于艳 游松 孙非非
（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）
【摘要】 目的：改良从污水中提取大肠杆菌噬菌体的方法。方法：采用对大肠杆菌噬菌体敏感的大肠杆菌C3000菌株作为宿主菌，简化从污水中提取大肠杆菌噬菌体的操作。结果：方法改良后，可通过简单操作获得大肠杆菌噬菌体。结论：改良后的方法适用于一般实验室从污水中提取大肠杆菌噬菌体。
【关键词】大肠杆菌C3000菌株；大肠杆菌噬菌体
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）19-0389-02
A modified method for isolation of coliphage from wastewater
Yu Yan You Song Sun Feifei （Shenyang Pharmaceutical University 10163）
【Abstract】 Objective To modify the method for isolation of coliphage from wastewater. Methods Simplified operation in isolation of coliphage from wastewater by using E.coli（C3000）as a host strain. Results The coliphage could be regenerated by simple operation. Conclusion The modified method is easy, rapid and effective .It is can be used under general laboratory condition.
【Key words】E.coli（C3000）; coliphage
新生牛血清作为细胞培养的重要基质，是生物制品生产过程中的重要原辅料。噬菌体在自然界中分布广泛，是新生牛血清最易污染的一类特异性病毒。美国FDA及《中国药典》中均规定新生牛血清需进行大肠杆菌噬菌体检查。由于噬菌体对寄生的宿主菌具有高度特异性，而污水中常有肠道菌，故本法从污水中分离大肠杆菌噬菌体。本次试验所用宿主菌为对大肠杆菌噬菌体敏感的大肠杆菌C3000菌株。
1.材料与方法
1.1 主要材料
噬菌体来源：污水；宿主菌：大肠杆菌C3000菌株
培养基：胰酪大豆琼脂培养基，胰酪大豆肉汤培养基；稀释液：0.9%氯化钠溶液
试剂：40%甘油溶液
1.2 主要仪器
L型涂布棒；冻存管；离心管（15mL、50mL）；薄膜过滤器（0.45um、0.22um）；生物安全柜；恒温培养箱；离心机。
1.3 实验方法
1.3.1污水中大肠杆菌噬菌体的扩增 将污水置30～35℃恒温培养箱中培养18～24h后，吸取2mL污水接种至100mL胰酪大豆肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24h。
1.3.2大肠杆菌C3000菌株菌悬液制备 取1支2代大肠杆菌C3000菌株在生物安全柜内打开，划线接种在胰酪大豆琼脂培养基上，置30～35℃培养18～24h后，用5mL已灭菌的0.9%氯化钠冲洗菌苔，制成菌悬液。
1.3.3制备大肠杆菌噬菌体增殖液 将1.3.1中污水样品经3000 r/min，离心15 min后，取上清液通过孔径为0.45um的薄膜滤菌器过滤。将滤液继续通过孔径为0.22um的薄膜过滤器过滤。取5mL滤液加入100mL胰酪大豆肉汤培养基中, 同时加入1.3.2中大肠杆菌C3000菌悬液5ml，30～35℃培养18～ 24 h。
1.3.4制备噬菌体裂解液 在上述混合培养的培养液中加几滴氯仿，3000r/min，离心15min，离心后的上清液依次经0.45um、0.22um薄膜过滤器过滤，获得噬菌体裂解液。取10mL裂解液，按5mL/支，加入100mL胰酪大豆肉汤培养基中，分别置20～25℃、30～35℃进行无菌检查，确认无菌生长。
1.3.5大肠杆菌噬菌体侵染大肠杆菌C3000菌株试验 按1.3.2中操作制备大肠杆菌C3000菌悬液,用L型涂布棒在胰酪大豆琼脂平皿表面涂布均匀, 待菌液吸收后，将平皿置30～35℃培养6h。取过滤后的噬菌体裂解液滴加于平板表面, 正立放置平皿，于30～35℃温箱内培养24h后，确认平皿表面滴加滤液处是否出现透明无菌生长区。
1.3.6大肠杆菌噬菌体的保存 将经过确认无菌生长的大肠杆菌噬菌体滤液与灭菌40%甘油溶液按0.5mL/0.5mL装入冻存管中，低于-70℃保存。
2.结果
2.1 噬菌体裂解液的无菌检查结果为无菌生长。
表1噬菌体裂解液无菌检查试验
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图中无色透明区域为大肠杆菌噬菌体侵染2.2大肠杆菌C3000菌株后形成的噬菌斑。
3.讨论
噬菌体具有体积微小，严格寄生等特性，大肠杆菌噬菌体作为阳性对照，在新生牛血清大肠杆菌噬菌体检查中至关重要。本次实验利用高敏的大肠杆菌C3000菌株作为宿主菌，从污水中提取大肠杆菌噬菌体。污水来源广泛，本实验中所用培养基为胰酪大豆琼脂培养基及胰酪大豆肉汤培养基，为实验室常备培养基，大肠杆菌噬菌体提取实验中所用实验材料及设备也为常规实验室所用设备，实验操作简单，能够快速获得大量大肠杆菌噬菌体，避免了以往噬菌体提取方法中实验材料多样，操作步骤繁琐的限制。大肠杆菌噬菌体侵染大肠杆菌C3000菌株试验时，将噬菌体直接滴在大肠杆菌C3000培养平皿上，未采用双层平板法，操作更易完成，培养结果良好，生物制品厂家在进行新生牛血清的大肠杆菌噬菌体检查时，可按照此法进行。本实验结果表明，通过改良后方法更易获得大肠杆菌噬菌体，且大肠杆菌噬菌体侵染大肠杆菌C3000菌株试验过程简单，为新生牛血清中大肠杆菌噬菌体检查结果的准确性提供保障。
【参考文献】
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[4] Young-Duck Lee,Jin-Young Kim,Jong-Hyun Park. Characteristics of coliphage ECP4 and potential use as a sanitizing agent for biocontrol of Escherichia coli O157:H7.Food Control, 2013, Vol.34 (2):255-260.
论文作者:于艳,游松,孙非非
论文发表刊物:《医药前沿》2016年7月第19期
论文发表时间:2016/7/27
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