陈春雷1 李国前2杨小霞2王杰华2潘莹2
(1福建省南安市中医院362300）
（2福建医科大学附属泉州第一医院362000)
【摘要】 目的：观察瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）表达的影响。方法：大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组)。线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型，于缺血1h后再灌注12h后断头取脑，免疫组织化学法和半定量PCR法检测大鼠脑组织中TNF-ɑ的表达。结果：与模型组相比，实验组大鼠TNF-ɑ的表达显著下调，差异有统计学意义（P <0.05）。结论：瑞舒伐他汀对脑缺血损伤的保护机制可能与抑制炎症因子的表达有关。
【关键词】瑞舒伐他汀；脑缺血再灌注；TNF-ɑ表达
【中图分类号】R965【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）14-0377-02
炎症反应在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中发挥重要作用。在参与炎症反应的众多介质中，肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）具有重要的影响。新近研究表明，降脂药物瑞舒伐他汀具有抗炎、抗氧化、调节免疫、改善血管内皮功能等作用[1]。本研究旨在观察瑞舒伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-ɑ表达的影响，探讨瑞舒伐他汀的可能抗炎机制。
1.材料和方法
1.1 实验动物和分组
雄性SD大鼠24只，体重250～300g，福建医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK2012-0001）。随机分为3组：假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组)，每组8只。
1.2 药品和试剂
瑞舒伐他汀，英国阿斯利康制药公司(10mg/片)；兔抗大鼠TNF-ɑ多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；即用型免疫组化试剂盒(鼠/兔)，福州迈新生物技术开发有限公司；Trizol试剂，美国Invitrogen公司；PCR试剂盒及逆转录试剂盒，美国MBI Fermentas公司；引物合成，上海生工生物工程技术公司。
1.3 模型制作和给药方法
模型组和实验组参考改良Zea-Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断1h后拔出线栓，形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。将瑞舒伐他汀片研磨成均匀细小的粉末状，倒入20mL的离心管内，加入适量的生理盐水充分混匀，使药物质量浓度为1g/L。实验组在模型制作前用瑞舒伐他汀5mg/kg/d连续灌胃10d，1次/d；假手术组和模型组正常喂养。
1.4 模型处理和取材部位
大鼠于再灌注后12h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧固定，迅速开胸暴露心脏。经左心室行主动脉插管，剪开右心耳作为灌注液流出口，在10～20min内经左心室灌注200mL生理盐水快速冲洗，取出全脑，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去左侧大脑半球，取右侧半球，取大鼠视交叉后6～11mm的脑组织备用。
1.5 神经功能评分
参照Longa的5分法进行评定。大鼠脑缺血/再灌注后清醒时进行神经功能评分：0分：无明显神经功能缺损；1分：不能伸展左侧前肢；2分：行走时向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，0分和4分者均被剔除，同时按要求及时补充大鼠入组。
1.6 免疫组织化学法检测TNF-ɑ的表达
大鼠脑组织切片经脱腊至水，严格按照试剂盒说明书操作，AEC室温显色，自来水冲洗，苏木素复染，水性封片剂封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性细胞计数：在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野，分别计数免疫反应阳性的细胞数，结果取5个视野的平均值。
1.7 半定量PCR法检测TNF-ɑ mRNA的表达
