（黑龙江中医药大学 黑龙江 哈尔滨 150040）
【摘 要】目的：研究PAMD对荷瘤小鼠BXPC-3细胞凋亡率的影响。方法：裸鼠右腋皮下接种胰腺癌（BXPC-3）细胞建立模型，应用流式细胞仪检测：离子激发光波长 488nm，功率300mw，P染色阳性细胞的数量由计算机软件自动处理，绘制DNA含量分布图，以图上G1峰前形成的亚二倍体峰（Ap峰）所占的百分比表示凋亡率。观察PAMD对荷瘤小鼠BXPC-3细胞凋亡率的影响。结果：实验通过对G1峰前的亚二倍体峰所占百分比的分析，观察PAMD对BXPC-3荷瘤小鼠细胞凋亡率的影响，细胞凋亡率均明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05； P＜0.01）。
【关键词】流式细胞术；胰腺癌；BXPC-3细胞
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0226-01
1 实验材料
1.1实验动物
裸鼠50只，体重20±2g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供，合格证：SCXK（京）2007-0001。
1.2实验瘤株
胰腺癌瘤株（BXPC-3）购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。
1.3动物饲养
在黑龙江中医药大学药物安全性评价中心饲养。
1.4药物
（1）蝙蝠葛酚性碱（PAMD）由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，用时先以1mol·L-1 HCl溶解后，再用1mol·L-1 NaOH调pH值至中性，加蒸馏水至所需浓度。实验时临时配制成溶液。
（2）注射用环磷酰胺（Cyclophosphamide For Injection），江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号：国药准字H32020857。
1.5 实验仪器
CLOUTEREPICS-XL型流式细胞仪 美国Beckman-Coulter 公司
LDZ522型低速离心机 北京医用离心机厂
1.6 试剂碘
化丙啶（propidiumiodide，PI） Sigma公司
2 实验方法[1] [2] [3]
2.1流式细胞仪检测荷瘤小鼠细胞凋亡率
按以下实验步骤操作：
2.1.1 接种24h后，各用药组均腹腔注射给药，连续21d。停药后次日称取小鼠体重，摘眼球取血处死小鼠，并用酒精消毒操作部位皮肤，置于超净工作台中（事先以紫外线灯消毒30min）以无菌操作剥取肿瘤结节，剔除纤维包膜和坏死组织。迅速用眼科剪在冰盘上尽可能剪碎。
2.1.2 将组织置于300目铜网上，用PBS液冲洗，网搓法制成单细胞悬液。
2.1.3 用PBS液稀释为10mL，反复吹打30次，沉淀10min，3000rpm离心10min，弃上清液。
2.1.4 沉淀加预冷的75%乙醇5mL混匀，4℃放置12h，3000rpm离心10min，弃上清液。
2.1.5 加PBS液5mL，3000 rpm离心10min，弃上清液。
2.1.6取沉淀调细胞浓度为2×106·mL-1，取 1mL 细胞悬液加入RNase 1.6mL (1mg·mL-1) 37℃水浴箱中孵育 30min，再次离心10 min 后将沉淀溶于 0.4mL PBS 中。
2.1.7 4℃通光条件下加PI染液(内含有200 mg·mL-1 PI，1% Triton，0.9%NaCl，50 mg·mL-1 RNase)200μL染色30min。
2.1.8 应用流式细胞仪检测：离子激发光波长 488nm，功率300mw，P染色阳性细胞的数量由计算机软件自动处理，绘制DNA含量分布图，以图上G1峰前形成的亚二倍体峰（Ap峰）所占的百分比表示凋亡率。
3 实验结果
PAMD对荷瘤小鼠细胞凋亡率的影响，实验结果见表1、
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实验通过对G1峰前的亚二倍体峰所占百分比的分析，观察PAMD对BXPC-3荷瘤小鼠细胞凋亡率的影响，表1结果显示， PAMD高、中剂量组及阳性对照组与模型对照组比较，细胞凋亡率均明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05； P＜0.01）。
4 讨论
由于形态学观察到的细胞凋亡只能定性，不能定量，因此，本实验采用流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）来进行细胞凋亡的定量分析。该法快速、准确、所需样本少、灵敏度高。基本原理为：细胞凋亡时，在细胞、亚细胞和分子水平上发生的一系列特征性改变，如细胞周期停滞，DNA梯度降解，细胞膜通透性增加及细胞DNA和蛋白质含量降低等。以特异性荧光染料，如碘化丙啶（PI）等染色后，细胞内成分与荧光强度成正比关系，细胞凋亡时表现为荧光强度下降，因而可用流式细胞仪进行定量检测。
参考文献：
[1]曾国钱.蝙蝠葛碱抑制卡西霉素刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放血小板活化因子[J].中国药理学通报,1990,11(4):346-350
[2]苏富琴,王丽萍,杨宏艳,等.蝙蝠葛酚性碱对动物学习记忆能力的影响[J].药物研究.2003,12(10):23-24
[3]曾繁典,刘长丽.蝙蝠葛酚性碱抗氧化和降脂作用的实验研究[J].中国临床药理与治疗学,2005,10(3):343-347
基金项目：
黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531609）
作者简介：
刘玉斌（1971—），男，硕士，副主任药师，主要从事中药制剂，中药药理等基础研究。
论文作者:刘玉斌,苏慧,苏云明,杜永强
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/21
标签：细胞论文; 小鼠论文; 凋亡论文; 流式论文; 黑龙江论文; 蝙蝠论文; 百分比论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿论文;