高小玲[1]2004年在《重组腺病毒IkBαM抑瘤作用的实验研究》文中认为目的：大量扩增重组腺病毒以满足体内外实验需求;纯化病毒达到体内外药效学实验的用药标准。方法：利用293细胞包装并批量制备体内外实验所需重组腺病毒。利用GFP及有限稀释法测定病毒滴度和感染靶细胞的效率。氯化铯梯度离心纯化病毒并提高病毒的滴度。利用病毒透析袋透析病毒,去除氯化铯，以减少体内实验中由此带来的毒副作用。结果：AdIκBαM经扩增后的滴度为1.9×108pfu/L; AdIκBα的滴度为2.8×108pfu/L。经氯化铯梯度离心后AdIκBαM的滴度为2.1×108pfu/L; AdIκBα的滴度为2.9×108pfu/L。重组腺病毒AdIκBαM可有效感染293包装细胞，HepG2肝癌细胞和Hela细胞，完全感染靶细胞HepG2的MOI值为20；对正常内皮细胞株HUVEC感染效率极低，提示该重组腺病毒具有潜在的临床应用价值。结论：本实验解决了重组腺病毒大量扩增的难题以及利用氯化铯梯<WP=12>度离心技术纯化病毒以及透析病毒等难点,为其产业化提供可靠的实验室依据。
况舸[2]2005年在《靶向表达IκBαM重组腺病毒的构建及抑瘤作用的体外实验研究》文中研究说明核转录因子 κB (nuclear factor-κB, NF-κB)是一种极其重要的转录激活因子,广泛参与炎症、免疫、细胞增殖和细胞凋亡等多种病理生理过程。大量的研究证明:NF-κB 信号传导途径的激活抑制了 TNF-α等化学试剂诱导的凋亡,在肿瘤细胞抗凋亡机制中扮演了一个重要角色。本研究室前期研究中构建了表达 IκBαM 的复制缺陷型腺病毒(AdIκBαM)表达系统,并证实重组腺病毒 IκBαM 联合肿瘤坏死因子TNF-α 在体内外能显着抑制 HCC 细胞株 HepG2的生长并诱导该肿瘤细胞凋亡,有望成为一种十分有效的肝癌基因治疗方法。但腺病毒介导的基因转移缺乏靶向性,从而阻碍了腺病毒载体介导的抗肿瘤基因治疗的临床应用。近年来,利用肿瘤特异性启动子调控目的基因在肿瘤细胞中特异性表达逐渐成为腺病毒介导的靶向性基因治疗研究的热点。针对肝癌的靶向性基因治疗,最常使用的是 AFP 启动子。但存在转录活性低、适用范围窄等缺陷。近年来,对 Survivin 和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的研究逐渐成为热点。hTERT 是端粒酶的催化亚基,仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达,而在正常细胞中几乎没有表达。Survivin 是一种细胞凋亡抑制因子,属于抗凋亡蛋白
向明确[3]2003年在《重组腺病毒IκBαM抑瘤作用的体外实验研究》文中研究指明目的：检测重组腺病毒IκBαM(AdIκBαM)在肝癌细胞HepG_2中的表达及TNF-α诱导下IκBαM变化情况，并观察此超级抑制物对NF-κB活性的抑制作用，为IκBαM在肝癌基因治疗中的应用提供理论基础。 方法： 1．利用293细胞包装并批量制备体外实验所需重组腺病毒。 2．利用GFP及有限稀释法测定病毒滴度和感染靶细胞的效率。 3．采用Western blotting法检测293细胞和HepG2中重组腺病毒介导的IκBαM的表达及TNF-α诱导下IκBαM变化情况。 4．EMSA实验观察AdIκBαM感染前后经TNF-α处理的HepG2细胞核中NF-κB活性水平的变化。 结果： 1．扩增AdIκBαM的滴度：2×10~8pfu/L,感染靶细胞HepG_2的MOI为20。 2．AdIκBαM在HepG2中能稳定高效表达且不因TNF-α的诱导而降解，未感染细胞的IκBα及转入的AdIκBα对照则随诱导时间延长而呈现先逐渐降低后升高的趋势。3.EMSA显示:感染AdIκBαM的细胞在处理前后均无NF-κB活化迹 象，而未感染及感染AdIκBα的细胞经TNF-α诱导后则有NF-κB过 度活化情况。 结论:AdiKBaM能高效扩增并有效感染靶细胞HePG:，在HePGZ细胞中呈现稳定高水平表达，且不会被TNF一a诱导而降解，能稳定有效的抑制HePG:细胞中NF一沼的过度活化，_上述结果初步表明，通过IKBaM超级抑制物抑制NF一KB的活性，再辅以常规的抗肿瘤治疗，有望成为一种十分有效的肿瘤基因治疗方法。I沼aM超级抑制物作为肝癌基因治疗的一种新的辅助手段，理论上是可行的。
参考文献：
[1]. 重组腺病毒IkBαM抑瘤作用的实验研究[D]. 高小玲. 重庆医科大学. 2004
[2]. 靶向表达IκBαM重组腺病毒的构建及抑瘤作用的体外实验研究[D]. 况舸. 重庆医科大学. 2005
[3]. 重组腺病毒IκBαM抑瘤作用的体外实验研究[D]. 向明确. 重庆医科大学. 2003