孙靖[1]2003年在《抗人晶状体上皮细胞膜单克隆抗体的制备及其作用的实验研究》文中认为白内障是世界范围内重要的致盲眼病，囊外摘除或超声乳化联合人工晶状体植入术是目前最有效的治疗手段，但术后的主要并发症后囊混浊，常引起术后视力再次下降，影响手术的远期效果。 研究表明手术引发的残留晶状体上皮细胞向后囊的增殖、移行、纤维化并分泌胶原等细胞外基质是后囊混浊形成的主要原因，因此防治的重点在于减少晶状体上皮细胞的残留并阻止其增殖和移行。大量的体外实验已经证实抗代谢药物如5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、柔红霉素等，环孢霉素A等皆可抑制晶状体上皮细胞的增殖和分化，但这些药物对眼内其他正常组织的毒副作用限制了其临床应用。如何实现药物对晶状体上皮细胞的特异性杀伤作用，减少毒副反应，是后囊混浊药物防治的关键问题。因此制备特异性识别晶状体上皮细胞而不与眼部其他组织发生反应的单克隆抗体，并以其为导向载体合成免疫导向药物，实现后囊混浊的靶向治疗，具有重要的临床实用价值和意义。 本课题以原代培养的人晶状体上皮细胞作为免疫原，使用杂交瘤技术制备了一组抗人晶状体上皮细胞膜单克隆抗体，间接ELISA法测定免疫球蛋白的亚类，用间接免疫荧光法、免疫组化方法对单克隆抗体进行特异性鉴定。BALB／c小鼠体内诱生法扩增单克隆抗体，用羟基磷灰石色谱法加以纯化，SDS-PAGE测定抗体的纯度。MTT比色法及光镜和透射电镜下观察单克隆抗体对体外培养晶状体上皮细胞生长的影响。结果如下： 1．本实验采用改良的组织块培养法，成功地建立了胎儿、成人、老年性白内障患者、兔晶状体上皮细胞的培养体系，本法简单、易行，重复性好，适宜推广。 2.通过脾内注射培养的人晶状体上皮细胞免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术成功制备了2株抗人晶状体上皮细胞膜单克隆抗体，命名为HILE4、HILE6，免疫球蛋白亚类均为I目随。脾内注射细胞免疫法不仅抗原用量少，而且缩短了免疫时间，对于某些稀有抗原或者急需制备单克隆抗体时可考虑采用。 3.该组单克隆抗体与人晶状体上皮细胞膜呈特异性反应，与眼内其他组织如角膜、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜均为阴性反应，与兔晶状体上皮细胞膜有交叉反应。 4.小鼠腹腔接种HILE6杂交瘤细胞，制得大量高滴度腹水，效价为1:8 000。经两次经基磷灰石色谱法纯化，5%~15%SDS一队GE分析结果显示，抗体的纯度为90%。经基磷灰石色谱法是一种快速、简便、有效地纯化IgM单克隆抗体的方法。 5.一定浓度的HILE6对人和兔晶状体上皮细胞的增殖有抑制作用，可引起细胞形态学的改变。 本研究成功地制备了能与人晶状体上皮细胞膜特异性结合的单克隆抗体，为进一步制备能主动选择性结合、特异性杀伤晶状体上皮细胞的免疫导向药物，实现后囊混浊的靶向治疗奠定了实验基础。
刘晓燕[2]2004年在《载药聚乳酸靶向纳米微粒的制备及眼疾与肿瘤治疗研究》文中认为本文以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为模型药物,聚乳酸为载体材料,牛血清白蛋白为乳化剂,采用改进的复乳法(W/O/W)制备载5-Fu聚乳酸纳米微粒,并对纳米微粒的粒径、载药率、包封率、产率、体外释放以及在眼科和肿瘤治疗方面的应用进行了考察与评价。SEM、TEM和激光粒度仪对载5-Fu聚乳酸纳米微粒表面形貌和粒径分布等表征表明,纳米微粒呈规则圆形,表面光滑,粒径范围在100～200nm。XPS对纳米微粒表面组成的测定验证了牛血清白蛋白(BSA)在纳米微粒表面的存在。采用紫外-可见光分光光度法测定纳米微粒的载药率、包封率和体外药物释放行为,结果表明:载药率与包封率随5-Fu浓度、BSA浓度的增加而增大;聚乳酸相对分子质量和纳米微粒粒径越小,纳米微粒药物含量越大,其药物突释量越大,释放速度越快。利用碳二亚胺法将抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体(HILE6)连接在纳米微粒表面,制备了具靶向功能的载5-Fu聚乳酸纳米微粒。MTT比色法测定聚乳酸载体材料的相容性以及靶向纳米微粒对晶状体上皮细胞的抑制作用,ELISA法检测联接后的抗体活性,间接荧光法和透射电镜考察靶向纳米微粒的细胞内化过程。结果表明,聚乳酸具有良好生物相容性;靶向纳米微粒中的HILE6免疫活性可达到84%,24小时对兔晶状体上皮细胞抑制率可达68.42%;靶向纳米微粒可以在HILE6的引导下30分钟内识别并附着于兔晶状体上皮细胞,4小时内进入细胞浆和细胞核,大部分集中于细胞核。利用相同方法将抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体连接在纳米微粒表面,制备载5-Fu聚乳酸靶向纳米微粒。建立SCID裸鼠人胃癌肿瘤移植模型,鼠尾静脉注射靶向纳米微粒,SPECT观察靶向纳米微粒在体内的分布情况,结果表明:靶向纳米微粒一小时后可到达靶区,通过计算瘤重抑制率检测其抗癌效果。研究发现,注射靶向纳米微粒11天后肿瘤体积及重量均显着下降。
