幅和增幅小于感病品种；蛋白质代谢中的可溶性蛋白含量先上升后下降,抗病品种增幅明显大于感病品种,4个品种蛋白酶活性均升高；糖代谢中4个品种可溶性糖含量均呈显着下降趋势,但6#>3#>30#>8#,但还原糖含量变化规律相反,均不同程度升高,且大小顺序为8#>30#>3#>6#。同时,测定了毒素对杂交竹防御酶系(POX、 SOD、PAL、PPO、几丁质酶、p-1,3葡聚糖酶)活性的影响,抗病品种的POX活性先升高到峰值然后下降后又上升,后期趋于稳定；感病品种均显着下降。SOD、PAL活性动态变化的规律均为初期升高而后期下降的趋势,大小顺序为6#>3#>30#>8#。抗病品种PPO活性0-72h大幅增加,之后下降保持一定水平；感病品种在36h时达到峰值,随即下降,在96h已低于无菌水对照组。4个品种几丁质酶活性均在0-36h内显着升高,但感病品种和抗病品种间差异显着。抗病品种p-1,3葡聚糖酶活性在0-240h内该酶活性迅速升高,至240h均达到峰值,之后有所下降但始终高于初始阶段；感病品种在整个测试期内其酶活均缓慢下降,但8号下降趋势更为明显。5.结合AP-toxin处理后杂交竹的症状表现及感病指数,以及AP-toxin伤害与杂交竹生理代谢的相关性分析,结果显示,总酚和类黄酮含量与抗性显着相关,而与感病指数显着负相关,但类黄酮含量与时间不相关；核酸代谢的五项指标与时间和抗性均显着相关,总核酸含量和RNA含量与感病指数呈显着负相关；蛋白质代谢中的蛋白酶活性与感病指数相关性不显着外,其余均达到显着水平；可溶性糖含量与时间、抗性、感病指数相关性达到极显着水平,而还原糖除与抗性极显着负相关外,与时间和感病指数相关性不显着。在6种防御酶活性中,与抗性呈显着或极显着正相关,而与感病指数呈负相关,但仅POX和β-1,3葡聚糖酶与时间显着正相关。另外,感病指数与时间呈极显着正相关,与品种抗性之间为极显着负相关。6.以AP-toxin免疫新西兰白兔制备毒素特异性抗血清,并将该蛋白用不同浓度的抗体吸附后处理杂交竹幼嫩枝条。结果表明,毒素所引起的症状有不同程度的减轻,说明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点;利用竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交竹嫩枝的质膜制剂与毒素蛋白的结合活性显示,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点,且不同品种的结合活性有差异；胰蛋白酶和加热处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体反应的抑制作用消失,证实质膜制剂中与毒素结合的是蛋白类物质。7.采用不同检测技术(如荧光偏振法、中性红法、氧电极法等)测定AP-toxin对杂交竹嫩枝线粒体膜的流动性、表面电位、肿胀度、聚集度及脂质过氧化物MDA、 H2O2、辅酶Q10(COQ1O)含量、线粒体呼吸功能的影响。结果表明,蛋白毒素胁迫使线粒体膜流动性减弱、表面电位减低、肿胀度增大、聚集度降低；CoQ10含量下降,H2O2、MDA含量的增加,细胞色素C氧化酶(CCO)、ATPase活性亦下降,呼吸控制率(RCR)和磷氧比(P/O)明显降低,说明蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体膜造成损伤,线粒体脂质过氧化程度增加,膜完整性被破坏,呼吸作用受抑制。
