刘玲玲[1]2003年在《原发性高血压病患者全线粒体基因变异扫描分析研究》文中提出原发性高血压病是一种常见的心血管疾病，发病率高达20％以上，因并发脑中风、各种类型的心脏病及晚期肾脏疾病而死亡率极高。在大部分患者，原发性高血压的发病机制目前仍不十分明确，但清楚的是遗传及环境等多因素的相互作用与高血压的发病有关，其中遗传因素对血压范围波动的影响可达30～50％。目前关于高血压病遗传基因的研究着重于核基因组中可疑致病基因及遗传标志的评估，线粒体基因(mtDNA)突变在高血压发病中的作用仍是一个新的研究领域。为了探讨mtDNA变异与原发性高血压病的关系，评估高血压病患者mtDNA变化，以及mtDNA突变是否可能作为高血压病易感的遗传标志，我们对高血压病患者及正常血压人群的全mtDNA变异情况进行了对比研究。 在本研究中包括正常血压人群及原发性高血压病患者各20例，提取外周血液DNA，采用32对交叉重迭引物，PCR扩增全长线粒体16.6kb基因。应用时相温度梯度凝胶电泳法对所有扩增DNA片段的突变情况进行筛选，然后通过直接测序明确mtDNA突变。分析突变的类型、发生频率、密度，进化保留情况，重建mtDNA邻接关系结构树，并对mtDNA大范围的缺失突变及12个区域的微卫星状态进行检测。 研究发现：(1)高血压病患者mtDNA的变异频率和密度高于正常血压组(p＜0.05)。突变主要分布在非编码的D环区，并以tRNA、12SrRNA、COXI、线粒体转录因子1结合位点的变异更明显。(2)高血压病患者mtDNA突变的碱基构成与正常血压组比较存在明显的差异，碱基颠换及错义突变率远远高于正常血压组(p＜0.0001)，而且在高血压组中～80％的错义突变位点位于动物进化过程中所高度要求的基因进化保留区。(3)高血压病患者152 T-＞C基因突变明显高于正常血压组，可能为高血压易感发病的高风险位点。其它潜在高风险位点包括：143G、12705C、16311C等。(4)高血压病患者在np16184～16193的线粒体基因微卫星处于不稳定状态。(5)通过对mtDNA高变D环区的邻接关系树重建分析发现部分高血压病患者具有家族群集趋势，突变频率、错义突变远远高于其它高血压病患者及 军医进修学院博士学位论文一中文摘要正常血压人群中刃．000），线粒体基因13506C一T、247G一A等夹变可能是此家族高血压病的遗传特征。币）本研究所有样本中未发现有常见缺失N）突变及其它大范围的缺失突变。 本研究表明高血压病患者较正常血压人群具有更高的mtDNA变异密度、碱基颠换率及错义突变率，部分高血压病患者具有家族群集趋势，提示mtDNA的变异可能参与了高血压的发病过程，并可能通过血管内皮细胞活性氧物质异常产生，导致血管内皮功能的失调，而在高血压发病的病理生理过程中发挥重要的作用。
刘昱圻[2]2008年在《线粒体VDAC在母系遗传原发性高血压分子遗传机制及功能中的研究》文中研究说明原发性高血压(essential hypertension,EHT)是当今社会最常见的心血管疾病,与冠心病、脑卒中、心力衰竭和肾功能障碍密切相关,是导致多种心血管疾病死亡的主要危险因素之一,其患病率在我国有逐年增高的趋势。线粒体病由于突变的线粒体逐渐积累,导致线粒体氧化磷酸化功能受损,细胞功能下降。线粒体tRNA突变是线粒体疾病的研究热点之一。线粒体含有22种tRNA。既往的研究也发现原发性高血压具有家族聚集倾向性,其中一些具有明显母系遗传特点,而且线粒体疾病往往同时表现血压升高,提示我们线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变可能与血压升高有一定的相关性。我们对2000名原发性高血压患者进行了测序分析,其中发现一个具有典型母系遗传特点的大家系,我们收集了5代104人,其中母系成员27人。我们对家系成员的一般情况、血压等进行测量和统计,对其中42A人进行全身体格检查、采血进行生化和心脏超声检查。