王 乐1 包正阳2 孙 辉2 杭 景2 曾 建3 狄荣科3通讯作者
1.江苏大学医学院临床医学专业2010级；
2.江苏大学医学院临床医学专业2011级；
3.江苏大学医学院 江苏镇江 212013
【摘 要】目的：观察MPP合剂促进睡眠的作用及其安全性。材料与方法：采用最大耐受剂量法行急性毒性试验。一个月龄纯种ICR小鼠60只，分为实验组（MPP组）和对照组（NS组），每组30只，雌雄各半；2组分别灌胃MPP合剂或生理盐水1mg ，连续30天；观察一般状况，测量试验期初、期末体重，观察并记录小鼠入睡率，取材作组织病理学观察。结果：2组小鼠在相同的环境和喂饲条件下，一般状况无明显差异；比较MPP组和NS组试验期初和期末体重没有显著差异（p=0.552）；组织病理学观察，与NS组相比MPP组小鼠的肝脏、肾脏、脑和睾丸未见发生病理变化。观察小鼠入睡率，MPP组为76%，NS组为20%，MPP合剂明显提高小鼠入睡率（p=0.009）。结论：MPP合剂能有效促进睡眠和提高睡眠质量，未见对肝、肾、脑和睾丸毒性，属安全无毒级保健药品。
【关键词】 褪黑激素；珍珠粉；急性毒性试验；促睡眠作用
【中图分类号】R282.71 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0197-02
A test about the acute toxicity and sleep promoting effect of MPP mixture
Wang Le1 Bao Zhengyang2 Sun Hui2 Hang Jing2 Zeng Jian3 Di Rongke3*
(1. Clinic Class 2010 of Medical School in jiangsu University, 2. Clinic Class 2011 of Medical School in jiangsu University, 3. Medical School of Jiangsu University;Jiangsu Zhenjiang, 212013)
【Abstract】Objective：To observe the effect and safety of MPP mixture on promoting sleep. Material and methods：The maximum tolerated dose method of acute toxicity test was used in this study. 60 one month old purebred ICR mice were divided into experimental group (group MPP) and control group (NS group), 30 mice in each group with half male and half female. Two groups were orally fed for one month, the general condition and body weight were observed and measured, the tissues of liver, kidney, brain, and testis were taken for histopathological observation under microscope. Results：Under the same environment and feeding conditions, no significant difference in general condition were observed between the two group mice; there was no significant difference of body weight between MPP group and NS group at the early and end of the experimental piled (p=0.552); by histopathological observation, compared with NS group, the liver, kidney, brain and testis of MPP group mice did not find pathological changes. But, the sleeping rate was 76% in MPP group and 20% in NS group, there was significantly improve the sleep rate of MPP mixture (p=0.009). Conclusion：MPP mixture can effectively promote sleep and improve sleep quality, not on the liver, kidney, brain and testis toxicity, is safe non-toxic grade health care medicine.
【key words】melatonin; pearl powder; acute toxicity test; sleep promoting effect
褪激黑素（melatonin，MT））是一种主要由松果体分泌的神经内分泌活性物质。内源性褪激黑素具有调节机体睡眠-觉醒生物节律相位转换的作用[1]，外源性褪激黑素不仅能调节昼夜节律和改善睡眠，还具有清除自由基、抗氧化、抗炎症、抑制肿瘤生长、抗焦虑、延缓衰老等多种生理和药理功能[2]。MPP合剂是以一种褪激黑素和纳米级水溶性珍珠粉为主要成分的一种混合物，具有调节昼夜生物节律和镇静催眠的作用[3]。采用实验动物急性毒性试验方法，评价MPP合剂的安全性，同时观察其促睡眠作用，为临床使用提供安全依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
褪激黑素为原料药（西安楚康生物科技有限公司产品），纯度为99.8%；专营药店市售纳米级水溶性珍珠粉，细度1200目以上；左旋茶氨酸、维生素B-6等原料药产品由正规厂家提供，均为食用级无菌真空包装。
1.2 实验动物
