一、p16和nm23-H1在胃癌中的表达及其临床应用（论文文献综述）
谢梦雨[1]（2021）在《胃癌中lncRNA ASH1L-AS1的表达调控及其促癌分子机制研究》文中研究表明研究背景2020年全球癌症统计数据显示,在世界范围内,胃癌（gastric cancer）发病率位居恶性肿瘤的第五位,死亡率居第四位;在东亚人群中,胃癌发病率最高,占45.7%。早期胃癌患者的5年生存率可超过60%,但发生远处转移的晚期胃癌患者5年生存率仅约5%。胃癌早期症状隐匿,缺乏检测灵敏度高、特异性强的生物标志物,确诊时有超过60%的患者发生局部或远处转移。lncRNA（long non-coding RNA）是—类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,占细胞所有非编码RNA含量的80%-90%,在表观遗传调控中发挥重要作用。研究表明,lncRNA可作为恶性肿瘤早期诊断、预后评估及药物治疗反应的潜在生物标记物。lncRNA ASH1L-AS1位于东亚人群胃癌易感染色质1q22区域,其在胃癌中的生物学功能及分子作用机制尚不清楚。研究目的揭示胃癌细胞中lncRNAASH1L-AS1的生物学功能及分子作用机制,为胃癌的早期诊断以及临床治疗提供新靶标和新思路。研究方法1.通过qRT-PCR检测lncRNAASH1L-AS1在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平。2.构建慢病毒载体,获得稳定敲低或过表达1ncRNA ASH1L-AS1的胃癌细胞系,利用细胞增殖计数实验、平板克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验确定lncRNA ASH1L-AS1对胃癌细胞增殖能力的影响;利用划痕愈合实验和Transwell实验揭示lncRNAASH1L-AS1对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。3.通过qRT-PCR检测ASH1L mRNA在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平,并分析组织样本中ASH1L mRNA水平与lncRNA ASH1L-AS1水平的相关性。4.通过qRT-PCR检测胃癌细胞系中ASH1L mRNA水平是否受lncRNA ASH1L-AS1水平影响。5.通过平板克隆形成实验和Transwell实验探究ASH1L对胃癌细胞恶性表型的影响,在过表达lncRNA ASH1L-AS1的基础上敲低ASH1L是否可以逆转胃癌细胞恶性表型。6.通过RNA-pulldown实验联合蛋白质谱分析,鉴定胃癌细胞内与lncRNA ASH1L-AS1物理结合的蛋白,并通过Western blot实验及RIP实验进一步验证细胞中两者的相互作用。7.利用Western blot检测胃癌细胞中NME1 表达水平是否受lncRNA ASH1L-AS1影响,利用Western blot和细胞免疫荧光实验检测胃癌细胞中NME1核质分布是否受lncRNAASH1L-AS1影响。8.通过qRT-PCR检测NME1 mRNA在胃癌患者肿瘤组织与配对的正常胃组织中表达水平,并分析组织样本中lncRNAASH1L-AS1和ASH1L mRNA水平与NME1 mRNA水平相关性。9.在胃癌细胞中,通过qRT-PCR检测ASH1L-AS1和ASH1L表达是否受NME1影响。10.通过ChIP-seq和ChIP-qPCR实验探究ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域NME1结合情况,并通过ChIP-seq实验确定ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域H3K4me3修饰水平是否与NME1富集程度一致。研究结果1.lncRNAASH1L-AS1在胃癌组织中高表达。细胞表型实验结果显示,敲低lncRNA ASH1L-AS1显着抑制胃癌细胞增殖和迁移,过表达lncRNA ASH1L-AS1则显着增强胃癌细胞增殖和迁移。动物实验结果显示,过表达lncRNAASH1L-AS1显着促进胃癌细胞异种移植瘤的形成和恶性增殖。2.lncRNAASH1L-AS1上调邻近编码基因ASH1L表达,在胃癌细胞中敲低ASH1L可显着抑制细胞恶性表型,在过表达lncRNA ASH1L-AS1的基础上敲低ASH1L可逆转细胞恶性表型。3.RNA-pulldown、蛋白质谱以及 Western blot 实验,鉴定 NME1 为 lncRNA ASH1L-AS1的结合蛋白。RIP实验显示NME1能显着富集细胞中lncRNA ASH1L-ASI。在胃癌细胞中lncRNA ASH1L-AS1结合并增加NME1蛋白在细胞核中的水平。与配对的正常胃组织相比,NME1在胃癌组织高表达,并且在组织样本中lncRNAASH1L-AS1和ASH1L mRNA水平均与NME1 mRNA水平显着正相关。在胃癌细胞中敲低NME1,lncRNAASH1L-AS1和ASH1L下调;过表达 NME1-NLS,lncRNAASH1L-ASI 和 ASH1L 显着上调。ChIP实验表明NME1可结合在ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域,并且过表达lncRNAASH1L-AS1组细胞与对照组细胞相比,ASH1L-AS1和ASH1L基因启动子区域NME1富集以及H3K4me3修饰程度明显更高。结论本研究发现在胃癌组织中lncRNA ASH1L-AS1水平显着增高,lncRNA ASH1L-AS1与NME1结合上调ASH1L-AS1及邻近编码基因ASH1L转录,促进胃癌恶性进展,靶向lncRNAASH1L-AS1有望成为胃癌临床治疗新策略。
蔡曌[2]（2021）在《1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义》文中指出这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究膀胱癌的高复发率为患者带来了长期的身体和经济负担。目前对于膀胱癌的诊断已有多种基于不同技术平台的生物标志物,然而,对于患者复发风险的评估和预测还较少有相关标志物的报道。尽管在膀胱癌肿瘤的发生发展过程中存在大量基因组序列的改变,但目前对于膀胱癌肿瘤预后风险评估还尚未有获得广泛认可的生物标志物可供临床使用。本项研究旨在膀胱癌组织和尿液中探索与膀胱癌患者预后相关的分子标志物,评估其在患者预后评估中的临床应用价值。本实验室前期工作中对65例膀胱癌肿瘤组织DNA进行了基于芯片的比较基因组杂交实验,发现并通过real-time PCR验证了在膀胱癌组织中高频出现的5个高频拷贝数变异的基因CEP63、FOSL2、GHR、PAQR6、ZFAND3。本项研究对候选的5个拷贝数高频变异的基因在219例于中国医学科学院肿瘤医院初治的膀胱癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织样本和123例初治膀胱癌患者术前尿沉渣脱落细胞样本中的拷贝数变异与患者临床特征的相关性进行了进一步分析。为分析候选拷贝数变异与患者预后的相关性,研究中对所有入组患者均开展了术后随访,获得其无瘤生存期。研究应用Kaplan-Meier生存曲线、Cox风险比例回归、Logestic线性回归分析候选拷贝数变异与患者肿瘤复发风险的关系,并分别对非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌构建了预后预测模型。为提高在尿液中检测拷贝数变异的准确性,研究中采用了高灵敏的3D数字PCR技术,并运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC 曲线）比较了 real-time PCR 与 3D 数字PCR在尿沉渣脱落细胞中对拷贝数变异基因的检测效能,建立了尿样本中膀胱癌的诊断模型。在5个候选拷贝数变异的基因中,CEP63（p<0.01）、FOSL2（p<0.01）、PAQR6（p<0.01）在219例肿瘤组织中相比于健康人外周血白细胞中的基因拷贝数显着增加。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p<0.01）的拷贝数在肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织中显着高于非肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织。CEP63（p<0.01）和FOSL2（p=0.047）的拷贝数在高级别肿瘤中显着高于低级别肿瘤。在发生淋巴结转移患者的肿瘤组织中CEP63的拷贝数显着增加（p<0.01）。研究中对所有病例进行了随访,随访时间为3个月至188个月,中位随访时间为61个月。所有入组患者的5年无瘤生存率为48.3%;10年无瘤生存率为22.7%。基于219例肿瘤组织中CEP63、FOSL2、PAQR6的拷贝数变异,分别对非肌层浸润性膀胱癌患者和肌层浸润性膀胱癌患者进行生存分析,发现CEP63和FOSL2的拷贝数增加是非肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。FOSL2和PAQR6的拷贝数增加是肌层浸润性膀胱癌的独立预后因素（p<0.05）。基于CEP63、FOSL2的拷贝数变异构建非肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数（Prognostic Index,PI）,预测模型为PI=1.5095×CEP63+1.47123×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发风险是预后指数低的患者的3.434倍（p=0.0003）。基于FOSL2和PAQR6拷贝数变异,构建肌层浸润性膀胱癌的肿瘤复发预测模型计算预后指数,预测模型为PI=2.0440×FOSL2+2.2079×PAQR6,结果显示预后指数高的肌层浸润性膀胱癌患者发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的5.443倍（p=0.0001）。对于基于传统危险分层中的高风险非肌层浸润性膀胱癌患者,生存分析结果显示,预后指数高的患者无瘤生存期更短（p=0.00056）。在膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63（p=0.036）与FOSL2（p<0.01）的拷贝数相比于正常对照尿沉渣脱落细胞样本显着增加。应用3D数字PCR检测,发现肌层浸润性膀胱癌尿沉渣脱落细胞样本中CEP63（p<0.01）与FOSL2（p=0.046）的拷贝数显着高于非肌层浸润性膀胱癌样本,CEP63的拷贝数在发生淋巴结转移的膀胱癌患者中显着增加（p=0.042）。生存分析结果显示非肌层浸润性膀胱癌患者尿沉渣脱落细胞中CEP63的拷贝数增加（p<0.01）或FOSL2的拷贝数增加（p=0.018）预示着更大的肿瘤复发风险。基于尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数变异在训练集（n=41）中构建非肌层浸润性膀胱癌12个月内发生肿瘤复发的预测模型并在验证集（n=41）中进行验证,预测模型为PIL=-2.679+2.083×CEP63+1.827×FOSL2,结果显示,预后指数高的非肌层浸润性膀胱癌患者12个月内发生肿瘤复发的风险是预后指数低的患者的6.612倍（p=0.002）。ROC曲线分析结果显示3D数字PCR检测尿沉渣脱落细胞样本中CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.848和0.803,灵敏度分别为0.750和0.650,阴性预测值分别为0.786和0.708。而real-time PCR检测CEP63和FOSL2拷贝数变异的曲线下面积分别为0.601和0.685,灵敏度分别为0.475和0.425,阴性预测值分别为0.644和0.646。