1.新疆石河子市人民医院检验科 石河子 832000
2新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科 石河子 832000
【摘 要】目的：探讨上尿路结石患者血清纳米细菌的感染情况。方法：选取上尿路结石患者35例，正常对照者35例，无菌技术抽取静脉血5ml，离心，取上清液，行纳米细菌培养，以生理盐水替代血清重复上述操作作为阴性对照，每周于倒置显微镜下观察其生长情况并记录。结果：结石组有29例（82.9%）4周后在培养瓶壁上出现数目不等的白色结晶，直径为0.15-0.25 mm，培养至8周，白色结晶体积增大，肉眼清晰可见白色沉淀，沉淀表面凹凸不平，直径为11-15mm，对照组8例阳性（22.9%）阳性，P=0.000，差异有显著统计学意义。结论：纳米细菌与泌尿系结石关系密切，可能是导致泌尿系结石的原因之一。
【关键词】纳米细菌；上尿路结石；细菌培养；血清
前言
泌尿系结石是一种全球性疾病，其病因复杂，有多种学说解释其发生机制，多年来，我们一直致力于泌尿系结石的研究[1，2，3，4]，分别从环境、膳食、代谢、遗传易感性等几个方面对泌尿系结石的病因进行了阐述，但仍不够明了。近年来，对纳米细菌的研究，为泌尿系结石发病机制的阐明提供了新的切入点[5，6，7]。为此，我们收集肾结石患者35例，对其血清进行纳米细菌培养，报道如下：
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取上尿路结石患者35例，健康对照者35例，留取中段晨尿；结石患者的选择：静脉肾盂造影、CTU或MRI证实为单侧泌尿系结石，且无泌尿系畸形：如肾盂输尿管交界处狭窄、输尿管狭窄等，并行血、尿检查，排除代谢异常者。
1.2 方法
1.2.1纳米细菌培养
将无菌静脉血离心（1500r/min离心5min），取上清液通过一次性输液器滤膜过滤2次后，之后依次经0.45μm和0.22μm一次性正压滤器过滤，再将滤液0.1 mL加入含DMEM培养液、10%γ-FBS和1%HEPES缓冲液的培养瓶中，37℃、5%CO2条件下进行培养。以0.9%氯化钠注射用代替尿液标本重复上述操作作为阴性对照。每周于倒置显微镜下观察培养情况并记录。
1.2.2 茜素红钙染色
将标本培养菌液滴至载玻片上，自然晾干，用95%乙醇和乙醚固定15min，无菌水洗后放置70℃ 烤箱中烘烤10 min，用无菌蒸馏水冲洗3遍，每遍2min，用2%茜素红钙染液染5min，0.2%淡绿水溶液复染30s，0.5%醋酸水溶液速洗，最后用95%乙醇和100%乙醇脱水，待烘干后用二甲苯透明中性树胶封固，油镜观察。
1.2.3 应用透射电镜（负染法）
吸取含纳米细菌的培养液，16 000rpm离心45min，弃上清液，用PBS洗涤沉淀，2.5%戊二醛4℃固定24h，双蒸水洗涤5min×3次，离心后加入0.5mL双蒸水制成混悬液。将附有碳支持膜的200目铜网浮于上述悬液的液滴上5min，用滤纸小心吸除液体，置于10mL/L磷钨酸悬液的液滴上90s，用滤纸小心吸除液体、晾干，在H-7650透射电镜下观察，工作电压80kV。
1.2.4结石成分分析
①取结石样本约l-1.5mg，样本载体溴化钾200-300mg，分别将其烘干；②样品制备：压片前分别取出拱干的溴化钾和结石样品，将其放入玛瑙研钵充分研磨后，置入100℃的烘箱内。烘干5分钟左右，取出继续研磨约30秒，放置于压片机压片30秒制成压片；③压片装入结石红外光谱自动分析仪中，分析仪自动打印报告和分析结果。
1.3 统计学处理
采用 SPSS17.0 软件，计量资料采用x±S表示，计量资料先进行Levene方差齐性检验，若方差具有齐性（P > 0.05），采用两独立样本 t 检验，若方差不具有齐性（P <0.05），则采用Satterthwaite近似 t 检验及非参数检验，计数资料采用 χ2 检验，以 P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 纳米细菌培养
纳米细菌在 37℃ 和 5% CO 2 的细胞培养条件下，经过4-6周的培养，在倒置显微镜下可见细微颗粒，积聚成团状或分散，并逐渐贴附于培养瓶底部（见图1）。同时，生理盐水代替原尿样本培养作为阴性对照，对照培养液均未发现纳米细菌。
2.2 纳米细菌茜素红钙染色
普通光镜下观察，纳米细菌的矿化外壳被茜素红染剂染成红色，视野中可见分散或聚集的红色颗粒（图2）。
2.4 结石组、对照组血液纳米细菌感染情况
35份肾结石患者血清标本中，有29份（82.9％）培养4周后，在培养瓶壁上出现数目不等的白色结晶，直径为0.15-0.25 mm，轻微震荡后，结晶物与培养瓶壁未分离。继续培养至8周，白色结晶体积明显增大，肉眼清晰可看到白色沉淀，沉淀表面凹凸不平，直径为11-15mm。健康对照者中有8例（22.9％）培养阳性，而阴性对照组则未见到白色结晶出现。
4 讨论
泌尿系结石是一种全球性疾病，也是我国最常见的泌尿外科疾病之一，我国人群中尿石症的患病率约为120/10万~6020/10万[8]。其高发年龄为20~50岁，占90%，男性略多于女性[9]。泌尿系结石以肾结石最常见，它的病因涉及到遗传、环境、生活膳食习惯等多种因素，有多种学说解释其发生原因，但仍不清楚，故给泌尿系结石的防治带来了很大的困难。