刘新玲[3]2004年在《靶向晶状体上皮细胞载药纳米微球的制备及体外评价》文中指出白内障是世界范围内致盲的主要眼病，囊外摘除或超声乳化联合人工晶状体植入术是目前最有效的治疗手段。但术后并发症后囊混浊(posterior capsular opacification，PCO)，常引起术后视力再次下降，影响手术的远期效果。 研究表明，手术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)增殖、移行、纤维化是后囊混浊的主要原因。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)作为抑制晶状体上皮细胞增殖的抗代谢药物，已在预防后囊混浊的体内外研究中取得一定疗效。但在临床使用中，药物随房水排出快，有效浓度维持时间短，且会对眼内其他组织产生毒性，大大限制了它的应用。如何实现药物对晶状体上皮细胞的特异性杀伤作用，维持药物有效浓度，减少毒副作用，是后囊混浊药物防治的关键问题。因此制备以高分子材料为载体，以单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)为导向，连接抗代谢药物、毒素、核素等的载体药物，实现后囊混浊药物治疗的靶向性和长期性，具有重要的临床价值和意义。 本课题首先用复乳法制备了5-FU聚乳酸纳米微球，用激光粒径仪、扫描电镜和透射电镜观察微球的大小、表面形态和结构；并测定其载药率、体外药物释放曲线；MTT法测定其对兔晶状体上皮细胞的连续抑制作用。然后利用碳二亚胺法将抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体HILE6联接在微球表面，制备了免疫纳米微球。用反推法测定联接比例，ELISA法检测联接后的抗体活性，MTT法、间接荧光法和透射电镜观察免疫纳米微球对晶状体上皮细胞的抑制作用和内化过程。结果如下： 1．制备的5-FU纳米微球，球体大小均匀，平均粒径为191.0±0.202nm，载药率稳定在8.1％，缓释时间长达20天。微球不仅保持了对兔晶状体上皮细胞的天津医科大学硕士学位论文抑制作用，随时间的延长，在一定剂量下，抑制作用可超过原药。 2.聚乳酸空载纳米微球对兔晶状体上皮细胞、角膜基质细胞作用72天，无明显毒性作用，具有良好生物相容性，可用作眼部药物载体。 3一免疫载药微球中的单克隆抗体HILE6保留可达84%的原免疫活性，每分子单抗可携带1809分子的5一FU，24小时对兔晶状体上皮细胞抑制率可达68.42%。 4.免疫载药微球可在单抗的引导下30分钟内识别并附着于兔晶状体上皮细胞，4小时内进入细胞浆和细胞核，大部分集中于细胞核。 本研究成功制备了与抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体偶联的5一FU聚乳酸纳米微球载药系统，并进行了微球表征、体外抑制作用、免疫学特性、细胞内化过程的研究，为进一步在动物眼内实验及人体应用奠定了体外实验的基础。
马成霞[4]2018年在《EphA2在地塞米松作用的人晶状体上皮细胞中的表达变化及其意义》文中认为背景:糖皮质激素性白内障(glucocorticoid induced cataract,GIC)被定义为局部或全身使用糖皮质激素引起的晶状体后囊下混浊(posterior subcapsular opacities,PSO),简称为激素性白内障。GIC是全身或局部使用糖皮质激素引起的眼部主要并发症。Black于1960年首次报道了激素的应用与白内障的关系,随后相继有学者报道全身应用、局部应用及气道吸入糖皮质激素均可引起GIC。随着器官移植的普遍开展、过敏性疾病发生率的增高及外伤救治水平的提高、角膜屈光手术的广泛开展,对葡萄膜炎等自身免疫性疾病认识的不断深入,糖皮质激素的应用范围越来越广,GIC的发病率有逐渐上升的趋势。GIC已引起各科临床医生的广泛关注,深入研究GIC的发病机制及防治措施具有重要的临床意义。有关激素性白内障的发病机制,主要有细胞凋亡调节失控学说、糖皮质激素受体学说、蛋白质加合物形成学说、离子转运障碍学说、细胞分化异常学说、细胞黏附异常学说及氧化-构象损伤学说。凋亡是细胞为了维持内环境的稳定而在基因调控下的程序性死亡,是存在于细胞内部的一种正常生理现象。然而在有害因素作用下,组织细胞发生过度凋亡则可导致疾病的发生。研究发现,除先天性白内障以外其它类型白内障发生的共同细胞学基础为晶状体上皮细胞凋亡。因此,防治非先天性白内障的研究重点是如何调控晶状体上皮细胞的凋亡。生促红素人肝细胞受体酪氨酸激酶受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor tyrosinekinase-type A2,EphA2)是由 Lindberg 于 1990 年从人类角化上皮细胞cDNA文库中筛选得到,其广泛表达于皮肤、肺、胃肠道、卵巢等上皮源性正常细胞和肿瘤细胞,属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)家族中最大的一个亚族。其介导的信号传导,如活化丝裂素活化蛋白激酶途径,导致ERK活化,参与调控细胞凋亡、细胞增殖、细胞间黏附和细胞迁移等多种功能。EphA2基因高表达与肿瘤细胞抗凋亡密切相关,沉默EphA2基因可导致肿瘤细胞的凋亡。EphA2基因在晶状体上皮细胞中有广泛表达,对维持晶状体的正常发育及透明性起重要作用。近年来研究发现,EphA2基因异常表达与白内障的发生具有密切关系,但具体作用机制尚不完全清楚。有关EphA2在地塞米松作用的晶状体中的表达变化及其在激素性白内障发病机制中的作用,目前国内外尚未见相关报道。因此,本实验首先检测不同浓度地塞米松作用48h后,人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的变化及EphA2的表达变化,并构建人EphA2基因慢病毒表达载体,体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3,进一步研究EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖及凋亡的影响,探讨EphA2在激素性白内障发病中的作用机制。