进一步基于3D数字PCR联合尿样本中CEP63与 FOSL2 的拷贝数变异构建膀胱癌患者诊断型:L=-1.817+2.267×CEP63+2.695×FOSL2,该模型的 ROC 曲线下面积为 0.858,灵敏度为85.0%,阴性预测值为83.8%。本项研究发现CEP63、FOSL2、PAQR6在膀胱癌中拷贝数增加,前两者与膀胱癌肿瘤的分期和病理分级显着相关。CEP63、FOSL2的拷贝数变异能够对非肌层浸润性膀胱癌患者的肿瘤复发风险进行评估和预测,FOSL2、PAQR6的拷贝数变异可应用于肌层浸润性膀胱癌患者肿瘤复发的预测。在膀胱癌患者尿样本中CEP63、FOSL2的拷贝数显着增加,并与肿瘤分期相关。尿样本中CEP63和FOSL2拷贝数增加的非肌层浸润性膀胱癌患者1年内发生肿瘤复发风险更高。研究中应用的3D数字PCR相比于real-time PCR检测效能更高,基于3D数字PCR的尿样本诊断模型能够较好的区分膀胱癌与正常人,为未来膀胱癌尿液检测提供了新途径。第二章EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属于疱疹病毒科γ亚科,是双链DNA病毒。EB病毒是人类普遍且长期感染的病毒。在世界人口中大约有95%存在终生的无症状感染。EB病毒参与了人类多种恶性肿瘤的形成,包括Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌等。EB病毒的发现距今已有50余年,但病毒的致癌机制目前仍然尚未清楚。miRNA是基因表达转录后调控的重要因子,在多种复杂的细胞生物学进程,例如细胞发育和分化中扮演着十分重要的作用。越来越多的研究发现某些特定miRNA的负调控作用能够引起多种器官的癌变发生。EB病毒是第一个发现的能够编码miRNA的病毒,已有研究发现部分EB病毒编码的miRNA能够调控宿主基因的表达。但对于其他EB病毒编码的miRNA在癌变过程中的作用机制目前还尚未完全了解。本项研究旨在通过miRNA表达谱芯片和转录组测序分析,构建EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱,分析病毒miRNA在宿主细胞中对宿主基因表达的调控作用,进而探索病毒miRNA对宿主细胞生物学功能的影响,以及在癌变发生和发展过程中所起到的作用。EB病毒相关胃癌在亚洲胃癌患者中约占6%,需要通过EBER原位杂交检测证实肿瘤组织中存在EB病毒的感染,由于EBER原位杂交尚未作为胃癌患者的常规病理检测项目,受到样本收集难度的限制,以及RNA较容易降解的特性,目前国内还尚未有基于EB病毒相关胃癌新鲜组织的转录组测序分析研究。在本项研究中,我们对8例EB病毒相关胃癌新鲜冻存组织、2株EB病毒相关胃癌细胞系SNU719、YCCEL1和2株EB病毒阴性胃癌细胞系AGS、HGC27进行了miRNA表达谱芯片和转录组测序分析宿主基因、宿主miRNA和EB病毒miRNA的表达情况。通过生物信息学分析,联合公共数据库中38例EB病毒相关胃癌的基因表达数据,探索EB病毒miRNA与宿主miRNA以及宿主基因的关系。为验证数据分析结果,进一步对筛选出的病毒miRNA进行体外细胞功能实验,探索其对胃癌细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的影响。为了解筛选出的在EB病毒相关胃癌中能够显着影响细胞生物学功能的病毒miRNA在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤即鼻咽癌中的作用。我们对33例鼻咽癌新鲜冻存组织进行了转录组测序。并通过体外细胞功能实验探索候选病毒miRNA在鼻咽癌细胞中对细胞增殖能力、细胞周期以及细胞迁移能力的调控作用。在本项研究中,我们通过对miRNA表达谱芯片和转录组测序数据分析获得了 EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱,筛选出在肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中均高表达的4个病毒miRNA。对其进行靶基因预测,我们发现在EB病毒相关胃癌中高表达的4个病毒miRNA靶基因主要富集于细胞迁移、细胞周期调控、细胞间信号转导和DNA复制等重要生物学功能上。而对于肿瘤组织和EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析水平的分析发现,4个宿主miRNA在肿瘤组织与细胞系中的表达水平与EB病毒miRNA的表达成正相关关系,相关系数大于等于0.9。进一步分析这4个宿主miRNA与EB病毒miRNA的序列,发现 EB 病毒 miRNA miR-BARTl-3p 与宿主 miRNA hsa-miR-29a-3p 具有相同的5’端种子区序列;而miR-BART7-3p则与宿主miRNA hsa-miR-154-3p具有相同的5’端种子区序列。由此推测上述病毒miRNA与宿主miRNA的调控功能具有一定的相似性。为进一步探索“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA是否协同作用共同参与调控细胞生物学功能。首先联合TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中转录组数据和 GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中表达谱芯片数据,以及本项研究中的转录组测序数据,分析共计46例EB病毒相关胃癌中肿瘤与癌旁组织的差异宿主基因,结合在EB病毒相关胃癌相比于EB病毒阴性胃癌细胞中差异的宿主基因,以此对“EB病毒miRNA-宿主miRNA”关系对中的病毒miRNA与宿主miRNA的交集靶基因进行筛选,结果显示,在EB病毒相关胃癌肿瘤组织中差异表达,并与EB病毒感染相关的宿主靶基因,其信号通路主要富集于涉及细胞生长、迁移、分化等重要功能的2个信号通路。说明候选的病毒miRNA可能与其相关的宿主miRNA共同参与到对细胞生长、迁移等重要功能的调控中。进一步的体外细胞功能实验也表明了miR-BART1-3p和miR-BART7-3p能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移,对细胞的生长起负向调控作用。此外,在另一种EB病毒相关上皮性恶性肿瘤,鼻咽癌中,我们也构建了 EB病毒miRNA的表达谱,与EB病毒相关胃癌不同的是,miR-BART1-3p在鼻咽癌中的表达水平较低而miR-BART7-3p在鼻咽癌中的表达水平也仅处于中等。但通过体外细胞功能实验,我们发现miR-BART7-3p在鼻咽癌细胞中,仍具有对细胞增殖和迁移功能的抑制作用。在上述研究中,我们构建了 EB病毒相关胃癌和鼻咽癌中病毒miRNA的表达谱。通过生物信息学分析获得了具有相同种子区序列的病毒和宿主miRNA,两者共同参与了涉及细胞增殖、迁移、分化等重要生物学功能的信号通路调控。体外细胞实验结果表明了病毒miRNA对于胃癌和鼻咽癌细胞在增殖、细胞周期和细胞迁移能力的抑制作用。本项研究对病毒miRNA miR-BART1-3p和miR-BART7-3p在胃癌细胞中的作用及其可能的机制进行探索,发现了miR-BART7-3p在两种EB病毒相关恶性肿瘤中具有相似的生物学功能,研究从新的视角提供了 EB病毒影响肿瘤进展的可能机制,有助于促进对于上皮性恶性肿瘤中EB病毒感染在癌变中作用的理解。
赵江桥[3]（2021）在《LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究旨在分析lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达情况及与患者预后的关系,探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌的影响及其参与的分子机制,为临床诊断、治疗及预后评估胃癌提供可靠的理论基础和新的方向。方法:1.通过RNA-seq测序分析,发现在胃癌中存在lncRNA LIFR-AS1表达的下调;通过样本表达分析,进一步证明lncRNA LIFR-AS1在数据库胃癌样本、胃癌组织和细胞系中的表达变化。2.研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的功能分析,主要通过过表达lncRNA LIFR-AS1分析lncRNA LIFR-AS1表达对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和肿瘤形成的影响。3.通过分子生物学、细胞生物学等手段探究lncRNA LIFR-AS1对胃癌作用的具体机制。结果:1.为了鉴定胃癌中的基因差异表达谱,我们对4组胃癌组织及其相应的癌旁组织进行了组织微阵列分析（tissue microarray analysis）,结果与癌旁组织相比,发现lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达;此外,我们还发现miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。为了进一步证明我们测序结果的可靠性,我们通过qPCR进一步检测了胃癌组织及对应的癌旁组织中这些基因在RNA水平的表达变化,结果发现与测序结果一致,lncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈低表达,miR-4698、Cdc25B、CD133、SOX2、NANOG、ER等基因在胃癌中呈高表达。这些结果表明胃组织从正常状态转变为具有侵袭性的恶性胃癌不仅存在编码蛋白基因的改变,也存在大量非编码RNA（lncRNA、miRNA）的改变,其中lncRNA LIFR-AS1的变化尤为明显。接下来,我们将以lncRNA LIFR-AS1为重点研究对象,探讨该lncRNA对胃癌发生和发展的意义及具体的分子机制。为了研究lncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学作用,我们从TCGA中获取正常和肿瘤组织的基因表达数据,通过分析,我们发现与正常组织相比,lncRNA LIFR-AS1在胃癌组织表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。利用RT-qPCR检测了lncRNA LIFR-AS1在41个GC组织和邻近组织中的表达情况,结果发现lncRNA LIFR-AS1在GC组织的确呈低表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。我们还进一步分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌临床特征的关系,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在分化更低、恶性程度更高、淋巴转移更明显的胃癌组织中下调更为明显,且差异具有统计学意义（P<0.05）。之后,我们利用TCGA数据库分析了lncRNA LIFR-AS1表达与胃癌患者总体生存时间的关系。结果发现,lncRNA LIFR-AS1高表达的患者总体生存时间显着高于lncRNA LIFR-AS1低表达的胃癌患者,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,我们还分析了lncRNA LIFR-AS1在人正常胃粘膜细胞GES-1和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中的表达情况,结果发现,lncRNA LIFR-AS1在MKN45和AGS细胞中的表达低于GES-1细胞,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明lncRNA LIFR-AS1的表达与胃癌的发生和发展呈负相关,lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌的进展。