云南省丽江市疾病预防控制中心 674100
摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。
关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法
连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。
1.材料与方法
1.1仪器和试剂
标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。每进行稀释一次菌液，都要换用1次1ml的无菌吸管[2]，依次稀释到10-9，将2ml菌悬液分别加入2个无菌平皿，将单增李斯特显色培养基放满平皿，培养24小时，温度控制在36℃，计数平皿中天蓝色、大小适中，周围有白色晕环的菌落数，作好空白对照。
1.2制备样品和检验样品
制备样品：从市场采集10份熟食制品，检验阴性结果使用细菌培养法，得出检验结果为阴性结果后，按照每份50g分为5份，分别加入每个标准菌液混合拍打，再取出样品25g，加入225ml混合搅匀。将剩余的25ml保存在冰箱中。检验样品：将LB1增菌液取出40ml保存在冰箱，剩余的LB1按照单增李斯特的检验方法用MPN计数法进行定量检测和细菌培养法检测。将LB1和LB2分别进行荧光定量RCR检测。按照2d至6d后，将样品进行MPN计数法定量检测。
1.3统计学分析
利用统计学软件SPSS20.0对数据进行统计并加强分析，用（x±s）表示计量资料，组间差异用t进行检验，用（%）表示计数资料，组间比较用X2检验，P＜0.05具有统计学意义。
2.结果
2.1比较两种方法检测结果
在研究中，样品增菌LB1经过24小时培养和LB2经过18小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法检测。在10-7细菌培养法和PCR法LB1增菌培养比较时，10-7具有统计学意义（P<0.05）。细菌培养法和PCR法LB2增菌培养后进行比较，差异不具有统计学意义（P>0.05），具有可比性。
2.2不同时间MPN计数法检验结果比较
经检测，加标识的样品定量检测同时进行MPN计数法定量检测，2d后用冷藏的LB1增菌液定量检测结果和MPN定量检测结果一致，6d后冷冻加标样品和冷冻6d后重新取样定量检测的结果有差别，差异具有统计学意义（P<0.05）。
表1比较两种方法检测结果（x±s）
3.讨论
利用实时荧光定量PCR法检测单增李斯特具有准确性和快捷性。国标中单增李斯特菌常用的三种检验方法为单核细胞增生李斯特氏菌定性检验、单核细胞增生李斯特菌MPN计数法和单核细胞增生李斯特菌平板计数法[3]，主要通过制备培养基、处理样品增菌和生化试验等，用时较长，分离培养受到多种因素的影响。实时荧光定量PCR法是利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准的曲线对未知模板进行定量分析，有效解决PCR污染问题，使结果更加直观明确。
在本次检测中，实时荧光定量PCR法优于细菌分离培养法。样品增菌LB124小时和LB218小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法检测。细菌培养法和PCR法LB1增菌培养比较时，10-7具有统计学意义（P<0.05）。PCR法LB2增菌培养不具有统计学意义（P>0.05）。将不同时间MPN计数法检验结果进行比较，2d后用冷藏的LB1增菌液定量检测结果和MPN定量检测结果一致，6d后冷冻加标样品和冷冻6d后重新取样定量检测的结果有差别，差异具有统计学意义（P<0.05）。应用实时荧光定量PCR法检测，提高了检测效率和加快样品的筛选，加强食源性致病菌监测工作效率，减低费用。
综上所述，实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，提高监测的灵敏性，使工作效率得到提升。
参考文献：
[1]董庆利，陆冉冉，汪雯，et al.案板材质对单增李斯特菌在生熟食品间交叉污染的影响[J].农业机械学报，2016，47（3）：207-213.
[2]齐颖颖，吴萌，王怡雯，et al.单增李斯特菌单克隆抗体的研制及特性分析[J].食品与生物技术学报，2016，35（2）：151-155.
[3]张俊彦，梅玲玲，徐昌平，et al.EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究[J].中国人兽共患病学报，2017，33（11）：1007-1012.
作者简介：杨瑞娟（1984年1月~）价格：云南丽江 民族：纳西族 职称：主管检验技师 学历：大学本科（2007年7月毕业于佳木斯大学医学检验专业，2007年10月考入丽江市疾病预防控制中心就职从事微生物检验工作至今）主要从事：微生物检验。
论文作者:杨瑞娟
论文发表刊物:《健康世界》2019年13期
论文发表时间:2019/10/30
标签：李斯特论文; 定量论文; 荧光论文; 样品论文; 实时论文; 细菌论文; 统计学论文; 《健康世界》2019年13期论文;