韦继光[8]2004年在《罗汉松科、山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究》文中研究指明内生真菌(endophytic fungi)是一类在健康植物组织内定殖，但不引起病害症状的真菌。植物内生真菌是自然界生物多样性的重要组成部分，内生真菌多样性调查常以植物的属或种为单位来开展，而对单一类群内生真菌的多样性研究很少。自Espinosa-Garcia et al．(1990)首次报导枯斑拟盘多毛孢(Pestalotiopsis funerea)是红杉的重要内生真菌后，已有7种拟盘多毛孢被报导是内生真菌。大量研究报告表明拟盘多毛孢是植物内生真菌的重要类群，其代谢产物种类丰富，包括一些抗癌和抗菌物质，具有良好应用前景。传统拟盘多毛孢属与近缘属分类学主要依据形态学特征，种间界限重迭，不能反映系统关系，有必要进行分子系统学研究。开展内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属系统学研究，将为开发和利用这类资源提供必要的基础，同时也有助于探索和建立符合自然的拟盘多毛孢属分类体系。 作为中国真菌志拟盘多毛孢属及相关属研究的一部分，本论文以罗汉松科、山茶科和红豆杉科等园林木本植物为对象，在我国南方的杭州、南宁和昆明等地开展内生拟盘多毛孢资源、多样性的调查，并通过对拟盘多毛孢分类学性状和分子系统学的研究探讨拟盘多毛孢属的系统学关系。 1 罗汉松科、山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢种类 2001—2003年先后罗汉松(Podocarpus macrophyllus)和竹柏(P.nagi)、山茶(Camellia japonica)、茶(C.sinensis)、金花茶(C.nitidissima)、油茶(C.oleifera)、茶梅(C.sasanqua)、南山茶(C.reticulate)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis)及南方红豆杉(T.chinensis var.mairei)等园林植物300多号标本，分离了18000多块健康的植物组织，得到内生拟盘多毛孢865个分离物，根据Guba(1961)，Nag Raj(1993)的分类系统及其它有关文献对菌株进行鉴定。共鉴定内生拟盘多毛孢25种，其中有3个新种，1个国内新纪录，4个新组合，15个种是首次报道为内生拟盘多毛孢。 新种： 昆明拟盘多毛孢(Pestalotiopsis kunmingensis，sp．nov．)，从云南昆明的罗汉松叶片组织分离到，其特点是分生孢子基部附属丝分叉，分生孢子大小为33.8—46.8×7.5—10μm(平均41×8.6μm)，具有长且顶端膨大的顶生附属丝(14.3—52.7μm)。 云南拟盘多毛抱(尸estatoti叩515 yunnaneisis sP.nov.)，从云南昆明的罗汉松枝条组织分离到，其特点是分生抱子具有顶端附属丝3一7根，分生抱子大小为26一33.8/6.5一8.2林m(平均28.8/7.2拼m)。 杭州拟盘多毛抱(尸e“口z口灯弓”15 ha昭幼口uensl’s sP.nov.)，从浙江杭州和云南昆明的茶枝条组织分离到，其特点是其分生抱子具有顶端附属丝2一9根，无基部附属丝，分生抱子大小为31.2一如.3/6.9一9.2卿(平均35.4/8.1脚) 国内新纪录:卡斯特尼拟盘多毛抱(尸estaloti勿”ts加rstenii(S acc.&Syd.)Stey.) 新组合:布利拟盘多毛抱尸estalotioPsis briOSiana(Montem.)，comb.nov.，拟芍药拟盘多毛抱尸estaloti侧”isp‘eonl’ic口la(Tsuk田的ota&Hino)，comb.nov.