2.通过Lipofectamine（?）3000转染法将lncRNA LIFR-AS1转染到胃癌细胞MKN45和AGS中,通过qPCR检测lncRNA LIFR-AS1的表达情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1转染后在MKN45和AGS中的表达显着上调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们将用这两株过表达了lncRNA LIFR-AS1的胃癌细胞株进行增殖、凋亡、侵袭、转移以及肿瘤形成等细胞生物学功能的检测。我们利用CCK-8和Ed U试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS增殖的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的增殖,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的增殖。我们利用克隆形成试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS克隆形成的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞克隆的形成,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的克隆形成。我们利用流式细胞技术检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着促进胃癌细胞的凋亡,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够促进胃癌细胞的凋亡。我们利用Transwell试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS侵袭的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的侵袭,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的侵袭。我们利用细胞划痕试验检测lncRNA LIFR-AS1过表达对胃癌细胞MKN45和AGS迁移的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制胃癌细胞的迁移,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1过表达能够抑制胃癌细胞的迁移。我们利用裸鼠皮下成瘤模型检测lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45细胞肿瘤形成的影响,利用Tunel染色法检测肿瘤中细胞的凋亡情况,利用Ki67染色法检测肿瘤中细胞的增殖情况。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达能够显着抑制MKN45细胞肿瘤的形成,并且lncRNA LIFR-AS1过表达后肿瘤细胞Ki67信号明显减弱,Tunel信号显着增强,且差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞肿瘤的形成,抑制胃癌细胞的增殖,促进胃癌细胞的凋亡。3.我们预测miR-4698在lncRNA LIFR-AS1中的预结合位点。为了验证lncRNA LIFR-AS1和miR-4698预测的序列结合位点,我们进行了荧光素酶报告基因检测,进一步确认它们之间的关联。结果显示,转染LIFR-AS1-WT和miR-4698模拟物后,MKN45和AGS细胞的荧光素酶活性降低,且差异具有统计学意义（P<0.05）。值得注意的是,过表达lncRNA LIFR-AS1降低了miR-4698在MKN45和AGS细胞中的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,与正常组织和细胞相比,miR-4698在胃癌组织和胃癌细胞系中表达上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验显示,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698呈负相关。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1与miR-4698之间存在负相关,lncRNA LIFR-AS1可能通过下调miR-4698抑制胃癌的发生。Target Scan揭示MTUS1的3’-UTR包含miR-4698的互补区域。用miR-4698模拟物和MTUS1-WT或MTUS1-MUT片段共转染后,评估荧光素酶活性的变化。结果显示miR-4698模拟物和MTUS1-WT共转染的细胞荧光素酶活性受到抑制,且差异具有统计学意义（P<0.05）。miR-4698过表达和抑制载体（miR-4698模拟物和miR-4698抑制剂）转染胃癌细胞后,监测miR-4698和MTUS1之间的相关性。miR-4698模拟物转染细胞后miR-4698表达明显增强,miR-4698抑制剂转染细胞则抑制miR-4698的表达。Western-blot结果显示,miR-4698过表达可抑制MTUS1表达,miR-4698抑制则可增加MTUS1表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,通过qPCR检测,我们发现与正常组织和细胞相比,MTUS1在胃癌组织和胃癌细胞系（MKN45和AGS）中表达下调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关检验进一步证实了MTUS1与miR-4698之间存在负相关关系,MTUS1与lncRNA LIFR-AS1之间存在正相关关系。以上结果表明,MTUS1是miR-4698新的潜在靶基因,同时也受到lncRNA LIFR-AS1的正向调控。用pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1表达载体转染细胞,进而探索下游相关信号通路的改变。值得注意的是,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。接下来,我们利用si-MTUS1载体转染胃癌细胞抑制MTUS1表达,探讨lncRNA LIFR-AS1与MTUS1的关系。结果发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够显着上调胃癌细胞系MKN45和AGS细胞中MTUS1的表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。相比之下,抑制MTUS1的表达能够显着增加MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后,si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中MEK和ERK的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明,在胃癌细胞中过表达的lncRNA LIFR-AS1能够通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。本研究还发现,与对照组相比,过表达lncRNA LIFR-AS1能够抑制胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达。与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达可促进胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdk1的磷酸化水平,且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,pc DNA-LIFR-AS1和si-MTUS1共转染后si-MTUS1逆转了胃癌细胞系（MKN45和AGS）中Cdc25B的表达抑制和Cdk1的磷酸化诱导。以上结果表明,lncRNA LIFR-AS1可能通过抑制Cdc25B活性促进Cdk1的磷酸化。我们通过Western-blot和免疫组化分析了lncRNA LIFR-AS1表达对MKN45形成的肿瘤组织中MEK/ERK信号通路活性的影响。结果发现,与对照组相比,lncRNA LIFR-AS1过表达不仅能够促进MTUS1的表达,还能抑制MEK和ERK的磷酸化,这进一步表明lncRNA LIFR-AS1通过上调MTUS1抑制MEK/ERK信号通路的激活。结论:LncRNA LIFR-AS1在胃癌中呈异常低表达,且与患者的预后有关。在胃癌中,lncRNA LIFR-AS1通过下调miR-4698、上调MTUS1而抑制MEK/ERK信号通路的激活,促进细胞的凋亡,抑制细胞的增殖、侵袭和转移以及肿瘤的形成。因此,lncRNA LIFR-AS1可以作为胃癌治疗的潜在靶点。
吴凡[4]（2019）在《全外显子组测序筛选胃癌腹膜转移相关基因CDC27》文中研究说明研究背景和目的胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,胃癌术后复发转移是胃癌治疗失败的主要原因,其中腹膜转移是最常见的复发转移部位,一旦发生腹膜转移则预后极差,是胃癌死亡的主要原因。常规影像学诊断腹膜转移的假阴性率较高,常用的肿瘤标志物诊断腹膜转移的敏感性和阳性预测值均较差。诊断性腹腔镜检查联合腹腔游离癌细胞检查属于有创检查,既往有腹盆腔手术史或腹腔粘连的病人无法接受腹腔镜检查,制约了其临床应用。而且目前尚无明确的胃癌术后腹膜转移预测因子,共识认为“腹膜转移的风险因素包括TNM分期较晚（T3/T4和N阳性）,淋巴结外浸润,BorrmannⅢ、Ⅳ型及Lauren弥漫型病人”。但研究发现仅25%的T3/T4和N+病人发生腹膜转移。因此仅凭借目前已知的高危因素很难较准确预测胃癌根治术后是否发生腹膜转移。医学已进入分子分型时代,肿瘤即使组织学形态相同,其基因特征可能完全不同,导致治疗和预后的差别。胃癌也是一种高度异质性肿瘤,TCGA通过高通量测序将胃癌分为四个分子亚型。但该分子分型并非基于中国人群特征（TCGA胃癌数据库中东亚人群仅占约20%）,且该基因分型并没有关注腹膜转移这部分病人。因此,本课题拟通过目标序列捕获测序分析特定人群的胃癌样本（重点关注术后发生腹膜转移人群）,并结合生物信息学分析、临床生存资料,筛选出预测腹膜转移的关键基因,构建相应的慢病毒介导的沉默和过表达稳转细胞株,通过体外、体内实验探究腹膜转移关键基因对胃癌细胞表型的影响。希望通过该转化性研究,为胃癌提供新的生物标志物,并为个体化治疗提供新的思路。研究方法1.全外显子组测序技术回顾性分析73例初治胃癌病人组织FFPE样本,对其中63例Ⅰ-Ⅲ期病人根据其术后是否发生腹膜转移分为腹膜转移组（PM）和非腹膜转移组（non-PM）,结合临床病理、生存资料,寻找术后PM病人特征性基因突变,筛选两组间的差异基因,并构建胃癌根治术后腹膜转移的突变基因预测模型。2.结合第一部分Ⅰ-Ⅲ胃癌FFPE样本全外显子组测序和第二部分10例Ⅳ期病人外周血ctDNA 508基因测序结果,通过生物信息学分析并与临床资料比对,筛选出与胃癌术后腹膜转移最相关的基因CDC27,为后续研究奠定基础。3.IHC检测人胃癌组织中CDC27的表达并分析CDC27高表达与临床病理、生存资料之间的相关性;Western blot和RT-qPCR检测多个胃癌细胞株中CDC27的表达,根据各胃癌细胞株相对胃粘膜正常细胞GES-1的高低表达情况,分别构建慢病毒介导的shRNA-CDC27稳转细胞株和过表达CDC27稳转细胞株。