本研究共分为叁部分:第一部分:检测不同浓度地塞米松作用48h后,人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的变化情况及EphA2的表达变化。第二部分:构建人EphA2基因慢病毒表达载体,体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3,探索最佳MOI值,人为上调细胞中EphA2的表达。第叁部分:观察EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖及凋亡的影响。第一部分不同浓度地塞米松对人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响和EphA2的表达变化目的:观察不同浓度地塞米松作用后,人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖和凋亡的变化及细胞中EphA2的表达变化。方法:根据地塞米松浓度的不同,分为以下5组:Omol/L组(空白对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组和10-4mol/L组。地塞米松作用人晶状体上皮细胞(HLE-B3)48h后,CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率;Tunel检测凋亡指数,流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测EphA2蛋白的表达水平。结果:1.CCK-8 结果显示:Omol/L 组(空白对照组)、10-7mo1/L 组、10-6mol/L、10-5mol/L 组和 10-4mol/L 组细胞存活率分别为(98.24±1.74)%、(108.62±1.32)%、(73.13±3.41)%、(53.36±3.75)%和(44.85±3.18)%。5 组的总体比较差异有统计学意义(F=1497.598,P=0.001);5组中任意两组比较,差异亦有统计学意义(P值均为0.001)。与对照组比较,10-7mol/L组细胞存活率明显升高;10-6mol/L组、10-5mol/L 组及10-4mol/L 组 HLE-B3 存活率逐渐下降。10-5mol/L 组 HLE-B3 的存活率为(53.36±3.75)%,接近半数致死剂量。2.Tunel 检测结果:Omol/L 组(对照组)、10-7mol/L 组、10-6mol/L 组、10-5mol/L组和10-4mol/L 组 HLE-B3 凋亡指数分别为(4.9±1.2)%、(4.8±0.8)%、(17.1±3.0)%、(25.3±3.6)%和(28.4±4.1)%。5组的总体比较差异有统计学意义(F=1972.95,P=0.001)。10-7mol/L组的凋亡指数略低于Omol/L组(对照组),但差异无统计学意义(P= 0.756);余任意两组比较,差异均有统计学意义(P值均=0.001)。3.流式细胞术检测结果:0mol/L组(空白对照组)、10-7mol/L组、10-6mol/L、10-5mol/L 组和 10-4mol/L 组 HLE-B3 凋亡率分别为(5.9±1.0)%、(5.7±1.5)%、(25.4±4.3)%、(30.8±5.5)%和(33.7±4.7)%。5组的总体比较差异有统计学意义(F=438.99,P= 0.001)。10-7mol/L组的凋亡率略低于0mol/L组(对照组),但差异无统计学意义(P= 0.916),余任意两组比较,差异均有统计学意义(P值均=0.001)。与Tunel检测结果检测结果一致。4.Western blot 结果:0mol/L 组(空白对照组)、10-7mol/L 组、10-6mol/L、10-5mol/L组和10-4mol/L组HLE-B3中EphA2蛋白的相对表达量分别为(0.5641±0.0252)、(0.7534±0.0236)、(0.3921±0.0149)、(0.2893±0.0168)和(0.2004±0.0102)。5组总体比较差异有统计学意义(F=398.324,P=0.001)。10-7mo1/L组EphA2蛋白的表达较对照组明显上调,差异有统计学意义(P=0.001)。其余3组中EphA2蛋白的表达逐渐下降,呈剂量依赖性下调。结论:1.地塞米松浓度为10-7mol/L时,可促进晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,可抑制晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖。2.地塞米松浓度为10-7mol/L时,对晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的凋亡无影响;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,可促进晶状体上皮细胞HLE-B3的凋亡,且呈剂量依赖性。3.地塞米松浓度为10-7mol/L时,晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达上调;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时,晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达下调。第二部分 人EphA2基因慢病毒表达载体构建及体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的实验研究目的:构建人EphA2基因表达载体,包装慢病毒。