，亚角质层拟盘多毛抱刀召‘talotiopsis subcuticular钻(G uba)，comb.nov.，窒息拟盘多毛抱尸已‘talotioPsiss之劝两Cata(EIL&Ev.)， eomb.nov. 其它首次被鉴定为内生拟盘多毛抱的种类:水生拟盘多毛抱(尸estatoti叩515 aquatiCa)，棒状拟盘多毛抱(尸clavl’sPOra)，颊锥饱拟盘多毛抱(尸con王gena)，青锁龙拟盘多毛抱(尸crassi哪cula)，异角状拟盘多毛抱(尸.heteroco二l’s)，芒弗里亚拟盘多毛抱(尸ma馆扣lia)，弥泽那拟盘多毛抱(尸menezes~)，忽视拟盘多毛抱(尸negleCta)，橄榄色拟盘多毛抱(尸口打v口‘ea)，沙针拟盘多毛抱(p osy ridl:，)，欧克安拟盘多毛抱(尸“弓心”thl’)，芍药拟盘多毛抱(尸Paeonl’ae)，石楠拟盘多毛抱(尸Ph口tl’niae)，杜鹃拟盘多毛抱(尸rkododendrt)，环带拟盘多毛抱(尸之口”口公)。 通过调查发现，植物内生拟盘多毛抱的种类丰富，在调查过的植物种类每一种植物都能找到至少2种以上(含2种)的内生拟盘多毛抱，内生拟盘多毛抱可以在植物地上各部位内生，从枝条组织容易分离到。2内生拟盘多毛抱的多样性2.1内生拟盘多毛抱与宿主植物的关系 不同宿主植物其内生拟盘多毛抱的物种多样性是有差别的，其中从罗汉松分离到的内生拟盘多毛抱种类达16种，从茶梅分离到8种，从金花茶、茶和竹柏各分离到5种，从山茶分离到4种，从油茶、云南红豆杉、南方红豆杉各分离到3种，从南山茶分离到2种。内生拟盘多毛抱的分离率与该植物的内生拟盘多毛抱的物种多样性并非成比例，云南红豆杉和南方红豆杉的内生拟盘多毛抱的分离率最高，但其物种多样性并非最丰富。 内生拟盘多毛抱的宿主范围)’‘，多数拟盘多毛抱种的宿土植物涉及多科植物，如 V川尸召了故勿才奴卿z’sPhOtiniae在山茶、茶梅、罗汉松、短叶罗汉松、竹柏、南方红豆杉等叁科植物上都可分离到。2.2植物内生拟盘多毛抱的定殖状况 多数植物叶片的内生拟盘多毛抱?
韩珊[9]2009年在《寄生隐丛赤壳菌毒素化学及其致病机理的研究》文中进行了进一步梳理本论文在研究板栗疫病的病原菌产毒条件的基础上,通过有机溶剂浸提获得了病菌的粗提毒素,用生物测定的方法明确了所提取的粗毒素的致病作用及致病范围,并用粗毒素进行了抗性鉴定:进一步采用柱层析、HPLC分析等从粗提毒素中获得了毒素纯品,用质谱、核磁共振、红外光谱对毒素的分子结构进行了鉴定:在板栗植株和细胞的水平,通过对其生理生化的测定及组织超微结构的观察进行致病机理的研究:并以Cp-Ⅱ毒素为诱导因子诱导具有抗性的板栗愈伤组织,获得如下主要结果:1.寄生隐丛赤壳菌在供试的液体培养基中可以产生对板栗有毒性作用的毒素,为了得到寄生隐丛赤壳菌的最佳产毒条件,本实验对该病菌的产毒培养条件及致病范围进行了研究。结果表明:不同培养液的产毒能力有明显的差异,7种培养液中,PD+板栗煎汁培养液产毒能力最强；栗疫病病菌产毒能力以培养温度为26℃,培养基pH值为6,振荡培养(120 r/min)条件下培养18 d生物活性最强;最佳氮源为蛋白胨,较好的碳源为糊精。试验选择中国板栗当年生幼嫩枝条进行粗毒素生物检测,表明培养得到的毒素原液具有一定的毒性。通过对致病范围的测定结果显示,在供试的25科33种植物中除对板栗有致病作用外,对其它不同科属的多种植物也具有致病活性,表明该毒素是一种非专化型毒素。2.寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)经液体培养,石油醚萃取其发酵液获得对板栗带叶嫩枝具有致萎活性的粗提物,以氯仿:石油醚:甲醇(6:2:2)、正丁醇:水:甲醇(8:1:1.5)作洗脱剂,粗提物经硅胶色谱分离,共得到3种纯毒素,分别为Cp-Ⅰ、Cp-Ⅱ、Cp-Ⅲ,3组份都对板栗幼苗致萎活性较高。