4.CCK-8法、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、划痕实验及流式细胞仪PI单染法分别检测胃癌细胞CDC27沉默和过表达后增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力和细胞周期分布的变化;通过裸鼠皮下成瘤的实验观察CDC27沉默对MGC-803胃癌细胞株裸鼠皮下成瘤能力的影响。研究结果1.针对Ⅰ-Ⅲ期胃癌术后FFPE样本进行全外显子测序后发现,术后发生腹膜转移病人（PM）与未发生腹膜转移病人（non-PM）病人在手术样本中的突变基因重合率19.7%;PM病人Ti比例、Ti/Tv、突变基因数目和TMB（肿瘤突变负荷）均明显高于non-PM病人,TMB与突变基因数目存在明显正相关;高TMB病人术后发生腹膜转移的风险明显高于低TMB组。2.PM与non-PM病人之间存在49个差异基因,从中筛选出了8个高频差异基因,携带这8个高频差异基因的病人术后发生腹膜转移的风险明显高于未携带者;单因素和多因素回归模型均证实,携带高频差异基因是胃癌术后腹膜转移的独立危险因素;根据高频差异基因和病理危险因素（T3-4）建立的腹膜转移预测模型优于单纯病理预测模型。3.10例晚期胃癌病人外周血ctDNA508基因靶向捕获测序发现,晚期腹膜转移和非腹膜转移病人之间的基因变异重合率仅3.9%,热图显示晚期腹膜转移病人有其特征性的基因突变。4.对Ⅰ-Ⅲ期胃癌术后FFPE样本和晚期病人ctDNA样本测序结果利用生物信息学并结合临床生存资料分析显示,CDC27突变与术后出现腹膜转移相关,携带CDC27突变的病人术后发生腹膜转移的风险明显增加,且CDC27突变与DFS和OS缩短相关。进一步突变位点分析发现,CDC27突变位于Apc3区、TPR区和磷酸化区,且为TCGA数据库中未收录的新突变位点。5.IHC检测发现CDC27在胃癌组织中高表达,CDC27高表达与病人淋巴结转移、肿瘤浸润深度正相关。CDC27高表达病人DFS更短,且发生术后腹膜转移的风险增高。6.Western blot及RT-qPCR检测发现CDC27在MGC-803中相对表达最高,在AGS中相对表达最低,依此成功构建稳定沉默CDC27的MGC-803shCDC27和稳定过表达CDC27的AGSCDC27细胞株。体外功能实验发现,沉默CDC27抑制了胃癌细胞MGC-803的增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力,细胞周期分析显示G2/M期阻滞,S期减少。而过表达CDC27增强了胃癌细胞AGS的增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力,细胞周期分析显示G2/M期减少,S期增加。体内实验发现,沉默CDC27使胃癌细胞株MGC-803的裸鼠皮下成瘤能力减弱。结论1.利用全外显子测序技术回顾性分析Ⅰ-Ⅲ期胃癌FFPE样本基因突变情况,发现术后发生PM的病人在手术样本中就已携带特征性的基因突变:包括突变基因数目、TMB明显增高以及携带8个高频差异基因。2.携带8个高频差异基因的病人术后发生PM的风险明显高于未携带者,为胃癌术后PM的独立危险因素。根据高频差异基因和病理危险因素（T3-4）建立的腹膜转移预测模型明显优于单纯病理预测模型。3.生信分析及临床预后分析显示,CDC27突变与胃癌不良预后及术后PM密切相关,且发现的突变位点为TCGA数据库中未收录的新突变位点。4.CDC27在胃癌组织中高表达,高表达CDC27病人具有DFS缩短和术后PM风险增高的趋势。5.体外及体内实验证实,沉默CDC27抑制了胃癌细胞MGC-803的恶性表型,过表达CDC27增强了胃癌细胞AGS的恶性表型,并可能与G2/M期阻滞,S期减少有关。6.CDC27突变及高表达均为胃癌术后不良预后因素,且CDC27突变与胃癌腹膜转移密切相关,CDC27可能可以成为胃癌新的生物标志物和潜在的治疗靶点。
郝学军[5]（2018）在《胸腺肿瘤体部立体定向放射治疗及其预后相关研究》文中进行了进一步梳理目的:1.研究体部立体定向放疗（stereotactic body radiation therapy,SBRT）治疗胸腺肿瘤的疗效及毒副反应评估。2.探讨Nm23-H1、Raf-1、Ape1在胸腺肿瘤中的表达及其与预后的关系。方法:1.前瞻性分析32例胸腺肿瘤患者接受体部立体定向放疗的治疗的疾病无进展生存期,观察治疗有效率、局控率、复发模式以及毒副反应。2.选取胸腺肿瘤组织标本120例,应用免疫组化方法检测胸腺癌与胸腺瘤标本间Nm23-H1、Raf-1、Ape1表达的差异同时收集临床资料。应用SPSS统计软件分析Nm23-H1、Raf-1、Ape1在胸腺瘤与胸腺癌之间表达的表达差异,再分析Nm23-H1、Raf-1、Ape1与患者预后的关系。结果:1.32名试验者的中位肿瘤无进展时间为21个月。有11（34.4%,11/32）名患者完全缓解,20名患者部分缓解,1名患者疾病稳定,有效率为96.9%。超过一半的患者出现了复发占比达到56.3%（18/32）。副反应以1级和2级为主,其中放射性食道炎是主要的毒副反应,未观察到3级或4级及以上的毒副反应。2.免疫组化结果显示Nm23-H1在胸腺癌中的表达高于胸腺瘤中的表达（p<0.001）。Raf-1在胸腺癌中的表达亦显着高于胸腺瘤。而Ape1在胸腺癌和胸腺瘤中的表达未见显着差异。单因素分析结果,Nm23-H1表达越高,患者生存时间越短。多因素COX回归发现Nm23-H1为独立预后因子（HR:1.506,95%CI:1.114-2.036,p=0.008）,未发现其它与预后相关因素。结论:1胸腺肿瘤无手术指针或拒绝手术患者采用立体定向放疗是有效可行的。2单因素分析发现Nm23-H1与Raf-1与患者预后呈负相关关系,而多因素分析发现只有Nm23-H1为独立的预后因子,Nm23-H1表达越高,患者的预后越差,生存越短。
汤德锋[6]（2017）在《前脑啡肽PENK在胃肠间质瘤中的作用及机制研究》文中研究说明【目的】通过对常用生物数据库分析以及临床肿瘤组织验证并结合细胞功能学试验,探讨前脑啡肽（proenkephalin,PENK）在胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）中的作用与肿瘤恶性行为的关系,明确PENK基因在GIST中高表达与GIST临床危险度分级的关系,初步阐明PENK在胃肠间质瘤中的作用机制及其在GIST伊马替尼耐药细胞株中的功能。【方法】1)通过GEO数据库、Oncomine在线数据库（https://www.oncomine.org）、c Bio Portal（http://www.cbioportal.org）等分析了GIST肿瘤组织标本和配对正常组织标本中基因表达差异。以Fc（Fold chang）值≥2（即表达量增加一倍及以上）同时基因改变以拷贝数扩增（copy number amplification,CNA）为主,CNA≥5%为标准筛选出一组各数据库中均出现的差异基因,结合仁济医院胃肠外科不同危险度分级的GIST新鲜组织标本（高危10例及低、中危各5例）以及14例正常胃组织（其中10例配对高危GIST,2例配对低危GIST,2例配对中危GIST）q RT-PCR结果,我们从中挑选出与正常组织相比肿瘤组织中表达差异较大的基因PENK。同时,比较分析上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科前期所作的GIST不同危险度GIST组织的表达谱芯片筛查结果,发现PENK基因在中低危GIST中高表达,而在高危GIST中低表达,故拟选择此基因作为研究对象。2)应用上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科GIST患者肿瘤组织构建的GIST组织芯片（2002.01.01～2011.12.31）,通过免疫组织化学方法检测了PENK在不同危险度分级的GIST表达情况,结合相应患者的临床病理资料及术后随访结果,分析PENK蛋白表达与患者临床病理特征和预后的相关性。3)GIST-882、GIST-T1细胞功能实验验证:首先在GIST-882细胞系、GIST-T1细胞系中验证PENK的表达情况,然后通过构建PENK稳转干扰及过表达片段,在GISTT1细胞系中进行了功能验证:通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验验证GISTT1细胞的增殖能力;通过划痕实验、Transwell（空穿及胶穿）实验验证GIST-T1迁移、侵袭能力;通过细胞周期及凋亡实验验证其对细胞周期或细胞凋亡的影响;通过构建稳转干扰细胞株并裸小鼠皮下成瘤实验验证PENK在裸小鼠体内对GIST-T1细胞株成瘤能力的影响。4)通过对PENK蛋白纯化和上游调控转录因子预测、下游信号通路激活等方面研究和分析了PENK在GIST进程中的作用机理。5)构建GIST-T1伊马替尼耐药细胞株初步验证了PENK对耐药细胞株的功能。【结果】1)通过对GEO、TCGA、Oncomine中GIST配对资料的数据库中筛选出差异表达的相关基因,以Fc值≥2为界限同时该基因变化以拷贝数扩增为主（CNA≥5%）筛选出在两个数据库中均出现的高表达基因14个（TOX、CHEK1、FOXG1、CEP170、BDNF、KIF1A、PEG10、SATB2、TCF19、MCPH1、SIX1、RFTN2、GNG2、PENK）。2)对14个差异表达基因进行q RT-PCR验证,结果显示PENK正常组织中呈现低表达但在GIST组织中呈现高表达,两组间表达量差异有显着统计学意义,P=0.0188。进一步GIST组间分析,PENK在低、中危组GIST中呈高表达,低、中危组间PENK表达无显着统计学意义,P=0.837;在高危组中呈显着低表达,与正常组织和低中危组相比较均呈现显着地统计学差别,P值分别为0.015和0.00014。3)268例GIST组织芯片的免疫组化染色结果显示PENK在GIST高危组织的阳性表达率为59%,明显低于中低危GIST组织的77.2%,两组间具有显着的统计学差别,P=0.0001。进一步将PENK表达水平与NIH危险度分级相关指标关联,我们发现PENK蛋白表达水平与肿瘤大小（P=0.001）、核分裂相（P=0.0002）、肿瘤破裂出血（P=0.026）、危险度分级（P=0.001）均呈显着负相关。随着GIST肿瘤体积增大（肿瘤破裂出血风险亦随之增高）、肿瘤核分裂相增加及NIH危险度分级增高,GIST肿瘤组织的PENK蛋白染色的阳性率减少,而阴性率显着增加,提示PENK在GIST进展中可能发挥抑癌基因的功能。4)对GIST患者生存情况和疾病复发情况进行分析,发现PENK高表达组GIST患者存活率显着高于低表达组,差异具有显着的统计学意义,P=0.036;在GIST患者疾病复发率上,PENK高表达组显着低于低表达组,差异具有显着的统计学意义,P=0.001。结合患者的术后随访资料绘制生存曲线并进行Logistic回归分析,同样的结论出现在268例按PENK表达水平不同划分的GIST患者中,PENK高表达可显着改善GIST患者的总生存（Overall Survival,OS）和无复发生存（Recurrence Free Survival,RFS）,差异有显着统计学意义,P值分别为0.034和0.033,即PENK高表达者预后较好,低表达者预后差。同时按NIH危险度分级（极低危/低危,中危,高危）的268例GIST患者中,在OS方面低危和中危组患者预后明显优于高危组,具有显着的统计学差异,P=0.001;在RFS方面出现同样的结论。提示PENK阳性表达患者与NIH低、中危患者的OS和RFS显着高于高危患者,反之则预后较差。为明确268例GIST患者中一些病例服用伊马替尼对其OS和RFS的影响,我们分别对此进行了Logistic回归分析,发现服用伊马替尼（imatinib mesylate,IM）和未服用IM并未对268例患者的OS和RFS产生影响,P值均大于0.05。