探索人EphA2基因慢病毒表达载体体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值;CCK-8检测载体的细胞毒性;嘌呤霉素筛选转染阳性细胞;Western blot检测筛选细胞及筛选细胞传代后EphA2蛋白的表达水平。方法:1.慢病毒介导的人EphA2基因表达载体的构建以人cDNA-EphA2为模板,设计含NOT Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点的上下游引物,PCR扩增EphA2的CDS区。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP双酶切后和扩增的目的基因EphA2以CE重组酶进行连接。转化感受态细菌后挑选正确的克隆行PCR、酶切及测序鉴定。应用Lipofectamine 2000共同转染HEK 293T/17细胞,包装慢病毒。72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定滴度。2.分别以MOI值0、20、50、100、200转染人晶状体上皮细胞HLE-B3,转染72h后荧光显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测转染效率,探索最佳MOI 值。3.以最佳MOI转染人晶状体上皮细胞HLE-B3 72h后,CCK-8检测未转染组、空载体转染组和EphA2慢病毒表达载体转染组的细胞存活率。4.Western blot检测未转染组、空载体转染组和EphA2慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白的表达水平。5.配制浓度分别为 2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.Oμg/ml 和 10.0μg/ml 的嘌呤霉素筛选转染细胞。6.Western blot检测筛选阳性细胞传代后人晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达。结果:1.PCR、酶切和测序均证实EphA2慢病毒表达载体序列正确。HEK 293T/17细胞包装后获得了病毒储存液,病毒的滴度为2.3×1O7TU/ml至2.7×107TU/ml。2.MOI 为 0、20、50、100 和 200 时,转染效率分别为 0.0%、(38.6±3.9)%、(49.2±4.2)%、(79.5±5.5)%和(80.2±6.0)%,总体比较差异有统计学意义(F=2600.845,P=0.001);MOI=200 与 MOI=100 比较,转染效率无明显提高(P=2.507)。MOI为0、20、50、100时,细胞形态无改变;MOI为200时,部分细胞形态不规则。3.CCK-8检测,未转染组、空载体转染组和EphA2慢病毒表达载体转染组细胞存活率分别为(98.26±1.03)%、(97.74±1.19)%和(105.87±2.09)%,总体比较差异有统计学意义(F=26.945,P=0.001)。其中正常对照组与空载体转染组相比差异无统计学意义(P=0.686),余两两比较差异均有统计学意义(P值均为0.001)。4.Western blot结果显示,未转染组、空载体转染组和EphA2慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白相对表达量分别为(0.5612±0.0317)、(0.5597±0.0128)和(3.0320±0.0419)。总体比较,差异有统计学意义(F=2465.974,P=0.001);未转染组与空载体转染组比较,差异无统计学意义(P=0.868)。EphA2慢病毒表达载体转染组EphA2蛋白的表达量较未转染组提高了 4.4倍。5.筛选2天后,8μg/ml嘌呤霉素组未转染成功的细胞(红色荧光蛋白阴性)刚好全部死亡;6μg/ml组仍见少量红色荧光蛋白阴性细胞,4μg/ml组RFP阴性细胞存活率更高。6.正常对照组、嘌呤霉素筛选组和嘌呤霉素筛选细胞传代组EphA2蛋白的相对表达量分别为(0.5583±0.0285)、(3.1751±0.0224)、(3.1748±0.0253)。总体比较,差异有统计学意义(F=2801.057,P= 0.001);其中嘌呤霉素筛选组与嘌呤霉素筛选细胞传代组比较,差异无统计学意义(P=0.973)。结论:1.成功构建人EphA2慢病毒表达载体。2.人EphA2慢病毒表达载体转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值为100,转染效率为(79.5±5.5)%。3.外源性EphA2蛋白可在人晶状体上皮细胞HLE-B3中稳定高效表达。4.EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞HLE-B3的增殖有促进作用。第叁部分EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响目的:探讨EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:根据第一部分的实验结果,选择10-5mOl/L地塞米松作为实验浓度。实验分为以下四组:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组。CCK-8检测各组细胞的存活率。Tunel检测凋亡指数,流式细胞术检测凋亡率,Western blot检测各组细胞BCL-2、Bax和Caspase-3的表达水平。