（1东南大学医学院 江苏南京 210009）
（2东南大学附属中大医院眼科 210009）
（3南通大学附属丹阳市人民医院眼科 212300）
【摘要】目的：研究不同浓度胰岛素对高糖培养下视网膜色素上皮细胞增殖活力的影响。方法：体外培养人RPE(ARPE-19)，在高糖(30 mmol/L)浓度下给予0U/L，100U/L，101U/L，102U/L，103U/L，104U/L胰岛素作用12h、24h、48h后用MTT法检测各组视网膜色素上皮细胞的增生活力。结果：各浓度胰岛素组在不同观察时间（12小时、24小时、48小时），其吸光度值（OD570）与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），各组吸光度值（OD570）随作用时间的延长而有增加的趋势，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：胰岛素对高糖培养下视网膜色素上皮细胞增殖活力无明显影响。
【关键词】胰岛素 细胞活力 视网膜色素上皮细胞
【中图分类号】R458+.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）34-0076-03
【Abstract】Objective:To investigate the effect of different concentrations of insulin on the proliferation of high glucose cultured human retinal pigment epithelial cells-19 in vitro.Methods: Human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19) were cultured in vitro, exposed to high glucose group, treated with different concentrations of insulin (0U/L、100U/L、101U/L、102U/L、103U/L、104U/L) respectively. Cell proliferation was detected by MTT assay after 12, 24 and 48 hours. Results: There was no statistical significant difference among different concentrations of insulin intervention conditions in groups of high glucose compared to controls (P> 0.05).There was a statistically significant difference with the extension of time（P<0.05）. Conclusion: Insulin had no effect on the proliferation of ARPE-19 cells in the high glucose condition.
引言
糖尿病（diabetic mellitus，DM）是严重影响人们生命健康的常见病，其致残率、致死率仅次于心脑血管病以及癌症，糖尿病患者因糖代谢障碍导致全身各组织器官的微血管发生病变,其中糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是其最严重的微血管并发症之一，是成年人致盲的重要原因之一[1]。胰岛素注射治疗糖尿病被认为是控制血糖并减少糖尿病并发症的较好的手段，给糖尿病患者带来福音，但是随着研究的不断深入，对于胰岛素在DR治疗上的争议越来越多。视网膜细胞的增殖与视网膜病变密切相关。我们通过研究不同浓度胰岛素对高糖培养下视网膜色素上皮细胞增殖活力的影响，现将结果报告如下：
1.材料和方法
1.1材料 人视网膜色素上皮细胞(cultured human retinal pigment epithelial cells-19, ARPE-19)购自ATCC公司，DMEM/F12培养液(Gibco公司)，胰岛素（江苏万邦生化医药股份有限公司），胎牛血清(FCS，杭州四季青)，0.05% Trypsin-EDTA(Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基偶氮唑(MTT， Sigma公司)，酶标仪(microplate reader)model 860 BIO-RAD。
1.2方法 ARPE-19悬液置于含有10% FCS的DMEM/F12培养液的培养瓶内，于37℃,5% CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至融合后，用0.05% Trypsin-EDTA消化，离心，制成单细胞悬液，按1∶4～1∶6传代。将长至融合状态的细胞以0.05% Trypsin-EDTA消化,离心,制成单细胞悬液。细胞增殖活性的测定 取生长状态良好的ARPE-19细胞,采用上述传代方法消化,制成细胞悬液,计数,接种于96孔板,每组设6个平行复孔且每孔的细胞数保持一致，模型建立后加入等量高糖(30 mmol/L)培养液200μL/孔,置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h后换无血清培养液饥饿12h；给予0，100，101，102，103，104U/L胰岛素作用12h、24h、48h后每孔加入0.5%MTT溶液20μL，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养4h，终止培养，小心吸弃培养液，每孔加入DMSO 150μL，室温振荡10min；在酶联免疫检测仪上测定各孔570nm的吸光度(OD570)值绘制生长曲线。