质谱、核磁共振和红外光谱测定表明:Cp-Ⅰ分子量为278,化学式为C_(16)H_(22)O_4,化学名称为:dibutyl phthalate;Cp-Ⅱ分子量为157,化学式为C_9H_(19)ON,化学名称为1-(4-ethylpiperidin-1-yl)pmpan-2-one;Cp-Ⅲ分子量为128,化学式为C_7H_(14)ON,3-propylmorpholine。其化学结构式分别为:3.应用酶活力测定的方法,研究板栗Castanea mollissima Blume不同抗性品种叶组织经栗疫菌Cryphonectria parasitica毒素Cp-处理后对其过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响。结果表明:适宜浓度(25-50μg/mL)的Cp-Ⅱ毒素处理板栗叶片,能提高保护性酶SOD、POD、CAT、APX、PPO和PAL的活性,抗病品种(北裕2号)活性变化幅度最大；随着毒素处理浓度升高,活性氧清除系统开始受到破坏,各品种的酶活性相继下降:Cp-Ⅱ毒素处理浓度达200μg/mL时,破坏了板栗叶片中的抗氧化酶系,造成活性氧过量积累,APX、PPO和PAL的活性随之降低,最终导致植物受到伤害最终导致植物受到破害;可溶性蛋白和可溶性糖含量先升后降,电导率和MDA含量升高,保护性酶SOD和CAT的活性升高及POD活性下降。Cp-Ⅱ毒素引起寄主的这种生理生化规律性变化可作为抗性鉴定的一种评价指标。4.用寄生隐丛赤壳菌产生的具致萎活性的Cp-Ⅱ毒素处理板栗带叶嫩枝,研究毒素对叶组织、茎组织超微结构的影响。结果表明:清水处理后的板栗叶片,其叶肉细胞超微结构比较清晰,细胞质致密,可见排列整齐的细胞结构。随着毒素浓度的增加,叶细胞的细胞壁变形,质壁分离,质膜断裂,叶绿体膜、线粒体膜、核膜膨胀、断裂,内部间质电子透明化,叶绿体片层排列紊乱,线粒体脊膨胀甚至消失,损害发生早和严重的是叶绿体片层和质膜,抗病品种的膜系统比感病品种的受害轻。茎组织经毒素处理后,感品种茎组织细胞均出现细胞壁变形甚至断裂,质膜断裂,叶绿体变形严重,类囊体片层解体,叶绿体膜膨胀、断裂;抗病品种变化较小。5.本研究以栗疫病抗病品种北裕2号和感病品种红光愈伤组织为材料,用Cp-Ⅱ毒素处理板栗愈伤组织,对处理后的愈伤组织进行细胞超微结构观察,测定其体内β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶活性,筛选具有抗性的愈伤组织。结果显示:Cp-Ⅱ毒素处理后的红光细胞膜对毒素的作用最敏感,北裕2号的愈伤组织变化较红光出现的晚；对毒素处理的愈伤组织的几丁质酶与β-1,3-葡聚糖酶活性测定结果表明,抗病品种比感病品种酶的活性增加幅度大、时间早,且两种酶的活性在毒素处理后均不同程度地高于对照;Cp-Ⅱ毒素浓度为50μg/mL胁迫愈伤组织28 d以后,经抗性分析感病病品种更易诱导出具有抗性的愈伤组织。
黄小兰[10]2017年在《柑橘胶孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究》文中进行了进一步梳理炭疽病是严重影响柑橘采后贮藏的重要病害,半知菌亚门炭疽菌属的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)为柑橘炭疽病的主要致病菌,有较强的致病能力,能引起贮藏期间的柑橘产生病斑甚至腐烂,造成严重的经济损失。