结果:1.CCK-8结果显示:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组HLE-B3的存活率分别为(98.18±1.85)%、(122.01±3.89)%、(52.32±1.99)%、和(76.18±3.74)%。组间比较,差异有统计学意义(F=497.557,P=0.001);EphA2过表达细胞组存活率高于正常细胞组,差异有统计学意义(P=0.001);EphA2过表达细胞联合地塞米松组存活率高于正常细胞联合地塞米松组,差异有统计学意义(P=0.001)。2.Tunel检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2.过表达细胞联合地塞米松组的凋亡指数分别为(5.4±1.5)%、(5.0±1.3)%、(23.0±3.9)%、和(14.4±2.7)%。组间比较,差异有统计学意义(F=397.638,P=0.001);EphA2过表达细胞组凋亡指数略低于正常细胞组,但差异无统计学意义(P=0.415);正常细胞联合地塞米松组凋亡指数较正常细胞组高,差异有统计学意义(P=0.026);EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡指数低于正常细胞联合地塞米松组,差异有统计学意义(P=0.018)。3.流式细胞术检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组的凋亡率分别为(6.4±1.3)%、(6.1±1.5)%、(28.8±3.4)%和(18.5±2.0)%。4组总体比较,差异有统计学意义(F =2194.309,P=0.001);正常细胞组与EphA2过表达细胞组比较,差异无统计学意义(P=0.421);EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡率高于EphA2过表达细胞组(P=0.001),但低于正常细胞联合地塞米松组(P=0.015)。4.Westen-blot检测:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组BCL-2蛋白的相对表达量为(0.4227±0.0075)、(2.7733±0.0796)、(0.1370±0.0036)和(1.6533±0.0176)。Bax 蛋白的相对表达量分别为(0.6917±0.0086)、(0.5810±0.0040)、(1.0390±0.0155)、(0.8260±0.0142)。4 组中 BCL-2 蛋白/Bax 蛋白的值分别为(0.6111±0.0050)、(4.7736±0.1448)、(0.1318±0.0017)、(2.0021±0.0480)。4 组总体比较,叁个指标的差异均有统计学意义(FBCL-2=2624.043,FBax=875.562,FBcL-2/Bax=2235.033;P值均为0.001);两两比较,差异均有统计学意义(P=0.001)。正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组Caspase-3 蛋白的相对表达量分别为(0.6783±0.0255)、(0.6538±0.0154)、(2.5713±0.0385)和(1.0930±0.0144)。4组总体比较,差异有统计学意义(FCaspase-3=3796.514,P=0.001);其中EphA2过表达细胞组与正常细胞组比较,无统计学差异(P=0.205),余两两比较,差异均有统计学意义(P=0.001)。结论:1.EphA2基因过表达对正常状态下的人晶状体上皮细胞HLE-B3具有促增殖作用;对地塞米松导致的HLE-B3增殖抑制具有保护作用。2.EphA2基因过表达对HLE-B3生理状态下的细胞凋亡无保护作用;对地塞米松导致的HLE-B3的凋亡具有保护作用。3.EphA2通过上调BCL-2和阻止Bax和Caspase-3过表达发挥对地塞米松导致的HLE-B3凋亡的保护作用。
佚名[5]2003年在《作者索引》文中提出第四军医大学学报(J Fourth Milit Med Unsv)2003年24卷索引AAdrian T.TINGB细胞成熟抗原BCMA在细胞内诱导NF-KB的活化(19):1729一1732CClaus H.Schroder慢性乙肝病毒感染的诊断和治疗
佚名[6]2004年在《白内障专题》文中指出S1-01白内障手术发展趋势何守志解放军总医院在几代眼科工作者的不懈努力下,白内障手术无论在手术技巧还是在设备和材料方面均取得了长足的进步。21世纪白内障手术的先进性、实用性和普及程度将得到进一步提高。一、白内障手术中的个性化手术技巧
刘珺[7]2017年在《电场诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的实验研究》文中提出目的晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification,PCO)是白内障术后最常见的并发症。该过程被认为是手术启动了晶状体的异常损伤修复反应,进而诱发晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)在后囊膜上增生、移行,并出现上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和晶状体纤维再生。晶状体上皮损伤影响了晶状体自身独有的电流环路,产生伤口电位和电场,增加赤道部LECs的增殖。