统计学分析:实验重复3次,测到的数据采用SPSS18.0统计学软件进行ANONA方差分析数据以均数±标准差(x-±s)表示,以P<0. 05为有统计学差异。
2.结果
如表1 所示：当胰岛素干预浓度分别为0U/L、100U/L，101U/L、102U/L、103U/L、104U/L时，在不同观察时间（12小时、24小时、48小时），其吸光度值（OD570）与空白对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。
表1：高浓度葡萄糖组，不同浓度胰岛素干预下RPE细胞吸光度值（OD570）χ-±s 
与空白对照组相比：△P>0.05，** P<0.05
如表2所示：当胰岛素浓度分别为0U/L、100、101U/L、102U/L、103U/L、104U/L时，各组吸光度值（OD570）随作用时间的延长而有增加的趋势，差异具有统计学意义（P<0.05）。
表2：高浓度葡萄糖组，不同观察时点RPE细胞吸光度值（OD570）(χ—±s)
与12h组相比：a：P<0.05，b：P>0.05；与24h组相比：c：P<0.05
3.结论
糖尿病是终生进展性疾病，其发病机制为不同原因所致的胰岛素相对或绝对不足，引发的糖、蛋白质以及脂肪代谢失调及水电解质等一系列代谢紊乱综合征，其主要特征是高血糖。随着社会经济的发展、人们生活水平的提高以及饮食结构的改变，全球范围内糖尿病的发病率逐年增加，糖尿病患病率的惊人上升是一个全球性的公共健康和经济问题。糖尿病的病程、血糖、血压、血脂、年龄和性别、体重、妊娠、眼部手术及眼部局部情况、全身相关疾病等均可能影响糖尿病视网膜病变的发生和发展。目前针对本病的治疗主要有：合理控制血糖水平、药物治疗、激光光凝治疗、玻璃体视网膜手术治疗、曲安奈德玻璃体腔注射、抗VEGF治疗等，但还没有确实有效的根治性方法[2]。
胰岛素是由胰岛β细胞分泌，是机体内唯一降低血糖的激素，胰岛素注射被认为是控制血糖并减少糖尿病并发症的较好的手段，但随着研究的不断深入，对于胰岛素在DR 治疗上的争议越来越多。早期研究表明，胰岛素通过模拟正常人的胰岛素分泌曲线，使血糖迅速达到或接近正常水平，从而保护残存的胰岛细胞的功能，从而延缓糖尿病并发症的发生。胰岛素具有神经保护作用，在血清饥饿条件下，胰岛素可通过PI3K/AKT 信号转导途径阻止caspase-3的活化，抑制视网膜神经元凋亡[3]。美国DCCT(Diabetes Control and Complications Trial)小组对基础视网膜病的研究显示，13％胰岛素治疗的患者在治疗的6个月内视网膜病变恶化，而在传统药物治疗的患者中有7.6％恶化[4]。胰岛素可通过破坏血-视网膜屏障、改变视网膜血流而大量进入视网膜作用于视网膜色素上皮 ( retinal pigment epithelial，RPE) 细胞、内皮细胞、Müller 细胞等，刺激这些细胞分泌各种细胞因子而促进DR的发展[5]。胰岛素刺激视网膜细胞增殖和IGF密切相关，主要是通过抑制IGF结合蛋白导致IGF-1生物利用度的增高和直接激活IR或者IGFR 两条途径来完成的[6]。而视网膜细胞的增殖与视网膜病变密切相关。
细胞内线粒体脱氢酶可以将水溶性的MTT（噻唑蓝）还原成非水溶性的甲瓒，后者呈紫色结晶体。利用有机溶剂将其消化后，测定溶液的吸光度值（OD570），从而测定活细胞的相对含量。我们的前期研究表明[7]高糖可以抑制RPE细胞增殖。我们通过研究不同浓度胰岛素对高糖培养下视网膜色素上皮细胞，增殖活力的无明显影响（P>0.05），但是随作用时间的延长而有增加的趋势，差异具有统计学意义（P<0.05）。
目前胰岛素在外周组织中的效应及机制已基本被阐明，但是胰岛素在视网膜以及中枢神经系统的研究仍远远落后。在视网膜中含有大量的多不饱和脂肪酸，并且它对氧的摄入和对葡萄糖氧化作用均高于其他组织，这使得视网膜对于氧化应激更加敏感，在糖尿病时易于受到氧化应激的损伤。我们以后工作的重点将研究高浓度胰岛素干预视网膜色素上皮细胞，测定氧化损伤的指标，以研究胰岛素强化治疗引起视网膜病变恶化的机制。
综上所述，不同浓度胰岛素对高糖培养下视网膜色素上皮细胞，增殖活力的无明显影响，我们也推测糖尿病患者行胰岛素强化治疗引起DR的恶化时，RPE细胞活力并未增加。
参考文献
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[7]冯丽丽,栾洁,傅敏,等.高糖体外对视网膜色素上皮增生以及活性氧表达的影响[J]. 国际眼科杂志, 2010,(03):453-455.
论文作者:施光明1，3,栾洁2(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2013年12月第34期供稿
论文发表时间:2014-1-15
标签：胰岛素论文; 视网膜论文; 细胞论文; 色素论文; 光度论文; 糖尿病论文; 浓度论文; 《医药前沿》2013年12月第34期供稿论文;