5)进一步细胞功能实验验证中,PENK过表达GIST-T1细胞和稳转干扰GIST-T1的细胞功能实验中两者呈现截然相反的结论:在细胞增殖实验中,PENK过表达GIST-T1细胞系的增殖能力显着低于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在体现细胞迁移、侵袭能力的划痕实验以及Transwell实验中（空穿及胶穿）,PENK过表达GIST-T1细胞系的迁移、侵袭能力显着低于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在细胞周期检测中,PENK过表达或稳转干扰GIST-T1细胞系对细胞周期的影响相对较小,差异无明显统计学意义;在细胞凋亡实验中,PENK过表达细胞系GIST-T1诱导凋亡的能力显着高于PENK稳转干扰GIST-T1细胞系;在体外动物实验中,PENK稳转干扰细胞系GIST-T1的诱导成瘤能力显着高于对照组GIST-T1细胞系。因此,在体内和体外两个层面我们验证了PENK作为抑癌基因的抑制GIST增殖的功能。6)在PENK如何触发其抑癌机制研究中,我们发现PENK基因启动受AP-1基因调控,PENK蛋白对细胞周期无显着作用,但PENK蛋白酶切产物阿片类生长因子（opiod growth factor,OGF）可以通过激活抑癌基因P16从而竞争性抑制Cdk4和Cyclin D的结合使得细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制GIST的增殖,同时PENK激活凋亡相关通路从而增加GIST凋亡使得GIST生长抑制。初步GIST-T1伊马替尼耐药细胞株功能实验中我们证实PENK蛋白对耐药细胞株的生长无显着作用,但其酶切产物OGF可显着抑制耐药细胞株的生长,为进一步耐药机制探讨打下基础。【结论】1)PENK在低、中危GIST肿瘤组织中呈高表达,在高危GIST肿瘤组织中呈低表达,PENK表达程度与GIST患者的复发率呈负相关而和患者的生存率呈正相关。2)PENK在体内和体外实验中均显示其抑制GIST的增殖功能。3)PENK通过PENK蛋白酶切产物OGF激活抑癌基因P16从而竞争性抑制Cdk4与Cyclin D的结合使得细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制GIST-T1细胞的增殖,同时PENK激活凋亡相关通路从而增加GIST-T1细胞的凋亡使得GIST-T1的生长抑制。4)GIST-T1伊马替尼耐药细胞株功能实验中我们证实PENK蛋白在体外对耐药细胞株的生长无明显促进作用,但PENK蛋白酶切产物OGF能够显着抑制GIST-T1耐药细胞株的生长。
高燕[7]（2016）在《胃癌组织中DAPK基因高甲基化与DNMT1表达的关系》文中研究指明目的:探讨人胃癌组织DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1,Dnmt1）表达及其与死亡相关蛋白激酶(（Death Associated Protein Kinase,DAPK）基因甲基化状态的关系。方法:收集80例胃癌组织及其相应的癌旁正常组织,胃癌组织均经手术切除且病理学证实,采用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）方法检测胃癌组织及其相应癌旁组织DAPK基因甲基化状态,应用实时荧光定量逆转录-多聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）法检测DAPK基因m RNA的表达,采用免疫组化SP法检测DAPK及Dnmt1蛋白的表达水平。结果:80例胃癌组织48例发生了DAPK基因甲基化,甲基化阳性率为60%,其相应的癌旁正常组织有10例发生了DAPK基因甲基化,甲基化阳性率为12.5%,胃癌组织中DAPK基因甲基化阳性率显着高于其相应癌旁组织,差异有统计学意义（χ2=39.053,p<0.01）。胃癌组织中DAPK基因甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤大小无关（p>0.05）,而与肿瘤分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况有关（p<0.05）。胃癌组织中,Dnmt1 m RNA阳性表达率为（68/80,85%）,显着高于其相应癌旁正常组织（5/80,6.25%）,而DAPK基因m RNA阳性表达率（20/80,25%）显着低于其相应癌旁正常组织（75/80,93.75%）。胃癌组织中DAPK蛋白的阳性表达率为12.5%（10/80）,其相应癌旁组织DAPK蛋白的阳性表达率为97.5%（78/80）,显着高于胃癌组织。胃癌组织中Dnmt1蛋白阳性表达率为87.5%（70/80）,显着高于其相应癌旁正常组织（8/80,10%）。48例发生了DAPK基因甲基化的胃癌患者,均表现出DAPK基因表达的缺失。胃癌组织中DAPK蛋白表达与Dnmt1蛋白表达呈负相关（r=-0.391,p<0.01）。结论:Dnmt1基因高表达可能导致DAPK基因高甲基化,DAPK m RNA及蛋白表达减少,从而参与了胃癌的发生发展。
胡华[8]（2013）在《Survivin抗体和胃泌素在胃癌患者血清中联合检测及意义》文中研究指明目的研究胃癌患者血清中survivin抗体和胃泌素（gastrin GAS）的水平变化及其与临床病理因素的关系，以及两者的相关性，为胃癌的筛查、病情评估、疗效评价及预后判断提供帮助。方法实验设两组：正常对照组40例，为门诊健康体检者；胃癌组70例（早期胃癌、进展期胃癌）为河南科技大学第一附属医院病理确诊的胃癌患者，且排除合并其他疾病。所有观察对象均于治疗前清晨空腹抽取肘静脉血5ml，用酶联免疫吸附法检测血清survivin抗体和GAS的含量，然后将结果进行统计学分析。结果1．Survivin抗体在胃癌组血清中的浓度值107.83±26.20ng/L，明显高于正常对照组血清中的浓度值68.69±18.88ng/L（t=6.22，P<0.05）；GAS在胃癌组血清中的浓度值102.66±27.03pg/mL，明显高于正常对照组血清中的浓度值63.91±18.80pg/mL（t=5.996，P<0.05）。2．Survivin抗体在中晚期胃癌组血清中的浓度值110.61±25.94ng/L，明显高于早期胃癌组血清中的浓度值86.26±17.45ng/L（t=2.573，P<0.05）；GAS在中晚期胃癌组血清中的浓度值105.16±26.75pg/mL，明显高于早期胃癌组血清中的浓度值83.26±22.02pg/mL（t=2.217，P<0.05）。3．Survivin抗体在低分化胃癌组血清中的浓度值115.18±28.16ng/L，明显高于高分化和中分化胃癌组血清中的浓度值97.44±19.18ng/L（t=2.941，P<0.05）；GAS在低分化胃癌组血清中的浓度值110.62±28.56pg/mL，明显高于高分化和中分化胃癌组血清中的浓度值91.41±20.30pg/mL（t=3.106，P<0.05）。4． Survivin抗体在病理分期Ⅲ-Ⅳ期胃癌组血清中的浓度值117.61±29.04ng/L，明显高于Ⅰ-Ⅱ期胃癌组血清中的浓度值97.48±18.06ng/L（t=3.457,P<0.05）；GAS在病理分期Ⅲ-Ⅳ期胃癌组血清中的浓度值113.14±29.39pg/mL，明显高于Ⅰ-Ⅱ期胃癌组血清中的浓度值91.56±19.11pg/mL（t=3.619,P<0.05）。5． Survivin抗体在肿瘤最大径≥5cm胃癌组患者血清中的浓度值109.74±26.97ng/L，略高于肿瘤最大径＜5cm胃癌组患者血清中的浓度值104.79±25.12ng/L（t=0.767，P>0.05）；GAS在肿瘤最大径≥5cm胃癌组患者血清中的浓度值104.52±27.43pg/mL，略高于肿瘤最大径＜5cm胃癌组患者血清中的浓度值99.70±26.63pg/mL（t=0.724，P>0.05）。6．Survivin抗体和GAS血清浓度，在以性别、年龄分组比较中，差异不显着，（P>0.05）。7．Survivin抗体在有淋巴结转移胃癌组血清中的浓度值110.30±26.42ng/L，明显高于无淋巴结转移胃癌组血清中的浓度值91.08±18.01ng/L（t=2.104，P<0.05）；GAS在有淋巴结转移胃癌组血清中的浓度值106.21±26.31pg/mL，明显高于无淋巴结转移胃癌组血清中的浓度值78.58±19.04pg/mL（t=0.260P<0.05）。8． Survivin抗体在贲门胃底癌组、胃体癌组、胃窦癌组血清浓度分别106.55±29.05ng/L、109.26±22.09ng/L、109.61±23.57ng/L，它们之间比较差异无显着性（p<0.05）；GAS在贲门胃底癌组、胃体癌组、胃窦癌组血清浓度分别119.85±23.26pg/mL、82.32±9.28pg/mL、79.84±13.18pg/mL，贲门胃底癌组血清GAS浓度明显高于胃体癌、胃窦癌组，差异有显着性（p<0.05）。9．Survivin抗体和GAS在胃癌患者血清中的含量呈正相关（r=0.652），P＜0.05。结论血清Survivin抗体和GAS含量在胃癌时明显增高，两者之间呈正相关，且与胃癌的发生、发展和组织分化程度关系密切；联合检测有助于对胃癌筛查、病情监测、疗效评价和预后判断。
陈艳[9]（2012）在《新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析》文中认为目的:尽管新疆哈萨克族居住环境及生活方式发生了变迁,但是哈萨克族食管癌的发病率和死亡率仍维持在较高水平。这是由于食管癌难以早期发现且预后较差,其5年生存率低于10%。目前,内镜下活检是食管癌早期发现及确诊的主要手段。活检组织主要是依靠病理作为定性诊断,但由于病理学诊断方法本身的局限性,对于一些癌前病变缺乏准确诊断。因此,识别各种病变的转化规律是关键。现有研究表明,癌基因和抑癌基因的表达异常,可能是导致细胞异常增生并进一步发生癌变的关键因素。所以,通过分析食管癌前病变基因的变化,筛选出特异的早期高相关基因,用于进行早期基因诊断,才是提高内镜诊断特异性和弥补病理形态学诊断不足的有效方法。而众多研究表明,食管癌癌旁组织的改变代表了早期食管癌的变化。因此,本研究以新疆哈萨克族食管鳞癌作为对象,采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学和相互作用的拓扑学方法,通过分析癌旁组织和远端无癌组织中癌基因和抑癌基因的表达改变,试图发现并确立食管鳞癌发生发展的早期高相关基因,并将哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因与国际上其他民族、地区食管癌早期相关基因进行拓扑学分析,比较二者的差异。这将为实施新疆哈萨克族食管鳞癌早期基因诊断提供实验依据和理论基础,建立的早期高相关基因将极大的提高内镜下活检诊断的特异度。同时也为食管鳞癌多基因发病机理研究奠定基础。方法:（1）应用半定量RT-PCR,分别在48例哈萨克族食管鳞癌组织和远端无癌组织,对42个候选基因进行mRNA水平的检测,依据mRNA表达比率的变化,筛选出高相关基因。高相关基因进一步在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR进行mRNA检测,依据结果,初步筛选出早期高相关基因,并应用Western blot检测部分早期高相关基因在10例鳞癌癌旁组织和远端无癌组织的蛋白表达。（2）扩大样本,在新的一组16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR对筛选出的早期高相关基因进行检测。同时,以正常食管粘膜组织作为对照,将40例食管鳞癌癌旁组织样本,600张切片分成26组,每组18例,利用免疫组织化学方法对早期高相关基因蛋白进行检测。（3）对鉴定出的新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因,利用STRING9.0在线数据库和Pajek软件进行拓扑学分析,并与目前报道的其他地区和民族的早期食管鳞癌异常表达的蛋白质的相互作用,进行对比分析。结果:（1）通过比对42个候选基因在48例食管鳞癌组织和远端无癌组织中mRNA表达比率的差异,筛选出36个新疆哈萨克族食管癌高相关基因。