王立锋1 朱昊平2 夏子茵1 徐 军1通讯作者
1.上海市闵行区中心医院妇产科 上海 201199；
2.上海市计划生育科学研究所 上海 200032
【摘 要】目的：检测LIM同源盒转录因子1ɑ基因(LMX1A)基因在不同程度病变组中宫颈组织中的甲基化水平，评估其作为宫颈上皮细胞癌变的分子标志物的诊断价值。方法：使用焦磷酸测序法检测每个抑癌基因的甲基化情况。比较正常组织和不同程度病变组织的甲基化水平的的差异。采用利用受试者工作特性曲线（ROC）确定癌变组与非癌变组之间的判别临界值。结果：宫颈癌中的LMX1A基因6个位点的甲基化平均水平为14.36%, 明显高于HG-CIN病变 的4.70%、LG-CIN病变的5.05%和NLM的4.53% (P<0.01)。检测LMX1A基因甲基化甲基化鉴别宫颈癌的ROC曲线下面积分别为0.603，敏感度与特异度之和的最大值所对应的界定值为10.66%，诊断浸润性宫颈癌的的敏感度为37%、特异度95%。结论：定量分析宫颈组织中LMX1A基因甲基化将有可能作为分子标志物用于浸润癌的鉴别中。
【关键词】LIM同源盒转录因子1ɑ基因；DNA甲基化；宫颈癌；焦磷酸测序法
【中图分类号】R737. 33 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0243-02
Quantitative analysis of LMX1A methylation for differentiation on cervical cancers and precursors
Wang Lifng 1 ,Zhu Haoping2, Xia Ziyin1, XU Jun1*,
(1. Department of Obstetrics & Gynecology, Central Hospital of Minhang District, Shanghai,201199,China)
(2. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research,Shanghai,200032,China)
Correspondence to:Xu Jun E-mail:xujun1958@hotmail.com
Funded by: Shanghai Health Bureau Project (20114152)
【Abstract】Objective：To estimate a quantitative measure of LMX1A methylation in detection of cervical cancer. Methods：The percentage of LMX1A methylation was tested by pyrosequencing in different level of lesions. The efficacy of LMX1A in diagnosis of cercical cancer was tested byROC curve. Results：The mean methylation value of the LMX1A gene in ICC were 14.36%, significantly higher than that in HG-CIN (4.70%), LG-CIN (5.05%) and NLM (4.53%) (P<0.01). The area under the ROC curve (AUC) was 0.603 for LMX1A gene methylation The optimal cut-off value for LMX1A gene methylation was set at 10.66% with the sensitivity of 37% and specificity of 95%. Conclusion：Quatitative measurement of LMX1A by pyrosequencing in cervical caner scraping is highly sensitive and it may have a potential value for diagnosis of cervical cancer in clinic.
【Key-words】LMX1A; DNA methylation; Cervical cancer; Pyrosequencing
宫颈癌的发病率和死亡率分别居于女性恶性肿瘤的第三位和第四位[1]。我国研究表明，若无有效干预,国内宫颈癌的年均新发病率将由2010年的27,000致130,000上升至2050年的42,000致187,000[2]。
高危型(HR)人类乳头状瘤病毒(HPV)的持续性感染是宫颈癌的病因[3，4]。宫颈上皮的癌变过程中DNA甲基化是最常见的表观基因改变,常常发生于肿瘤抑制基因的启动子区域,造成该基因的转录失活,使肿瘤发生。约70-100%的宫颈癌中可检测到DNA甲基化,且可见于约30-80%的宫颈癌前期病变中[5]。LIM同源盒转录因子1ɑ基因(LMX1A)是LIM同源盒基因家族的一员,近年来,越来越多的研究发现其表达失活和肿瘤的发生发展有关。该基因在宫颈癌、卵巢癌及头颈部肿瘤中因启动子甲基化而表达失活,提示其为抑癌基因。
我们以往采用甲基化特异PCR(MSP)的方法检测了CDH1、p16、SOX1、RASSFA1基因在宫颈癌前期病变和宫颈癌中的甲基化状态[6-10],本研究进一步采用焦磷酸测序技术定量(Pyrosequencing)分析正常宫颈、宫颈低级别病变,宫颈高级别病变以及宫颈鳞癌的脱落细胞中LMX1A基因的甲基化水平,以期探讨LMX1A基因甲基化定量检测在区分各级别宫颈病变中的潜在临床价值。
1 材料和方法
本研究标本收集时间为2011年1月至2013年4月，研究地点为上海市闵行区中心医院妇科门诊，收集研究对象的宫颈脱落细胞（经液氮保存）进行抑癌基因检测，同时留取对象宫颈组织进行病理学诊断并以此作为金标准。所有对象均排除妊娠、其他部位的恶性肿瘤史或免疫系统疾病史。本研究共纳入121例研究对象，其中经病理学诊断正常宫颈组织28例、低级别病变(CIN I) 32例、高级别病变(CIN Ⅱ-Ⅲ) 34例、宫颈鳞癌27例。CIN分型和宫颈鳞癌标本均经病理学检查证实。
