1安康市中心医院725000
2第四军医大学药学院710032
3陕西中医药大学中药学院712000
4第四军医大学唐都医院 710038
5陕西海天制药有限公司712000
6西安市疾病控制中心710033
摘要：目的 研究四季抗病毒合剂对抗A16型柯萨奇病毒（CoxA16）的作用。方法 采用75 TCID50、50 TCID50 CoxA16感染Vero细胞模型和5日龄BALB/c乳鼠ip感染1×106 TCID50 CoxA16建立动物模型，分别检测四季抗病毒合剂对CoxA16感染Vero细胞损伤的量效、时效指标，评价不同剂量四季抗病毒合剂对病毒感染乳鼠死亡率、生存时间、体质量、临床症状评分等作用。结果 ①四季抗病毒合剂对CoxA16病毒具有显著抑制作用。>1.22mg生药/mL四季抗病毒合剂能显著提高Vero细胞存活率，抑制75 TCID50和50 TCID50 CoxA16诱发Vero细胞病变；②四季抗病毒合剂具有显著改善CoxA16病毒感染乳鼠的临床症状，尤其>1.62g生药/kg剂量的乳鼠生存率等指标与利巴韦林片相当或略高，且临床评分优于利巴韦林片。结论 四季抗病毒合剂具有显著抑制CoxA16细胞增殖作用，并明显减弱CoxA16诱发乳鼠病毒性致死、显著改善乳鼠感染病毒的临床症状评分，为该制剂临床有效治疗手足口病提供了实验依据。
[关键词]：四季抗病毒合剂;CoxA16病毒;Vero细胞;乳鼠;手足口病
1.实验和材料
1.1 细胞和病毒株：非洲绿猴肾细胞（Vero），购自中国协和医科大学基础所细胞中心，本室常规传代培养，取传代次数为121-130 的细胞用于实验。CoxA16购自美国典型菌种保藏中心（ATCC），陕西省疾病控制中心病毒实验室常规传代，TCID 50为10-3.5，-80℃冰箱保存；病毒临用前用M199培养基（含2.5%胎牛血清）稀释至75 TCID50或50 TCID50（供体外实验）以及 1×107 TCID50（供体内实验）。
1.2 实验动物：5日龄近交系BALB/c乳鼠，体质量[3.0±0.5（2.5-3.6）]g；购自第四军医大学实验动物研究中心，许可证号SCXK（陕）2014-002；动物实验过程的所有操作均遵守中国科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》（国科发财字[2006]398号）进行，并饲养在IVC（独立换气笼盒）饲养系统（上海绍丰实验动物设备有限公司）中。
1.3 药物：四季抗病毒合剂，由陕西海天制药有限公司提供，每瓶含相对于原生药116.4g（0.97g/mL×120mL），批号141027，临用前用M199培养基配制；利巴韦林片（国药准字H20033538），江西汇仁药业有限公司生产，规格100mg×24片/盒，产品编号：B1420204833，临用前用M199培养基配制。
1.4 试剂：M199培养基，购自美国Hyclone公司，批号NYG1404；胎牛血清，购自美国Hyclone公司，批号NXD0606。MTS细胞增殖定量检测试剂盒，购自美国Promega公司，批号0000086221；生理盐水即0.85%NaCl（Normal saline，NS）。
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2 方法
2.1 四季抗病毒合剂体外抗 CoxA16活性：参照李仲等方法[1]并略作修改，Vero细胞随机分为9组：对照组，模型组（仅接种75 TCID50和50 TCID50 CoxA16）和7个四季抗病毒合剂组（对接种病毒的Vero细胞分别按生药4.85、2.43、1.22、0.61、0.30、0.15、0.08mg/mL的剂量给药）。
2.2四季抗病毒合剂体内抗CoxA16活性：5日龄BALB/c乳鼠80只，随机分为8组，对照组、模型组、10 mg/kg利巴韦林阳性对照组和四季抗病毒合剂即含生药3.23、1.62、0.81、0.40、0.20 g/kg 5个剂量组，每组10只乳鼠；参照文献[1]方法造模，即每只乳鼠ip接种CoxA16（滴度为1×107TCID50/mL）0.1 mL，对照组ip NS。造模2 h各组乳鼠ip对应试药0.1 mL，连续15 d，每日1次，对照和模型组乳鼠分别ip NS；逐日称量动物体重、记录存活动物数，分别计算体质量、临床评分值、死亡率、平均生存时间等参数。
3 结果
3.1 四季抗病毒合剂对抗CoxA16感染Vero细胞致病的作用：四季抗病毒合剂对CoxA16细胞的增殖具有剂量依赖性显著抑制并呈正相关，即随其剂量增大抑制作用增强（P<0.01）。（1）四季抗病毒合剂能够显著缓解75TCID50 CoxA16感染Vero细胞致病变作用（表2），4.85、2.43、1.22mg/mL四季抗病毒合剂提高Vero细胞存活率依次为68.22、55.43和46.62%（P<0.01或0.05），其对应平均保护率[（病毒组细胞死亡数-试药组死亡数）/病毒组细胞死亡数×100%]依次为53.14、34.28和21.29%；（2）四季抗病毒合剂相同；(3)各剂量组亦能显著提高50TCID50CoxA16感染Vero细胞存活率和保护率。由此说明，四季抗病毒合剂对CoxA16病毒具有显著抑制作用。
3.2 四季抗病毒合剂对CoxA16接种乳鼠的治疗作用：乳鼠ip 3.23、1.62、0.81、0.40、0.20g生药/kg四季抗病毒合剂15天，能够显著延长ip接种1×106 TCID50 CoxA16病毒的5日龄BALB/c乳鼠存活时间，3.23g生药/kg剂量组延长存活时间长于利巴韦林片组（P>0.05）；1.62g生药/kg剂量组延长存活时间与利巴韦林片组相当；但四季抗病毒合剂对CoxA16 ip接种后乳鼠生存率等指标和各种症状的改善作用即病毒感染临床评分明显优于利巴韦林片组。
4讨论 近年来，由于手足口病在春夏季节的3岁以下儿童高发并流行，已有采用四季抗病毒合剂治疗取得良好疗效的报道。我们采用快速液相色谱法已确定其中至少含有42种共有化学成分。尽管四季抗病毒合剂的临床和临床前药效学实验研究均证实可有效治疗由CoxA16病毒所致的手足口病，但是何种成分发挥药效作用即抑制 CoxA16病毒尚不清楚。有研究报道单体成分绿原酸是一种有效的抗病毒中药单体，对大部分病毒有很好的抑制作用，二咖啡酰奎宁酸具有抗病毒、抗炎、降血脂等作用，木犀草苷具有较强的杀菌消炎，解热镇痛的功效，在抗病毒和抗肿瘤方面表现出较好的作用。然而，四季抗病毒合剂的抗病毒作用与这些单体成分是否有关，其作用机制如何将是本课题组后续重点研究的科学问题。
参考文献
[1]李 仲，任庆杰，门 丽，等.EV71型手足口病乳鼠动物模型的建立及免疫、内分泌及病理特征研究[J].免疫学杂志,2012,28(10):867-869.
†作者简介：郑 龙（1974-01汉族）男，本科，主管中药师，中药药理学
*通讯作者：王四旺（1957-12汉族）男，教授，博士生导师，分子中药学
论文作者:郑龙1†，肖会敏2，郭伦锋1，刘洋3，顾丙权4，
论文发表刊物:《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期
论文发表时间:2016/4/29
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