所以有人认为白内障手术破坏了晶状体正常的电流形式和内在的电场,使LECs失去晶状体原有电流及电场的调节作用,导致LECs发生EMT,这可能是PCO发生的部分原因。本实验通过建立电场对人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞的体外作用模型,观察电场对HLE-B3细胞的生物学效应,如凋亡、增生、形态及细胞周期的影响,并检测电场对HLE-B3细胞内EMT标志物表达的影响及电场诱导HLE-B3细胞发生EMT的作用机制。方法1)体外培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞,并根据文献描述建立电场对HLE-B3细胞的作用模型;将细胞分别暴露于电场强度为50-150mV/mm的电场中,显微照相系统记录电场作用前、作用6h、12h及24h的细胞图像;流式细胞仪检测各时间点细胞凋亡情况并选择合适的电压。电压为100mV/mm时,观察电场对HLE-B3细胞增生的影响;流式细胞仪测定细胞周期。2)运用qRT-PCR技术检测电场对HLE-B3细胞中EMT标志物E-cadherin、Vimentin及integrinβ1基因表达的影响;运用免疫荧光及Western blot实验检测电场对HLE-B3细胞中EMT标志物E-cadherin,Vimentin及integrinβ1蛋白表达的影响。3)分别加入integrinβ1抑制剂MAB1965和FAK抑制剂PF-573,228,观察HLE-B3细胞形态的变化及EMT标志物基因、蛋白表达的变化,进一步探明电场诱导LECs发生EMT与integrinβ1-FAK信号通路之间的关系。结果1)成功建立了电场对HLE-B3细胞的作用模型。50mV/mm的电场暴露组中,细胞形态未见明显变化。100mV/mm、150mV/mm的电场暴露中,细胞间隙增加,细胞胞体伸长、呈纺锤样,且细胞长轴转向垂直于场线的方向。流式细胞仪检测结果进一步显示,150mV/mm电场强度可诱导细胞发生凋亡。100mV/mm的电场暴露组中,细胞的增殖受到明显的抑制,表现为细胞周期由G1期向S期过渡的抑制。2)分别应用免疫荧光、qRT-PCR法和Western blot检测EF对EMT标志物表达的影响。qRT-PCR法、免疫荧光和Western blot实验结果显示:电场诱导HLE-B3细胞上皮标志物E-cadherin的基因和蛋白表达下调,间质细胞标志物Vimentin基因和蛋白表达上调。3)电场诱导HLE-B3细胞integrinβ1表达的上调和FAK的活化。电场联合integrinβ1抑制剂MAB1965作用HLE-B3细胞后,细胞形态未发生明显的改变,Western blot检测结果显示E-cadherin和Vimentin的蛋白表达与对照组相比,无明显的统计学差异(P>0.05)。而电场联合FAK抑制剂PF-573,228作用后,细胞形态依旧出现在电场作用下伸长的趋势。Western blot检测结果显示E-cadherin蛋白表达下调、Vimentin蛋白表达上调,与对照组相比,有显着的统计学差异(P<0.05)。结论1)100mV/mm的电场引起HLE-B3细胞发生EMT的形态学改变,并诱发细胞凋亡,抑制HLE-B3细胞的增殖,抑制其细胞周期由G1期向S期的过渡。2)电场诱导HLE-B3细胞发生EMT,该过程伴有integrinβ1和FAK的表达上调。3)integrinβ1-FAK信号通路至少部分的参与电场诱导HLE-B3细胞发生EMT的过程。
姜笃银[8]2004年在《人体皮肤上皮细胞异常增殖和分化特征及其与创（烧）伤不同修复结局关系的研究》文中进行了进一步梳理人体皮肤上皮细胞异常增殖和分化特征及其与创(烧)伤不同修复结局关系的研究 【目的】皮肤创(烧)伤后创面自然愈合会产生不同的修复结局，包括正常瘢痕、增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)、瘢痕疙瘩(keloid，Ke)、慢性溃疡和假性上皮瘤样增生(pseudoepitheliomatous hyperplasia，PEH)病变等。这些病理性结局的产生固然与自身免疫状态、局部损伤深度、感染和炎症反应等综合因素有关，但作为深度损伤的修复主体-皮肤附件(SAs)与表皮(干)细胞对创面再上皮化和病变形成发挥至关重要的作用。因此，本研究将从胚胎表皮和附件形态发生、深Ⅱ度烧伤创面汗腺上皮细胞复层上皮化，以及HS、Ke和PEH形成过程中表皮和皮肤附件(SAs)变化等方面入手，探讨生理和病理条件下上皮细胞增殖和分化(转分化)对组织发生和不同修复结局的影响，为认识创伤修复规律和提高创面愈合质量提供理论依据。 【方法】收集不同时间点人胎儿、成人正常皮肤(NS)标本、皮肤深Ⅱ度(DBW)和浅Ⅱ度烧伤创面(SBW)标本以及不同愈合结局(HS、Ke和PEH)组织标本，在组织形态学观察的基础上，采用免疫组化和免疫荧光(双)标记、mRNA原位杂交、流式细胞分析和计算机辅助图象扫描分析技术等，调查人胚胎发育阶段表皮细胞及其SAs形态发生、临床DBW汗腺复层上皮化以及病理性愈合结局SAs破坏过程中，上皮细胞组织表型与分化表型之间的关系。