近年来，对纳米细菌的研究，为泌尿系结石发病机制的阐明提供了新的切入点。纳米细菌是Kajander E.O[10]等在调查牛血清培养失败时发现的一种特殊细菌，特殊的培养条件导致了一种具有细胞毒作用的生物被膜，其包含了一种革兰染色阴性基因序列为16sr RNA的颗粒，此颗粒被命名为“纳米细菌”。纳米细菌直径约为80～500nm，是一种革兰氏阴性菌，大小约为普通细菌的1/l00。纳米细菌形态呈球状或球杆状，细胞壁较厚，没有荚膜与鞭毛。
鉴于纳米细菌在泌尿系结石形成中扮演的角色，人们推测纳米细菌在泌尿系结石的发展中可能具有重要的作用，并已通过电镜技术和结石培养证实了纳米细菌在上尿路结石中的存在。Ciftcioglu N[11]等对72例来自芬兰的肾结石进行了纳米细菌培养和鉴定，70例阳性，显示97.2%的肾结石中含有纳米细菌。Kajander E.0.等对30例肾结石行纳米细菌培养及鉴定，阳性率达100％，Shiekh等[12]采用培养的纳米细菌经静脉注射Wistar大鼠，8周后处死，尸检时发现实验鼠的肾小管内面发生广泛钙化。Hu WG，Wang XF等[13]用肾结石患者的血清同样培养出了纳米细菌，并通过单抗和Von kossa染色鉴定为纳米细菌，阳性率92%。Sheikh等用纳米细菌鼠尾静脉感染实验大鼠，处死后进行尸检，尸检时鼠肾小管管腔内发现不规则颗粒样结晶，Von kossa染色阳性，以远曲小管和近曲小管为主。
本研究中，结石组35例，29例纳米细菌阳性（82.9%），明显高于对照组，P=0.000，差异有显著统计学意义，认为，纳米细菌可能是泌尿系结石的原因之一。但结石组阳性率比文献报道的要低，考虑可能与结石成分有关，目前关于纳米细菌与结石成分的关系，尚未研究，有待进一步研究。
那么纳米细菌是怎么诱发上尿路结石的形成呢？我们考虑机制如：1.泌尿系结石形成是一个缓慢的过程，有研究显示：尿液中结石晶体对肾小管上皮细胞的损伤是肾结石形成的始发环节[14]。而纳米细菌具有细胞毒性，感染机体任何组织和细胞[15]，当纳米细菌侵入肾脏，可破坏肾小管的上皮细胞，导致肾小管上皮细胞损伤钙化，损伤程度随作用时间加长而加重，而损伤的细胞的晶体粘附性逐渐增强，导致细胞与一水草酸钙等晶体的粘附量也会相应地增加[16]。并且纳米细菌依靠其独特的矿化能力，在生理条件下能形成磷灰石结晶，这些结晶沉积于肾盏、肾盂中，逐渐吸附并聚集成团，可与尿液中尿酸、草酸盐、磷酸盐等结合，从而诱发结石形成。2.钙离子是结石的主要阳性离子，结石形成与发展与尿液中游离钙增高密切相关。近年来，有研究表明，钙敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR）在尿钙重吸收过程中起着重要作用，它与尿钙吸收、排泄密切相关，通过调节髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）紧密连接蛋白-14（Claudin-14）的表达影响肾小管对钙离子的重吸收[17]，从而调节尿钙排泄。当纳米细菌感染肾脏，可分泌钙化脂多糖生物膜，增加肾脏中钙离子浓度，并且降低CaSR调节细胞外钙离子的敏感性，抑制尿钙在肾小管的重吸收，导致高钙尿，从而引起结石发生。当然，其具体机制尚需要进一步研究。
本研究初步探讨纳米细菌感染情况与单侧上尿路结石形成的关系，并对留取结石标本进行了结石分析，其中绝大多数包含草酸钙结石，考虑样本量少，无法分组探讨其成分与纳米细菌感染关系，目前仍需要更大样本量的实验，探讨纳米细菌感染与结石成分之间的关系。
参考文献
[1]王勤章，钱 彪，丁国富，等，新疆南部维吾尔族泌尿系结石患者维生素Ｄ受体基因多态性的研究[J].实用医学杂志，2009，25（17）：2805 -2807.
[2]陈宗跃，纪世琪，朱国栋，等，480例新疆南部维吾尔族尿结石成分分析与代谢评价[J].现代预防医学，2010，37（3）：570-579.
[3]钱彪，王勤章，丁国富，等，新疆南部维吾尔族尿石症患者病例对照研究[J].现代泌尿外科杂志，2008，13（5）：344-346.
[4]Farooq A.Shiekh，PhD，Jon E.Charlesworth，Sung-Hoon Kim，MD，PhD，Larry W.Hunter，Muthuvel Jayachandran，PhD，Virginia M.Miller，PhD，and John C.Lieske，MD.Proteomic evaluation of biologic nanoparticles isolated from human kidney stones and calcified arteries.Acta Biomater.2010 October；6（10）：4065–4072.
论文作者:焦辉, 钱彪, 王勤章,丁国富,,刘志立, 李强
论文发表刊物:《航空军医》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/10/16
标签：结石论文; 细菌论文; 泌尿系论文; 纳米论文; 肾小管论文; 肾结石论文; 血清论文; 《航空军医》2015年第7期供稿论文;