一个月龄纯种ICR小鼠60只，随机分为实验组（MPP组）和对照组（NS组），每组30只，雌雄各半，分开饲养。动物由南京实验动物中心提供（动物合格证号：SYXK(苏)2013-0015）。
1.3 实验方法
1.3.1 喂养
试验前先进行适应性喂养，常规喂食和饮水，室温220C左右。用灯光控制，明：暗=12:12，即早上8:00时开窗帘和开灯，晚上20:00时关上窗帘并关灯，直至第2天8:00点，持续7d，使小鼠适应新的环境。此后，每天于20:00时给实验组动物胃饲MPP配方药物1ml，对照组胃饲1ml生理盐水，持续30d。1ml MPP合剂中MT3mg、珍珠粉966mg、左旋茶氨酸和维生素B-6等，共1000mg。先用少量无水酒精溶解MT，加入珍珠粉和其他原料，用生理盐水充分混匀，溶液里肉眼看不到气泡。
1.3.2 观察
（1）一般状况 每天分别在8:00时和20:00时观察小鼠两次，主要观察小鼠的毛发、尾巴颜色、运动情况、排便性状、进食情况等。
（2）生长发育状况 分别与实验的第1天和第30天对每一只小鼠进行称重，并作详细记录。
（3）活动/睡眠状况 在每天的8:00时和20:00时观察小鼠的死亡情况并做详细记录。
1.3.3 取材
灌胃30天后，将小鼠置入广口玻璃容器中进行乙醚吸入麻醉，打开胸腔暴露小鼠心脏，将磨平针尖的头皮针沿着左心室的方向，从小鼠的心尖部刺入1/3，并用血管钳固定，剪开右心耳放血，慢速灌注4%多聚甲醛缓冲液50ml进行固定。灌注固定1h后，取肝脏、肾脏、脑。观察肝脏、肾脏、脑的外形，后置于4%多聚甲醛固定液中进行后固定1w，以备随后的切片和染色。
1.3.4 切片制作和观察
取固定后的肝脏、肾脏、脑组织和睾丸块作石蜡切片，HE染色，光镜观察。比较实验组小鼠脏器与对照组的组织结构、细胞形态等。最后有2位三甲医院病理科资深医师确认有无组织变性、坏死，细胞和细胞核有无溶解等形态学变化。
2 结果
2.1 一般情况：
30d灌胃喂养观察，MPP组小鼠的皮毛比其他对照组小鼠皮毛更柔顺光滑，除灌胃前后以外，其他时间2组小鼠的活动正常，与对照组相比未见小鼠运动减少、困倦、惊厥、抽搐等现象，未见小鼠发生紫绀，大便性状正常。2组小鼠每天的进食和饮水正常。
2.2 生长情况
30天的灌胃喂养观察，MPP组小鼠的平均体重与NS组小鼠的平均体重均有明显的增加（p=0.012, p=0.032）；用药后，MPP组小鼠的平均体重与NS组小鼠的体重变化相比没有显著性差异（p=0.552）。（表1）
表1 MPP合剂对小鼠的体重的影响（g , x ± S ）
3 讨论
褪黑素是脊椎动物脑中松果体合成和分泌的高生物活性的内源性激素, 其化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。褪黑素具有调整生物钟、诱导睡眠、调节内分泌系统、维持内环境稳定等功能。内源性褪黑素的分泌从儿童期、青年期到老年期随着年龄增加而逐渐减少。人在40岁以后松果体萎缩，褪黑素的分泌大量减少，易于出现失眠多梦和睡眠障碍。许多研究显示褪黑素可以缩短睡眠潜伏期, 提高睡眠效率, 延长总睡眠时间[4,5]。
MPP合剂是一种以褪黑激素为主的水溶性合剂，具有明显的镇静催眠的作用。为了科学地评价其作为保健食品对失眠的改善作用，对其改善失眠的有效性进行验证，为褪黑素胶囊的相关研究提供依据[6,7]。
30天的喂养发现实验组的小鼠各项生理指标如毛发、食物消耗、活动度等与对照组没有显著差异。MPP组小鼠的平均体重变化与对照组相比没有显著性（P<0.05）。对2组的小鼠的HE石蜡切片发现小鼠的肝脏无假小叶形成及肝细胞的水肿变性，而且肝细胞的窦周隙、肝血管、各级胆小管均正常，肝脏指数与对照组相比无显著性；小鼠的肾脏切片发现肾脏皮质和髓质的细胞形态学正常，肾单位无病理改变；小鼠的脑的形态正常，脑细胞的形态无病理学改变，脑指数与对照组相比无显著性；小鼠的睾丸细胞亦无形态学异常，睾丸系数和对照组相比无显著性。
主要为通过调节机体的睡眠-觉醒生物节律相位转换，调节昼夜节律和改善睡眠。缩短入睡时间，有效保持睡眠时相，提高睡眠质量。广谱治疗睡眠障碍，长期有效，无耐药性和宿醉效应。MPP合剂能明显缩短入睡时间，有效保持睡眠时相，有效提高睡眠质量。合剂采用多种功能因子协同配伍，具有优化组合、提高疗效、减少副作用、提高生物利用率的特点[8-10]。
人体内褪黑素含量较少，常规剂量下服用无不良反应及毒性反应，文献报道睡眠障碍患者连续服用褪黑素3个月，剂量为3～30mg，检测证实褪黑素对肝肾功能及血、尿常规无明显影响，表明短期服用小剂量褪黑素是安全的，无明显副作用［11-13］。褪黑素作为一种内源性神经内分泌激素，具有剂量小作用强，毒性低，无成瘾性等优点［14,15］。目前国内有关褪黑素合剂相关的研究均未见褪黑素及合剂具有明显的细胞毒性和遗传毒性，与本实验的结果实相符。MPP合剂的急性毒试验证明了MPP合剂实属安全无毒级，长期服用是安全的［16-19］。
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图1组织病理学观察
D1 对照组睾丸（x20） D2实验组睾丸（x20）
图1说明：
A1、A2 肝脏：
光学显微镜下未见肝细胞变性坏死，未见肝细胞脂肪变性，肝细胞无肿胀肝窦无明显扩张，肝小叶结构完整，未见假小叶的形成。
B1、B2肾脏：
光镜下未见肾小球异常减少或增加，未见肾间质有炎细胞浸润，毛细血管管腔无扩张，未见管型，肾小管上皮细胞无变性坏死。
C1、C2脑 ：
光镜下未见小鼠大脑皮质和小脑皮质发生明显的病理学差异，颗粒细胞椎体细胞核浦肯野细胞均未见异常的形态和和分裂象及变性坏死与对照组相比。
D1、D2 睾丸：
雄性小鼠的睾丸曲细精管的结构与对照组相比未见明显差异，睾丸间质细胞和支持细胞均未见异常的细胞形态和核分裂象与对照组相比。
基金项目：
1. 江苏省科技基础设施建设计划（项目编号：BM2013058）；
2. 全国高等学校大学生创新创业训练计划项目（项目编号：10299030）。
作者简介：
王乐，男，（1990~），江苏大学医学院临床医学专业2010级学生，大学生创新创业训练计划项目负责人。
通讯作者：
狄荣科，男，江苏大学教授。
论文作者:王乐1,包正阳2,孙辉2,杭景2,曾建3,狄荣科3
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/3
标签：小鼠论文; 睡眠论文; 合剂论文; 褪黑素论文; 对照组论文; 未见论文; 毒性论文; 《中医学报》2015年8月论文;