具体包括：(1)不同角蛋白分子表达与上皮增殖和分化的关系，如增殖性蛋白标记-细胞角蛋白(CK)5&6、CK14和CK17，(胚胎)表皮干细胞标记-CK8&18和CK19，以及终末分化标记-CK10，腺上皮细胞功能性标记-分泌成分(SC)等；(2)上皮细胞表达金属蛋白酶(MMP-2，-3，-9)和金属蛋白酶抑制物(TIMP-1，-2)对Ⅳ型胶原(ColIV)、层粘连蛋白(laminin，LN)基底膜结构成分形成的影响：(3)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、上皮细胞钙粘附蛋白(E-cadherin，E-Cad)和β-链蛋白(β-catenin，β-Cat)表达水平，对上皮细胞异常分化和迁移的影响；(4)组织中干细胞因子(stem cell factor，SCF)及其受体博士后名丹究工作J晨告(c一Kit/CDx17)和白介素门L)一6等表达水平对分化杭原簇一14(cluste:ofdifterentiation，eol4)、en6s和肥大细胞类胰蛋白酶(l刀ast eell tryptase，MCT)阳性细胞分布、细胞生长和分化的诱导作用;(5)上皮细胞表达广谱CK〔cKp)、转化生长因子一田(TGF一pl)及其受体TGFpRI表达水平与波形蛋白(vim)和a一sMA表达之间的关系，探讨 TGF一印/TG FpRI信号系统对成体上皮一间质细胞转化‘巨州~二一epithelia卜mesenellylllal trans、，·:二ati。。，EMT)和胚胎间质一上皮细胞转化(mesenchyma一epstllelia一transfor，nation，MET)的诱导作用及其生物学意义;(6)细胞增殖性核抗原(PcNA)和凋亡相关蛋白分子(Bcl一2和Bax)表达水平与表皮、皮肤附件上皮细胞增殖和分化以及结构异常的关系;(7)成纤维细胞生长因子(FGF) 10(KGFZ)及其受体(FGFRZb/Bek)信号系统对胚胎表皮细胞增殖、分化和皮肤附件发生的诱导作用。 此外，在建立新生大鼠表皮角肮细胞分离、培养和纯化方法和技术的基础上，对培养第3一5代角阮细胞采用重组人TGF一p】(rh TGF一日!)和/或重组人表皮生长因子(rhEGF)进行离体刺激实验，并对Dispase和胰蛋白酶分离的早期人增生性疲痕表皮细胞，采用进行免疫组化、免疫荧光和流式细胞分析等方法动态观察EMT的组织表型和分子表型的改变。 具体分以下五个部分进行总结:1.胚胎期表皮细胞及其皮肤附件发生【结果】在人胚胎胎龄(EAG)6一sw期间，外胚层细胞Vi:n+一a一sMA一向cKS&!8十-CK19十表皮干细胞转变，并检测到中等强度(+十)TGF口R工信号，但TGF口!信号十分微弱;至EA GI ow以后呈现表皮细胞典型的组织形态学特征。在EAG 1 lw，表皮细胞开始表达CK一9和eKS&6，在表皮下过度表达FGF一。、PCNA和 Bel·2的间质细胞开始成团聚集;在EAG I3w时，分层的表皮细胞浅层出现CKIO，周皮细胞开始脱落;在基底层细胞CK14、PcNA、Bek和p一Cat信号明显增强的区域，细胞局灶性增殖形成毛囊原基(胚芽)，在其向真皮内侵入生长的同时，上皮细胞E一cad表达水平与周围间质细胞表达FGF10呈现相反的表达趋势:在EAG16w皮脂腺发生的同时，表皮一真皮依次重复上述信号并开始汗腺形态发生。 [结论l(1) EAG6一sw是人胚胎皮肤表皮细胞经由MET发生的重要时期，TGF 博士后对究互‘乍报告.‘亩亩‘菌‘‘亩亩.亩‘亩‘‘‘亩‘亩亩‘亩‘‘.‘亩亩‘‘亩‘‘亩‘亩~‘口RI信号通路可能参与了MET调变过程，但其配体一TGF日】起源及其作用机制有待研究。(2)间质细胞源性FGF10以旁分泌方式作用于上皮细胞Bek，并通过合理调配p一cat和E一cad信号，诱导表皮干细胞增殖分化和SAs形态发生·2.汗睐上皮细胳表皮细胞转化机制与DBW愈合的关系 l结果1 NS汗腺分泌部基底层的肌上皮细胞表达卜Cat、Bcl一2、CK19、P63和eK14:浅51度烧伤创面(superfieial 110 bLlrn wounds，sBW)愈合期间深层汗腺分泌部与NS组相似。在深11度烧伤创面(deep 110 bL!rn woL一
佚名[9]2010年在《基础免疫》文中指出脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
林婷婷[10]2010年在《眼眶腺样囊性癌临床治疗与局部化疗的实验研究》文中指出目的总结分析目前眼眶泪腺腺样囊性癌的临床治疗方法和预后,评估可能影响预后的因素。利用纳米技术及局部化疗减少全身化疗缺乏选择性、副作用大的问题。制备连接有叶酸(folic acid,FA)的长春新碱(vinscristine, VCR)靶向缓释纳米微球(nanopaticles, NPs),简称为FA-PLGA(VCR)-NPs,观察其理化特征；评估该药物对腺样囊性癌细胞株(ACC-2)及裸鼠眼眶移植瘤的抑制作用。进一步寻找眼眶腺样囊性癌治疗的新靶标,即肿瘤干细胞。观察肿瘤干细胞相关标志蛋白CD44、CD133和ABCG2在泪腺腺样囊性癌中的表达,研究它们与病理分型、预后的关系,为进一步开展针对肿瘤干细胞的靶向治疗奠定基础。方法1.采用回顾性系列病例研究,分析75例眼眶腺样囊性癌患者相关临床资料,包括患者的手术记录、病理分型及随访记录。2.采用改良的复乳法制备FA-PLGA(VCR)-NPs;MTT比色法观察空白微球PLGA-NPs的毒性,比较VCR原药、载药微球PLGA(VCR)-NP和FA-PLGA (VCR)-NPs在不同时间和不同浓度条件下对ACC-2细胞的影响；FITC标记微球,荧光显微镜观察PLGA-NPs与FA-PLGA-NPs对肿瘤细胞的作用；瘤细胞悬液接种法建立裸鼠眼眶腺样囊性癌移植瘤,分别予以瘤内注射生理盐水、VCR、PLGA-NPs、PLGA(VCR)-NPs和FA-PLGA(VCR)-NPs,局部给药一次,隔天测量肿瘤体积变化,计算体积抑制率,高效液相色谱法测定给药后不同时间肿瘤组织内残余VCR浓度,透射电镜及HE染色观察肿瘤组织标本。3.采用二步法免疫组织化学检测人眼眶腺样囊性癌肿瘤组织标本33例,复发切除标本5例及6例荷瘤裸鼠移植瘤标本的CD44、CD133和ABCG2的表达情况,分析其与病理分型及预后的关系。结果1.