结果发现该家系中母系成员高血压患病率高达55.6%,非母系成员高血压患病率15.6%(P＜0.01);母系成员高血压发病年龄有提前的趋势(Ⅱ代62.0±6.2岁;Ⅲ代46.3±5.8岁;Ⅳ代23.3±2.9岁);母系成员血压与年龄、吸烟、饮酒和高盐饮食有明显相关性(P＜0.05);母系成员血糖、总胆固醇、血钠明显高于非母系成员(P＜0.05)。分子生物学研究发现在线粒体tRNA~(Ile)基因的4263位点发生了A→G点突变,该位点在各个生物都是高度保守的,而且4263位于tRNA~(Ile)基因的受体臂5'端,在这个位点发生突变会影响tRNA与氨基酸的结合。为了进一步探讨线粒体tRNA~(Ile)4263 A→G点突变影响血压的具体机制,我们对该家系的4个母系成员(3个血压异常和1个血压正常者)和3名遗传背景相同的对照者建立了传代淋巴细胞系,对这些细胞的生长速度及线粒体外膜的VDAC(voltage-dependent anion channel)在携带tRNA~(Ile)4263 A→G点突变高血压患者发病中的作用进行了初步研究。结果发现携带A4263G突变者淋巴细胞倍增时间明显延长;VDAC及凋亡相关因子Bax在高血压患者表达增高,而淋巴细胞sK_(Ca)通道表达没有明显差异;流式细胞仪检测线粒体膜电势,结果发现与正常对照者比较携带tRNA~(Ile)4263 A→G点突变高血压者线粒体膜电势降低,而加入CsA——VDAC拮抗剂后线粒体膜电势升高,与正常者之间的差异消失;共聚焦显微镜检测线粒体外膜的VDAC与Bax蛋白结合的情况,结果发现携带tRNA~(Ile)4263 A→G点突变高血压患者线粒体外膜VDAC绿色荧光与Bax蛋白红色荧光融合,而正常对照者两者没有融合,在加入CsA后高血压患者线粒体外膜VDAC绿色荧光与Bax蛋白红色荧光没有融合。为明确VDAC在携带mtDNA突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用,我们在对具有母系遗传特点的原发性高血压流行病学调查研究的基础上,对前期发现的携带mtDNA4263A→G突变的原发性高血压大家系患者采集血液样本,通过建立传代的淋巴细胞系,分别加入VDAC抑制剂——CsA和PT(通透性转变孔道)开放剂——苍术苷,利用共聚焦显微镜技术研究VDAC在携带mtDNA突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用,结果发现与正常对照者淋巴细胞线粒体内钙荧光强度及△ψ_m(线粒体膜电势)降低,在加入苍术苷后正常者线粒体内钙荧光强度增加,而突变携带者没有明显改变,但两者△ψ_m均降低,而加入CsA后可以抑制苍术苷作用。通过此课题研究治疗直接证明了线粒体tRNA~(Ile)4263 A→G点突变与高血压发病直接有关,我们的实验也首次从生物进化及分子生物学证据证明:线粒体DNAtRNA~(Ile)4263 A→G点突变在具有母系遗传特点的高血压发病中起着重要作用;通过对携带线粒体tRNA~(Ile)4263 A→G点突变高血压患者和正常者淋巴细胞建立细胞系,研究发现线粒体外膜的VDAC表达及功能改变可以影响线粒体膜电势(△ψ_m)、诱导凋亡物质释放及对线粒体内钙([Ca~(2+)]_m),因此推测VDAC在线粒体tRNA~(Ile)4263 A→G点突变导致血压升高机制中发挥关键作用。
参考文献：
[1]. 原发性高血压病患者全线粒体基因变异扫描分析研究[D]. 刘玲玲. 中国人民解放军军医进修学院. 2003
[2]. 线粒体VDAC在母系遗传原发性高血压分子遗传机制及功能中的研究[D]. 刘昱圻. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
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