（2）应用半定量RT-PCR、Western blot对36个高相关基因在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中进行了分析,初步筛选了 26个新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因。（3）16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中半定量RT-PCR,以及18例食管鳞癌癌旁组织病理切片免疫组织化学的结果进一步验证了 26个早期高相关基因的表达改变。（4）对26个基因在早期个体标本中的表达分布进行分析,大约40%的个体都呈现的有 survivin、ETV5、MMP-7、TIMP-1、MMP-2、c-myc、c-fos、MTA1、CDK4、cyclinD1、MCM4、SKP2的基因表达组合。（5）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因26个蛋白和目前报道的在食管鳞癌早期异常表达20个蛋白质,两组数据构建的拓扑图截然不同,各组骨架结点图也不同。结论:（1）c-fos、Ki67、MCM4、ETV5、SKP2、TIMP-1、MMP-2、CDK4、MEMD、MTA1、MMP-7、c-myc、c-jun、Survivin、CyclinD1、BAG1、SP-17、c-erbB2、EphB4、CK-1、MGMT、periplakin、Snail、p33、Bax、E-cadherin 共 26 个基因为新疆哈萨克族食管鳞癌的早期高相关基因。（2）联合的多基因检测,可以有效提高特异性,不同基因的26种表达组合可作为早期诊断的实验依据。（3）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因相互作用拓扑图具有民族特异性,其网络中心结点蛋白,对于食管鳞癌分子机制的研究具有一定的提示作用。
杨月琴[10]（2012）在《金雀异黄酮诱导胃癌细胞周期阻滞和PCDH17基因表达及其启动子区域去甲基化的研究宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响》文中提出研究背景：胃癌是世界第二大常见肿瘤,其发病机理尚不清楚。由于化疗治疗具有较多的副作用,胃癌的治疗寻求更有效的药物具有重要的临床意义。肿瘤的发生、发展由多基因遗传和表遗传相互参与,共同作用的结果。一些肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛的甲基化而使该基因沉默是肿瘤发生的表观遗传调控的一个主要机制。PCDH17基因是钙粘蛋白超家族的一员,但是其功能尚不清楚。许多PCDH家族的基因,包括PcDH8,PCDH10和PCDH20在各种肿瘤如乳腺癌,鼻咽癌,宫颈癌和肺癌中,均有报道基因沉默的发生,提示了这些基因可能行使肿瘤抑制基因的功能。目前对PCDH17基因的功能罕见报道,由于其与PCDH8,PCDH10等基因同属于Pcdh62的亚群,我们推断该基因为胃癌的一个潜在的肿瘤抑制基因。由于PCDH17基因的启动子区域罕有TATA盒,并且分散存在许多的CpG岛,提示该基因是一个DNA甲基化致基因沉默的易感基因。表观遗传的改变能够被药物所逆转,如5-Aza-Cdr能够在甲基化位点形成共价复合物从而去甲基化。然而,该药物由于不稳定且毒性较高,使得其临床应用受到一定的限制。最近,一种大豆提取成分——金雀异黄酮引起了医疗学界的广泛关注。有报道金雀异黄酮能够上调多种肿瘤抑制基因的的表达,而该药物是否能通过PCDH17基因启动子区域的去甲基化机制调控胃癌细胞PCDH17基因表达尚不清楚。研究目的：研究金雀异黄酮的对胃癌细胞的毒性与抗肿瘤的功效,揭示PCDH17基因mRNA的表达水平与胃癌的相关性,并探究金雀异黄酮对胃癌细胞PCDH17基因表达的影响；研究PCDH17基因启动子区域甲基化状态与基因表达的相关性,以及金雀异黄酮对胃癌细胞PCDH17基因启动子区域的甲基化状态的影响。本实验对于探讨胃癌进展过程中PCDH17基因行使的功能,阐明该基因在胃癌发生发展中的表观遗传调控机理,具有重要意义；同时也为寻求新的胃癌治疗药物提供实验依据。研究方法：1、金雀异黄酮对胃癌细胞株及胃正常细胞株生长抑制和细胞周期的影响将胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1使用1640培养液,10%的胎牛血清,5%C02,于37℃培养箱中培养。分别使用0、10、25和50uM的金雀异黄酮与0、2.5、5和10uM的5-AZA-Cdr处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1,使用Cell Counting Kit-8试剂盒检测金雀异黄酮对两种细胞的增殖能力的影响,并与5-Aza-Cdr的作用相比较。采用流式细胞术,研究金雀异黄酮对肿瘤细胞和正常细胞细胞周期和凋亡的影响。2、胃癌PCDH17基因表达水平的检测和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因mRNA表达的研究选取新鲜的的临床胃癌及自身对应的正常胃组织,要求患者术前未经任何放、化疗。使用Trizol抽提RNA,使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA.使用Primer Express sosware软件设计PCDH17基因RT-PCR引物。GAPDH作为内参照。使用7900快速实时定量PCR系统进行Real-time RT PCR检测不同胃癌组织及正常对照组织中PCDH17mRNA表达水平的差异。分别使用0、10.0、25.0和50.0uM的金雀异黄酮与0、2.5、5.0和10.0uM的5-AZA-Cdr进行处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1,72h后弃去培养液,加入1ml Trozol抽提RNA,随后用同样的方法检测检测金雀异黄酮处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1中PCDHI7mRNA表达水平的改变,并与5-Aza-Cdr处理作用相比较。3、胃癌组织及配对胃正常组织PCDH17基因启动子区域的甲基化谱研究和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因启动子区域去甲基化的研究用TiangenDNA抽提试剂盒,提取胃癌组织基因组DNA和其正常对照组织的基因组DNA。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit将500ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。设计特异性引物并采用亚硫酸氢盐PCR扩增PCDH17基因第一外显子上游的1000bp的启动子区域。将PCR产物连接至载体psc-A,转入感受态细胞。每个样本挑取15个克隆并PCR扩增确认,挑选10个克隆细菌培养提取质粒并测序。统计分析测序结果中各CpG位点的甲基化频率。揭示PCDH17基因启动子区域甲基化对于mRNA表达的影响和胃癌发生的相关性。使用25uM的金雀异黄酮与5uM的5-AZA-Cdr分别处理胃癌细胞株AGS和胃正常细胞株Ges-1,72h后收集细胞。用同样的方法检测金雀异黄酮药物处理前后PCDH17基因启动子区域CpG位点甲基化谱的改变,并与5-Aza-Cdr进行比较。揭示金雀异黄酮诱导PCDH17基因mRNA表达的表观遗传机制。研究结果：1、金雀异黄酮对胃癌细胞株及胃正常细胞株生长抑制和细胞周期的影响AGS细胞经25μM金雀异黄酮处理72h后,有明显的G2-M期阻滞,而经5μM的5-Aza-Cdr处理后,无细胞周期改变但有明显的细胞凋亡发生。而两种药物均对Ges-1的细胞周期和凋亡无明显改变。CCK-8细胞增殖实验表明,金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均对胃癌细胞株AGS具有显着的抑增殖作用,且呈时间和剂量的依赖性。两种药物对AGS的抑增殖作用均较Ges-1更显着。2、胃癌PCDH17mRNA水平的检测和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17mRNA表达的研究胃癌细胞株AGS与胃正常细胞株Ges-1的PCDH17mRNA表达水平无显着差异。胃组织PCDH17mRNA水平存在广泛的个体差异性。35例胃癌组织中,PCDH17mRNA水平相对自身正常对照组织显着下降的有29例,比率高达82.86%。并且高-中分化组和中低分化组中下降的比例显着高于低分化组。TNM Ⅰ+Ⅱ期显着高于Ⅲ+Ⅳ期。金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均显着上调胃癌细胞株AGS的PCDH17mRNA的表达,其中25μM金雀异黄酮处理组AGS的PCDH177mRNA水平增加至未处理时的15-16倍,5μM的5-Aza-Cdr处理组上调至未处理时的8-9倍。两种药物处理前后,胃正常细胞株Ges-1的PCDH17mRNA表达水平无明显变化。3、胃癌组织及配对胃正常组织PCDH17基因启动子区域的甲基化谱研究和金雀异黄酮诱导胃癌细胞PCDH17基因启动子区域去甲基化的研究胃组织PCDH17基因启动子区域甲基化谱存在个体差异。与自身正常对照相比,胃癌组织PCDH17基因启动子区域个别CpG位点存在高甲基化,如1号样本的-870位点,-731位点和-458位点。此外,不同个体中易感性CpG位点不同。金雀异黄酮和5-Aza-Cdr均显着改变了胃癌细胞株AGS的PCDH17基因启动子区域甲基化谱,但受影响的CpG位点不同。而金雀异黄酮处理组（25μM,72hrs）在PCDH17基因启动子-678位点,-614位点,-458位点,-207位点和-129位点有明显的去甲基化,而5Aza-Cdr处理组（5μM,72hrs）在PCDH17基因启动子-84位点和-74位点有明显的去甲基化。胃正常细胞株Ges-1的两种药物处理组均无明显去甲基化发生。结论：（1）金雀异黄酮可以抑制胃癌细胞AGS的生长,其抗肿瘤作用是通过G2-M期阻滞来实现的；且该药物对正常细胞Ges-1的抑增殖作用显着弱于AGS,提示该药物对正常细胞毒性相对较弱。（2）PCDH17基因的表达具有广泛的个体差异,但在胃癌组织中表达水平显着低于自身正常对照组织,提示该基因是个潜在的肿瘤抑制基因；且其表达下降在早期胃癌中更为显着,可能作为诊断早期胃癌的一个指标。（3）胃癌组织中PCDH17基因启动子区域CpG岛高甲基化导致基因沉默,与胃癌癌变相关。（4）金雀异黄酮能显着诱导胃癌细胞株AGS细胞PCDH17基因的表达,并且其表达上调机制与该基因启动子区域去甲基化相关。（5）与去甲基化药物5-Aza-Cdr相比,金雀异黄酮具有更为显着的去甲基化功能,并且该药物天然、无毒、稳定,具有潜在的临床应用价值。上述研究成果,为了解PCDH17基因的功能和胃癌的发生机制,研究金雀异黄酮的抗肿瘤作用的分子机理提供了新的思路,具有理论意义和潜在的临床应用价值。第二部分宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响研究背景：研究表明宫内发育迟缓会引起血浆中IGF-1水平下降。IGF-1基因含有2个独立的启动子、选择性转录的第五外显子,以及3’端多个转录终止位点,能编码多种IGF-1基因转录子,如启动子1启动的转录子P1；启动子2启动的转录子P2；无第五外显子的转录子IGF-1A及含第五外显子的转录子IGF-1B,是一个表观遗传调控基因。肝脏是体内IGF-1的主要合成部位,而宫内发育迟缓对出生后肝组织IGF-1基因各种转录子的表达水平以及IGF-1基因表观遗传特征的影响尚不清楚。研究目的：我们推测胎盘供血不足导致的宫内发育迟缓将会改变出生时及出生以后肝组织IGF-1基因各转录子的表达水平,并且会改变IGF-1基因的表观遗传特征,包括启动子区域的甲基化水平和组蛋白共价修饰密码。研究方法：将加载血栓素A2受体激动剂的微渗透泵植入孕13天的母鼠体内,诱导胎盘供血不足,进而导致胎儿宫内发育迟缓。