眼眶实体型腺样囊性癌2年复发率为85%(17／20)、5年复发率为100%(19／19),而腺样-管状型分别为23.53%(8／34)和64.52%(20／31),差异有统计学意义(2年,p=0.000；5年,p=0.003)。前者发生局部蔓延和远处转移例数亦多于后者。肿瘤切除术后联合放射治疗的5年复发率为70%(14／20),低于单纯手术切除的复发率92.86%(13／14)(p=0.198)。首次手术行眶内容物剜除术的5年复发率为25%(1／4),低于复发后再行眶内容物剜除术的病例的75%(6／8)(p=0.222),γ刀、粒子刀、化疗及生物治疗的效果不能确定。局部蔓延主要是至颅内、副鼻窦和颞窝,远处转移可到达肺、骨、肝、耳前淋巴结。5年远处转移率为25.71%(9／35),肺转移和骨转移各占33.33%(3／9)。5年生存率74.29%(26／35),死亡率25.71%(9／35),无瘤生存率37.14%(13／35),10年无瘤生存率17.14%(6／35)。最常见的死亡原因是颅内蔓延。肿瘤切除联合放射治疗可以使5年生存率提高到80%(16／20)。2.FA-PLGA(VCR)-NPs呈规则球形,平均粒径249.2nm,载药率4.53%,体外释放时间达14天；PLGA-NPs与ACC-2细胞共培养5天,细胞存活率达80%以上；给药后第4、5天FA-PLGA(VCR)-NPs对ACC-2细胞的抑制率显着高于VCR,呈时间和浓度依赖性；微球附着于肿瘤细胞表面,这种识别可以被FA竞争性抑制；FA-PLGA(VCR)-NPs组及PLGA(VCR)-NPs组对裸鼠肿瘤的体积抑制率显着高于VCR组(前者p=0.016,后者p=0.029),FA-PLGA(VCR)-NPs组高于PLGA(VCR)-NPs组,但无统计学差异(p=0.376)；给药后第1、7、14天肿瘤组织中残留药物浓度存在差异(p=0.000)；透射电镜观察14天肿瘤细胞内仍有高电子密度的纳米颗粒聚集,肿瘤细胞坏死明显,注射周围组织结构形态正常。3.CD44阳性表达率为54.5%(18／33)。实体型阳性率76.9%(10／13),多呈片状散在分布于肿瘤边缘浸润灶,而在肿瘤细胞密集处常常没有着染；筛网型阳性率为40%(8／20),大多分布在腺管样结构的外层细胞,即肌上皮细胞,二者差异不具有统计学意义(p=0.072)；在非炎症及恶性肿瘤性疾病切除的正常泪腺组织中CD44亦有阳性表达。CD133阳性表达率为57.6%(19／33),在实体型和筛网型中分别为76.92%(10／13)、45%(9／20),差异不具有统计学意义(p=0.087)；表达产物定位于细胞膜和细胞浆,呈淡黄色至棕褐色,部分病例同时表达于胞浆和胞核,其中实体型标本有46.15%(6／13),均属于发生转移或死亡的病例,筛网型有40%(8／20),其中4例发生复发或转移,4例四年内无复发；在非恶性肿瘤性疾病切除的正常泪腺组织中均无表达。ABCG2阳性表达率为21.2%(7／33),在实体型和筛网型中分别为30.77%(4／13)、15%(3／20),差异不具有统计学意义(p=0.393)；ABCG2阳性表达细胞具有沿血管分布的倾向。CD44、CD133及ABCG2在预后较好组(4年无复发)的阳性表达率均低于预后差组,无复发组低于发生转移或死亡组,但差异均不具有统计学意义(p<0.05)。Spearman相关分析提示CD44阳性表达和CD133的阳性表达之间存在正相关关系,(rs=0.416,p=0.016)。在6例荷瘤裸鼠肿瘤组织标本中,CD44阳性1例,CD133表达阳性1例,ABCG2表达阳性4例。结论1.腺样囊性癌是高度恶性的眼眶肿瘤,复发率和死亡率均较高,病理分型、治疗方法均影响预后。采取综合治疗方法,可以减少复发,提高生存率。2.叶酸靶向长春新碱纳米缓释微球具有稳定的载药率和体外释放行为,具有良好的靶向识别力,体外细胞学实验及荷瘤裸鼠体内实验均证实具有优于原药的抗肿瘤能力。3.在眼眶腺样囊性癌肿瘤组织中存在CD44、CD133及ABCG2阳性细胞,分别表达于腺样囊性癌肿瘤组织的不同部位,其表达随着病程进展而变化,可能会影响预后,但并不能作为评估预后的因素。
参考文献：
[1]. 抗人晶状体上皮细胞膜单克隆抗体的制备及其作用的实验研究[D]. 孙靖. 天津医科大学. 2003
[2]. 载药聚乳酸靶向纳米微粒的制备及眼疾与肿瘤治疗研究[D]. 刘晓燕. 天津大学. 2004
[3]. 靶向晶状体上皮细胞载药纳米微球的制备及体外评价[D]. 刘新玲. 天津医科大学. 2004
[4]. EphA2在地塞米松作用的人晶状体上皮细胞中的表达变化及其意义[D]. 马成霞. 郑州大学. 2018
[5]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2003
[6]. 白内障专题[C]. 佚名. 中华医学会第九届全国眼科学术大会论文汇编. 2004
[7]. 电场诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转分化的实验研究[D]. 刘珺. 第四军医大学. 2017
[8]. 人体皮肤上皮细胞异常增殖和分化特征及其与创（烧）伤不同修复结局关系的研究[D]. 姜笃银. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[9]. 基础免疫[C]. 佚名. 第七届全国免疫学学术大会论文集. 2010
[10]. 眼眶腺样囊性癌临床治疗与局部化疗的实验研究[D]. 林婷婷. 天津医科大学. 2010
标签：眼科与耳鼻咽喉科论文; 上皮细胞论文; 晶状体论文; 细胞增殖论文; 细胞膜论文; 单克隆抗体技术论文; 基因合成论文; 细胞转染论文; 地塞米松论文; 药品论文;