TNF-ɑ上游引物序列：5'-ccagaccctcacactcagatca-3'，下游引物序列：5'-ggaggctgactttctcctggta-3' （扩增产物大小290bp）；β-actin上游引物序列：5'-attgtaaccaactgggacg-3'，下游引物序列：5'-tctccagggaggaagagg-3'（扩增产物大小490 bp）。取大鼠脑组织按Trizol法提取总RNA并进行逆转录反应。PCR扩增反应条件为：变性940C 30s，退火640C 30s，延伸720C 30s，反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳，半定量分析电泳条带的吸光度，结果以目的基因与β-actin吸光度的比值表示。
1.8 数据统计学分析
所有数据经过方差齐性检验和正态性检验，用均数±标准差（x-±s）表示，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.结果
2.1神经功能评分
假手术组无肢体瘫痪，模型组和实验组表现不同程度肢体瘫痪。与模型组比较，实验组神经功能评分降低，两组比较有统计学意义(P<0.05)(表1)。
2.2 缺血脑组织TNF-ɑ阳性细胞的表达
假手术组仅见少量TNF-ɑ阳性细胞的表达。模型组TNF-ɑ阳性细胞的表达较假手术组显著增多，2组差别有统计学意义（P<0.05）；实验组TNF-ɑ阳性细胞的表达较模型组显著减少，2组差别有统计学意义（P<0.05）(表1，图1)。
2.3 缺血脑组织TNF-ɑ mRNA的表达
假手术组TNF-ɑ mRNA有微弱的表达。模型组TNF-ɑ mRNA的表达较假手术组显著增高，2组差别有统计学意义（P<0.05）；实验组TNF-ɑ mRNA的表达较模型组显著降低，2组差别有统计学意义（P<0.05）（表1，图2）。
3.讨论
TNF-ɑ在中枢神经系统主要由小胶质细胞、星形胶质细胞合成和分泌，具有广泛的生物学功能。TNF-ɑ属于前炎性细胞因子，在脑缺血再灌注损伤后的炎症级联反应中起核心作用[2]，其能促使血管舒缩活性物质高表达，导致前列腺素、血栓烷产生增多，使血管舒缩因子活性下降；亦可通过抑制纤溶反应及活性蛋白C的抗凝作用，刺激内皮细胞释放白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1），通过与IL-1协同使内皮细胞表面呈促凝状态，从而促进血栓形成[3]。沈良军等[4]发现TNF-ɑ属可能在颅脑损伤后的细胞凋亡中起了重要的作用，对TNF-ɑ表达的干预可望起到减少神经元凋亡，从而保留更多神经功能的目的。本研究我们证实，脑缺血再灌注损伤后模型组大鼠脑组织中TNF-ɑ表达均较假手术组显著升高，结果与相关文献吻合，表明TNF-ɑ是脑缺血性再灌注损伤中起重要作用的炎性细胞因子，提示抑制或减少TNF-ɑ的表达，可作为治疗缺血性脑损伤的有效方法。
新型他汀类药物瑞舒伐他汀用量少、作用强，被称为强效血脂调节药。其能减少甲羟戊酸合成，从而使内源性胆固醇合成减少，减少泡沫细胞的形成，减少各种炎性介质，最终起到抑制炎性反应，稳定动脉斑块的作用。研究表明瑞舒伐他汀具有多效效应，除了降低胆固醇作用外，还有改善血管内皮功能、增强粥样斑块的稳定性、减少血管的炎症和氧化应激的作用[5]。本研究结果显示，予瑞舒伐他汀预处理后，实验组大鼠的神经功能缺损评分较模型组显著降低，TNF-ɑ表达较模型组显减少，表明瑞舒伐他汀可抑制炎症反应，减少炎症因子TNF-ɑ的释放，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。
【参考文献】
[1]李国前，蔡俊颖，杨小霞.瑞舒伐他汀对脑梗塞患者脑血流动力学的影响[J].中国临床药理学杂志，2011，27(8)：574-576.
[2]李晓宾，平蕾，李传玲等.急性脑梗死后患者血清肿瘤坏死因子ɑ与MRI动态变化的相关性研究[J].中华脑科疾病与康复杂志（电子版），2013，3 (4)：232-236.
[3]陶曼丽，染志刚，李伟等.肿瘤坏死因子基因多态性与脑血管病的关系研究进展[J].中国卒中杂志，2013，8 (12)：993-997.
[4]沈良军，刘伟国.重型颅脑损伤后TNF-ɑ表达及其与细胞凋亡的关系[J].浙江医学，2008，30 (10)：1076-1078.
[5]李国前，王杰华，杨小霞等.瑞舒伐他汀预处理对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠Bcl-2和Bax表达的影响[J].神经解剖学杂志，2011，27（5）：555-559.
论文作者:陈春雷1 李国前2杨小霞2王杰华2潘莹2
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第14期供稿
论文发表时间:2015/8/5
标签：实验组论文; 模型论文; 大鼠论文; 损伤论文; 细胞论文; 统计学论文; 脑缺血论文; 《医药前沿》2015年第14期供稿论文;