加载0.5%酒精的微渗透泵的孕鼠后代作为正常对照组。采用实时定量逆转录PCR方法检测出生时和三周龄IUGR小鼠IGF-1mRNA表达水平,包括P1转录子,P2转录子,IGF-1A和IGF-1B。亚硫酸氢钠处理测序法检测启动子1和启动子2CpG岛的甲基化。染色质免疫共沉淀联合实时定量PCR法检测IGF-1基因第一外显子、第二外显子、第五外显子、近端3’UTR及远端3’UTR的组蛋白共价修饰密码。研究结果：（1） IUGR对小鼠肝组织IGF-1转录子的影响：出生时,IUGR显着降低了新生小鼠肝组织总mRNA水平,其中P1和IGF-1B显着降低。IGF-1A在IUGR雄性新生小鼠中也出现明显下降。三周龄时,IUGR显着降低了雄性小鼠肝IGF-1总mRNA水平,其中P1,P2以及IGF-1A显着降低,而雌性小鼠总mRNA及各转录子水平均无改变。（2） IUGR对小鼠肝组织IGF-1基因启动子1和启动子2CpG岛甲基化的影响：出生时,IUGR雄性小鼠启动子1-78位点CpG甲基化显着增高；IUGR雌性小鼠启动子1-142位点CpG甲基化显着增高,-110位点和-328位点CpG甲基化显着降低。三周龄时,IUGR雌性小鼠启动子1-328位点CpG甲基化显着增高,启动子2-347和-93位点的CpG甲基化显着增高。（3） IUGR对小鼠肝组织IGF-1基因第一外显子、第二外显子、第五外显子、近端3’UTR及远端3’UTR组蛋白共价修饰密码的影响：出生时,IUGR雄性小鼠IGF-1基因第五外显子和3’UTR H3K9乙酰化显着增高；IUGR雌性小鼠IGF-1基因第二、五外显子H3K9三甲基化显着增高；3’UTR H3K9三甲基化显着增高,H3K9乙酰化和及H3K4三甲基化显着降低。三周龄时,IUGR雄性小鼠IGF-1基因近端3’UTR H3K9三甲基化显着下降,IUGR雌性小鼠IGF-1基因第一外显子H3K4和H3K9三甲基化增高,第五外显子H3K14乙酰化降低,H3K4二甲基化增高；近端3’UTR H3K9三甲基化显着上升远端3’UTR H3K4三甲基化增高。结论（1）IUGR降低了肝IGF-1基因各种转录子的表达水平和表观遗传特征,且IUGR对雄性的影响较雌性显着。（2）启动子DNA的甲基化与组蛋白共价修饰相互作用,组蛋白的不同化学修饰之间又发生协同或者拮抗的相互作用,共同行使IGF-1基因转录的表观遗传调控。（3）IUGR导致的组蛋白修饰密码应年龄的不同而改变,提示了在不同的发育阶段,不同的组蛋白共价修饰复合物受到了影响。
二、p16和nm23-H1在胃癌中的表达及其临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p16和nm23-H1在胃癌中的表达及其临床应用（论文提纲范文）
（1）胃癌中lncRNA ASH1L-AS1的表达调控及其促癌分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 一、lncRNAASH1L-AS1在胃癌组织中高表达 |
| 二、lncRNAASH1L-AS1促进胃癌细胞恶性表型 |
| 三、lncRNAASH1L-AS1上调邻近编码基因ASH1L表达 |
| 四、ASH1L促进胃癌细胞恶性表型 |
| 五、NME1是lncRNAASH1L-AS1的相互作用蛋白 |
| 六、NME1上调lncRNA ASH1L-AS1和ASH1L表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 |
| 导论 |
| 1. 膀胱癌概述 |
| 2. 基因拷贝数变异的生物学意义 |
| 3. 基因拷贝数变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. 膀胱癌中的基因拷贝数异常 |
| 5. 问题与展望 |
| 6. 本项研究的目的和基本策略 |
| 结果 |
| 第一节 本研究入组病例及其临床病理特征 |
| 1. 膀胱癌肿瘤组织病例 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织病例的临床病理特征 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织病例随访情况 |
| 2. 膀胱癌尿样本 |
| 2.1 膀胱癌尿样本病例的临床病理特征 |
| 2.2 膀胱癌尿样本病例随访情况 |
| 第二节 膀胱癌组织中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌肿瘤组织中的DNA拷贝数异常 |
| 1.2 膀胱癌肿瘤组织中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. DNA拷贝数异常与患者预后的相关性分析 |
| 2.1 DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 2.2 DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3. 基于临床病理风险因素与DNA拷贝数异常的预后预测模型 |
| 3.1 Cox风险比例回归分析影响膀胱癌患者无瘤生存期的独立预后因素 |
| 3.2 基于膀胱癌独立预后因素构建预后预测模型 |
| 3.2.1 构建非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.2 构建肌层浸润性膀胱癌患者预后预测模型 |
| 3.2.3 高风险非肌层浸润性膀胱癌患者预后预测 |
| 第三节 基于Real-time PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 2.1 术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的关系 |
| 2.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发的相关性 |
| 2.3 构建非肌层浸润性膀胱癌短期肿瘤复发预测模型 |
| 第四节 基于3D数字PCR方法检测膀胱癌术前尿脱落细胞中DNA拷贝数异常改变辅助膀胱癌预后判断 |
| 1. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的相关性分析 |
| 1.1 膀胱癌患者术前尿样本中的DNA拷贝数异常改变 |
| 1.2 术前尿样本中DNA拷贝数异常与临床病理风险因素的关系 |
| 2. 3D数字PCR与real-time PCR对尿液中拷贝数变异分子的检测效能比较 |
| 2.1 受试者工作曲线分析比较两者检测效能 |
| 2.2 构建基于3D数字PCR的术前尿样本诊断模型 |
| 3. 膀胱癌患者术前尿样本中DNA拷贝数异常与预后的相关性分析 |
| 3.1 尿样本中DNA拷贝数异常与非肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 3.2 尿样本中DNA拷贝数异常与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性 |
| 讨论 |
| 1. 膀胱癌相关分子标志物研究的策略 |
| 2. 组织中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 3. 尿液中膀胱癌预后相关分子标志物 |
| 4. 3D数字PCR在膀胱癌患者尿液检测中的应用 |
| 5. CEP63、FOSL2及PAQR6的异常改变与肿瘤的关系 |
| 6. 本项研究的局限性 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、研究病例和实验材料 |
| 1. 膀胱癌患者及其生物学样品 |
| 2. 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 3. 实时荧光定量PCR |
| 4. 3D数字PCR |
| 5. 引物序列 |
| 6. 主要仪器和设备 |
| 7. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 尿沉渣DNA提取 |
| 2. 实时荧光定量PCR |
| 3. 扩增产物质量检测 |
| 4. 引物扩增标准曲线 |
| 5. 3D数字PCR |
| 6. 统计学方法 |
| 第二章 EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义 |
| 导论 |
| 1. EB病毒概述 |
| 2. EB病毒相关的上皮性恶性肿瘤 |
| 3. EB病毒编码基因及其变异与恶性肿瘤的关系 |
| 4. EB病毒编码的小RNA与恶性肿瘤的关系 |
| 5. 本项研究的目的和策略 |
| 结果 |
| 第一节 EB病毒编码的miRNA在胃癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、EB病毒相关胃癌中病毒及宿主miRNA的表达 |
| 1. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.1 miRNA芯片质量控制 |
| 1.2 EB病毒相关胃癌肿瘤组织中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌细胞系中病毒miRNA的表达谱 |
| 1.4 EB病毒相关胃癌中高表达的病毒miRNA |
| 1.5 探索EB病毒相关胃癌中高表达病毒miRNA的靶基因及其功能 |
| 2. EB病毒相关胃癌中宿主miRNA的表达 |
| 2.1 EB病毒相关胃癌组织中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.2 EB病毒相关胃癌细胞系中宿主miRNA的差异表达分析 |
| 2.3 EB病毒相关胃癌中与病毒有关的宿主miRNA |
| 3. EB病毒编码的miRNA与宿主miRNA的相关性分析 |
| 3.1 探索EB编码的miRNA与宿主细胞miRNA表达的相关性 |
| 3.2 探索与EB病毒miRNA与相关宿主miRNA结构的相关性 |
| 3.3 探索与EB病毒相关的宿主miRNA的靶基因及其功能 |
| 三、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA对宿主基因表达的影响 |
| 1. EB病毒相关胃癌中差异表达的宿主基因 |
| 1.1 转录组测序EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.2 公共数据库中EB病毒相关胃癌组织中宿主基因的差异表达 |
| 1.3 EB病毒相关胃癌与EB病毒阴性胃癌中宿主基因的差异表达 |
| 2. 差异表达的宿主基因与病毒miRNA的相关性 |
| 2.1 从差异表达的宿主基因中筛选病毒与宿主miRNA的共同靶基因 |
| 2.2 病毒与宿主miRNA共同靶基因KEGG信号通路富集 |
| 四、EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART1-3p和miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. EB病毒miRNA对胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞增殖能力的影响 |
| 3. EB病毒miRNA对胃癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞周期的影响 |
| 4. EB病毒miRNA对胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p过表达对细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART1-3p及miR-BART7-3p敲降对细胞迁移能力的影响 |