1.2 方法
1.2.1 标本采集和保存
阴道镜下在活检获得组织病理，放于固定液中,并置于-40°C冰箱保存，分别送病理和焦磷酸测序检测。同时送检验科用捕获杂交法进行高危HPV-DNA检测。
1.2.2 DNA提取、化学修饰及基因扩增
参照德国Qiagen 公司试剂盒 QIAamp DNA Mini Kit的说明进行DNA提取,参照Qiagen公司 EpiTect Bisulfite Kit的说明对DNA进行亚硫酸氢盐处理。LMX1A基因转录调控区域的扩增采用巢式PCR。LMX1A基因扩增片段的外侧上游引物为:5’-TTTTTGAAAGTTGATTTGAAATG-3’; 外侧下游引物为:5’-ACCCTCACCTACCCCAAATC-3’。用PyroMark Assay Design 2.0软件进行内侧引物设计, LMX1A基因所用上游引物:5’- TTGAAATGTATTTAAGAGTGAG -3’ ;下游引物R1:5’- AAAAAAACACTATAAAAAACCC -3’端进行了生物素的标记。
1.2.3 焦磷酸测序
按照PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪中甲基化分析要求进行测序。首先制备单链DNA模板。然后进行焦磷酸测序反应。LMX1A所用测序引物为:GGTTTTTGYGYGTATTTTAATAGAG,可测得6个CpG岛; PAX1所用测序引物为:GGYGGTAGGTTTTGGAG，可测得9个CpG岛。在获得测序结果后,以每一基因所有检测位点的甲基化程度(%)的平均值来表示每份标本的该基因甲基化程度。
1.3 统计方法
LMX1A基因的甲基化水平采用均数±标准差 (x(_)±s) 表示,多组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两组间差异采用t检验。采用受试者工作特征曲线下面积(receiver operating characteristic curve,ROC)获得上述基因的甲基化检测用于诊断各级别宫颈病变的阈值及准确性。检验水准ɑ=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析采用SPSS 17.0统计软件。
2 结果
2.1 各组患者临床资料的比较
121例患者按照病理被分为 NLM组、LG-CIN组、HG-CIN组,及 SCC组。四组患者的平均年龄分别为36.2岁、38.3岁、39.7岁和44.4岁。SCC患者的年龄明显高于其他3组患者(P<0.01)。经HC-2检测, 四组患者高危型HPV的检测率分别为35.7%、81.2%、91.2%和92.6% (P<0.01)。(表1)
表1 各组间年龄均值、HPV定量均值和高危HPV阳性构成比的比较
2.3.1 各组患者病变组织中LMX1A基因甲基化水平的定量分析
表2比较了LMX1A基因基因在四组患者中的甲基化水平。宫颈癌组的LMX1A基因甲基化平均水平为14.36%, HG-CIN组 为4.70%,LG-CIN组为5.05%,无宫颈病变患者为4.53%。对四组资料进行单因素方差分析,四个病变组存在统计学差异(F=7.36,P<0.001)。四组之间比较,宫颈癌组与其他三组比较均有显著差异(P<0.01)。正常宫颈组(NLM)和低级别病变组(LG-CIN)和高级别组(HG-CIN)之间差异没有统计学意义(P>0.05)。
2.3.2 LMX1A基因甲基化水平诊断宫颈鳞癌的阈值分析
采用对宫颈病变组织中LMXA1基因甲基化水平的定量分析诊断宫颈鳞癌(宫颈鳞癌组VS其他各组)的ROC曲线下面积(AUC)为0.603,敏感度与特异度之和的最大值所对应的界定值为10.66%(敏感度37%,特异度95%)。ROC曲线详见图2。
图2 宫颈鳞癌LMX1A基因定量水平的ROC曲线(宫颈鳞癌组VS其他各组)
3 讨论
甲基化特异PCR(MSP)是最经典的检测基因甲基化的技术,该方法虽然简便有效,但结果判断需采用凝胶电泳,因此如运用于人群筛查,需要投入大量人力物力。且该方法只能做出甲基化和未甲基化的判断,无法对甲基化水平进行定量分析。焦硫酸测序技术在同一反应体系中经4种酶的协同作用,通过检测释放荧光的强度进行DNA的测序, 其优点在于高通量、快速、定量且结果直观[11]。该技术越来越多地被运用于基因甲基化的检测,并能对特定位点进行定量分析。
LMX1A的蛋白表达从正常宫颈上皮到低级别宫颈上皮内瘤变再到高级别宫颈上皮内瘤变中的表达是上升的,但在发展为浸润癌和出现远处转移后表达明显下降[12]。启动子的甲基化是该基因表达失活的重要机制,Lai等采用MSP和亚硫酸测序技术发现89.9%的宫颈鳞状细胞癌组织存在LMX1A基因的高甲基化,明显高于正常组织[13]。其后又采用实时定量甲基化特异PCR的方法发现浸润性宫颈癌中该基因的甲基化比率(percentage of methylation ratio,PMR)明显高于原位癌、CIN3、CIN2及CIN1病变[14]。本研究采用焦硫酸测序的方法进一步证实了LMX1A的甲基化出现在宫颈上皮恶性转化并形成浸润的阶段,而在癌前期病变中较少见。因此宫颈组织中该基因的甲基化检测可能在浸润癌和癌前期病变的鉴别中有价值。为了评估其临床运用价值,经ROC曲线下面积的计算其区分浸润癌和癌前期病变的最佳阈值定为10.66%, 该阈值下的特异度为95%,敏感性为37%。适合作为排除性诊断条件下较为有效的分子水平检测指标。
因此,本研究结果表明LMX1A基因的甲基化检测具有一定的临床价值，有可能作为分子标志物用于浸润癌的鉴别中。
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基金项目：
上海市卫生局科研课题计划（20114152）
论文作者:王立锋1,朱昊平2,夏子茵1,徐军1通讯作者
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/3
标签：基因论文; 宫颈论文; 甲基化论文; 宫颈癌论文; 组织论文; 引物论文; 水平论文; 《中医学报》2015年8月论文;