目前国内对柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生长特性及其拮抗菌筛选等方面,对于胶孢炭疽菌毒素致病性的报道较少。国外有关胶孢炭疽菌毒力大小的研究指出环境p H、病原菌的分泌蛋白和编码与致病力有关的基因是病原菌的毒力因子,改变p H等条件会影响病原菌的致病力。然而,这些报道主要集中在毒素的产生条件、结构分析和是否具有寄主专化性等。本试验研究了胶孢炭疽菌的最佳产毒培养基以探究最适产毒因子;毒素的粗提取以及粗毒素对柑橘显微结构以及生理代谢的影响以探究毒素的致病性;对羟基苯甲酸对采后柑橘的抗性诱导以探究柑橘贮藏的新方式等。主要研究结果如下:1、体外培养胶孢炭疽菌,通过改变培养基的类型和成分来研究最佳产毒培养基。研究表明:不同类型的培养基中察氏培养基产生的毒素能在柑橘上形成较大病斑;改变察氏培养基中碳源、氮源和无机盐的种类可以影响毒素的生成,最佳的碳源为果糖,氮源为硝酸钠,无机盐为磷酸氢二钾;通过四因素四水平正交实验研究产毒的最适培养条件,分别为温度30℃,时间19天,转速100 r/min,p H为8。在此条件下产生的病斑直径为5.39±0.22 mm。2、在最适产毒培养基的基础上,通过比较硫酸铵分级沉淀法和不同极性有机溶剂浸提法来研究胶孢炭疽菌毒素的粗提取,得出甲醇浸提后得到的上清液能产生最大的病斑。经基本化学本质分析得出粗毒素含有的主要成分为酮糖、蛋白或氨基酸等极性物质。高温和改变p H值均会影响粗毒素的活性。3、将得到的粗毒素配制成不同的浓度以研究粗毒素对柑橘果皮显微结构的影响,得出随着粗毒素浓度的增加以及培养时间的延长,粗毒素对柑橘果实细胞造成的伤害也越大,果皮细胞呈现出皱缩和破裂的形态。其原因可能是粗毒素中含有能够水解细胞壁的相关酶类以及某些致病成分。4、研究粗毒素对柑橘生理代谢的影响可知:胶孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果实产生典型的病斑症状,且使丙二醛含量显着增高,细胞壁成分含量降低。当毒素浓度较低时,果实病斑直径与多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、类黄酮以及木质素含量呈正相关;与纤维素、半纤维素和果胶含量呈负相关。毒素浓度增高时,果实机体及防御酶系统遭到破坏,酶活急剧下降。胶孢炭疽菌粗毒素能影响柑橘果实生理代谢,引起果实发病,最终导致病斑的形成。由此证明毒素在胶孢炭疽菌对柑橘的致病过程中起到重要作用。5、对羟基苯甲酸能够诱导采后柑橘果实的抗性,延长柑橘保质期。试验中可知对羟基苯甲酸对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抑菌活性,浓度越高,对病原菌的抑制作用越强。经对羟基苯甲酸处理的柑橘果实中,抗性相关酶活性升高,丙二醛含量下降。并且对羟基苯甲酸诱导的抗性相关酶在整个试验过程中维持较高的活性。对羟基苯甲酸处理对采后柑橘炭疽病病原菌有较强的抗菌作用,能提高柑橘果实相关抗性酶活性以及抑制膜脂过氧化反应,诱导其果实抗性。对柑橘采后贮藏保鲜具有重要意义。
参考文献：
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[8]. 罗汉松科、山茶科和红豆杉科植物内生拟盘多毛孢的多样性及拟盘多毛孢属分子系统学研究[D]. 韦继光. 浙江大学. 2004
[9]. 寄生隐丛赤壳菌毒素化学及其致病机理的研究[D]. 韩珊. 四川农业大学. 2009
[10]. 柑橘胶孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究[D]. 黄小兰. 西南大学. 2017