| 第二节 EB病毒编码的miRNA在鼻咽癌中的表达及其医学生物学意义 |
| 一、研究入组病例及其临床病理特征 |
| 二、鼻咽癌中EB病毒miRNA的表达 |
| 三、鼻咽癌中EB病毒miR-BART7-3p的功能研究 |
| 1. 瞬时转染后细胞中miR-BART7-3p的表达变化 |
| 2. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 2.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞增殖能力的影响 |
| 3. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 3.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞周期的影响 |
| 4. miR-BART7-3p对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.1 miR-BART7-3p过表达对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 4.2 miR-BART7-3p敲降对鼻咽癌细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1. 临床相关研究质量控制 |
| 2. EB病毒相关胃癌中病毒miRNA的研究 |
| 3. 本项研究中病毒miRNA在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义 |
| 4. 鼻咽癌中病毒miRNA的研究 |
| 5. 本项研究中病毒miRNA在鼻咽癌中的表达及其意义 |
| 本章小结 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. EB病毒相关胃癌患者及其生物学样品 |
| 2. 鼻咽癌相关患者及其生物学样品 |
| 3. 临床样品收集、制备和鉴定所需试剂 |
| 4. 主要试剂盒 |
| 5. 实时定量荧光PCR试剂 |
| 6. 细胞培养和miRNA转染 |
| 7. 常用试剂配制 |
| 8. 细胞培养用主要器皿 |
| 9. 主要仪器 |
| 10. 主要分析软件 |
| 二、实验方法 |
| 1. 基因表达谱芯片技术 |
| 2. 芯片数据读取 |
| 3. 芯片数据预处理和标准化 |
| 4. 第二代测序 |
| 5. miRNA实时定量荧光PCR |
| 6. 总RNA样品的提取、制备及质量鉴定 |
| 7. 细胞生物学实验方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（3）LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的生物学功能研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LncRNA LIFR-AS1影响胃癌发生的分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在胃癌中的作用及其临床应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）全外显子组测序筛选胃癌腹膜转移相关基因CDC27（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 WES筛选胃癌术后腹膜转移相关基因及构建预测模型 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 腹膜转移相关基因CDC27 的筛选 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 慢病毒介导的沉默和过表达CDC27 稳转细胞株的构建 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 CDC27 对人胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）胸腺肿瘤体部立体定向放射治疗及其预后相关研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 胸腺肿瘤体部立体定向放射治疗疗效和毒副反应评估 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 NM23-H1,APE1,RAF-1 在胸腺肿瘤中的表达及其与预后关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胸腺肿瘤放射治疗的临床进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）前脑啡肽PENK在胃肠间质瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胃肠间质瘤高表达相关基因的筛选和候选基因前脑啡肽PENK的临床病理特征及预后分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二部分 前脑啡肽PENK对胃肠间质瘤细胞功能的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三部分 前脑啡肽PENK在胃肠间质瘤细胞中的作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 小结 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（7）胃癌组织中DAPK基因高甲基化与DNMT1表达的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）Survivin抗体和胃泌素在胃癌患者血清中联合检测及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 综述 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌病因及发病机制 |
| 1.3 胃癌的临床表现 |
| 1.4 胃癌诊断研究进展 |
| 1.4.1 影像学检查 |
| 1.4.2 内镜检查 |
| 1.4.3 肿瘤标志物检查 |
| 1.4.4 基因检测 |
| 1.4.5 展望 |
| 1.5 Survivin |
| 1.5.1 Survivin 的理化性质 |
| 1.5.2 Survivin 的生物学作用 |
| 1.5.3 Survivin 在胃癌中的应用 |
| 1.5.4 展望 |
| 1.6 胃泌素 |
| 1.6.1 胃泌素的理化性质 |
| 1.6.2 胃泌素的生物学作用 |
| 1.6.3 胃泌素在临床中的应用 |
| 1.6.4 展望 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 标本收集 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 仪器设备 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 血清 survivin Ab 检测 |
| 3.4.2 血清 GAS 检测 |
| 3.5 统计分组标准 |
| 3.6 统计学处理 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 Survivin 抗体和 GAS 在不同临床分组中的含量及比较 |
| 4.1.1 胃癌组和正常对照组的含量及比较 |
| 4.1.2 早期胃癌组和正常对照组的含量及比较 |
| 4.1.3 胃癌组中有淋巴结转移和无淋巴结转移的比较 |
| 4.2 Survivin 抗体和 GAS 与胃癌临床病理因素之间的关系 |
| 4.2.1 Survivin 抗体与胃癌临床病理因素之间的关系 |
| 4.2.2 胃泌素与胃癌临床病理因素之间的关系 |
| 4.3 血清 survivin 抗体和胃泌素的含量与胃癌部位之间的关系 |
| 4.4 血清 survivin 抗体和 GAS 浓度在胃癌组中的相关性 |
| 4.4.1 血清 survivin 抗体和 GAS 浓度在胃癌组中的相关性 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 Survivin 和 Survivin 抗体的生物学意义及临床应用价值 |
| 5.2 胃泌素的生物学意义及临床应用价值 |
| 5.3 血清 survivin 抗体和胃泌素在胃癌中的相关性 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间研究成果 |
（9）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 候选基因在新疆哈萨克族食管鳞癌初步筛查的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 确立新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的相互作用 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（10）金雀异黄酮诱导胃癌细胞周期阻滞和PCDH17基因表达及其启动子区域去甲基化的研究宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 序言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 目次 |
| 第一部分 金雀异黄素诱导胃癌细胞周期阻滞和PCDH17基因表达及其启动子区域去甲基化的研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 宫内营养缺乏对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
| 附录 |
四、p16和nm23-H1在胃癌中的表达及其临床应用（论文参考文献）
- [1]胃癌中lncRNA ASH1L-AS1的表达调控及其促癌分子机制研究[D]. 谢梦雨. 山东大学, 2021(11)
- [2]1、DNA拷贝数异常改变作为膀胱癌预后判断相关分子标志物的研究 2、EB病毒相关上皮性恶性肿瘤中病毒miRNA与宿主相互作用的分子机制及其意义[D]. 蔡曌. 北京协和医学院, 2021
- [3]LncRNA LIFR-AS1在胃癌中的作用及机制研究[D]. 赵江桥. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]全外显子组测序筛选胃癌腹膜转移相关基因CDC27[D]. 吴凡. 福建医科大学, 2019(07)
- [5]胸腺肿瘤体部立体定向放射治疗及其预后相关研究[D]. 郝学军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [6]前脑啡肽PENK在胃肠间质瘤中的作用及机制研究[D]. 汤德锋. 上海交通大学, 2017(06)
- [7]胃癌组织中DAPK基因高甲基化与DNMT1表达的关系[D]. 高燕. 泰山医学院, 2016(06)
- [8]Survivin抗体和胃泌素在胃癌患者血清中联合检测及意义[D]. 胡华. 河南科技大学, 2013(06)
- [9]新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析[D]. 陈艳. 新疆医科大学, 2012(05)
- [10]金雀异黄酮诱导胃癌细胞周期阻滞和PCDH17基因表达及其启动子区域去甲基化的研究宫内发育迟缓对小鼠肝IGF-1基因表达及表观遗传特征的影响[D]. 杨月琴. 浙江大学, 2012(09)