王洁[1]2005年在《水稻白叶枯病抗性相关基因及抗病基因类似序列的克隆》文中研究表明水稻抗病相关基因的克隆有助于阐明水稻抗病的分子机制。Xa23是章琦等人从我国普通野生稻Oryza rufipogon)中鉴定出来的1个新的白叶枯病抗性基因,并已育成以感病籼稻品种JG30为遗传背景的近等基因系CBB23。本研究以JG30和CBB23为材料,通过mRNA差异显示技术和基于同源序列的候选基因法,对抗、感近等基因系材料接种病原菌后1、3、5、7、10天得到的cDNA进行RT—PCR分析,分离在抗、感近等基因系间差异表达的cDNA片段,期望找到与抗病基因连锁或相关的基因片段,为克隆Xa23基因提供条件。 通过mRNA差异显示技术获得5个在抗、感近等基因系间差异表达的cDNA片段。其中片段CU10在感病材料JG30接种病菌后1～10天期间的表达量基本不变,而在抗病近等基因系CBB23接种病菌后的同一时段内所表达量普遍大于感病材料,而且其表达量随着接种病菌后时间的延长增强。序列同源性比对结果表明:CU10与水稻接种稻瘟病菌6、24小时后获得的4个EST序列(CB663801、CB658079、CB651075、CB648338)有99%(368/369)的同源性。据此推测,CU10序列来源于水稻基因组,其表达受到病原菌的诱导,其产物可能是水稻抗病信号传导途径中某种共同因子。将其电子定位到水稻第2号染色体。其它4个cDNA差异片段,在GeneBank中未搜索到具有明显同源性的序列,推测可能是新的cDNA片段。 根据STK类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中均扩增出一条472bp大小的条带,序列分析表明:该片段与通过差异显示方法所获得的CU10是同一序列,根据与其高度同源的EST序列,将其延长为1030bp,记为RTK;多序列比对显示,RTK上游序列与水稻接种稻瘟病菌6、24小时后获得的EST完全相同,而与未接种对照差别较大;下游序列在对照与接种病原菌后得到的EST之间没有差别。通过设计引物,在抗病的CBB23中扩增出RTK全长序列,而在感病亲本JG30中没有扩增出条带;证实了电子延长的正确性,同时也说明RTK基因与抗病性存在着某种联系。RTK有一个完整的开放阅读框,其编码的蛋白质具有信号肽和跨膜结构域,可能是一个具有磷酸化功能的跨膜蛋白。 根据NBS-LRR类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中扩增出一条500bp大小的条带,测序后获得了2类不同的NBS-LRR类抗性基因同源序列,其中NB1长514bp,电子定位于第11号染色体6978.5K～6979.1K处;NB2长505bp,电子定位于第11号染色体29707.9K～29708.5K处。二者的DNA序列同源性只有30%,但编码的氨基酸序列均具有NBS-LRR类抗性基因的典型保守结构,同源性搜索显示与已克隆的NBS-LRR类抗性基因同源序列有较高的同源性,说明NR1和NB2是NBS—LRR类抗性基因同源片段。它们与抗病性的关系有待获得全长cDNA序列后再进行分析鉴定。 根据胞外LRR类抗病基因保守区设计引物,从抗、感近等基因系中获得了2个RGA序列:LR1和LR2。序列分析发现,LR1和LR2不具有LRR类抗病基因的典型保守结构域。推测两片段与目的抗性基因无关。 对图位克隆法获得的4个抗病候选基因进行RT-PCR分析,表明4个候选基因在转录水平上均有表达。
张忆萍[2]2007年在《小麦条锈病抗性相关基因的克隆》文中认为小麦抗条锈病基因Yr26能高抗多个条锈生理小种，克隆该基因及其相关基因具有重要意义。基因Yr26已被定位到小麦染色体臂1BS上，本研究根据小麦EST物理图谱，在小麦染色体第一部分同源群短臂上查找与抗病相关的EST序列23条，设计相应的特异引物以寻找Yr26的候选基因。用这23对引物以感病亲本扬麦5号、抗病亲本92R137、抗池、感池为模板进行PCR扩增，其中源于EST序列BE440256的特异引物BE446250扩增出的条带，用HaeⅢ酶切后出现了与Yr26感病等位基因连锁的条带。将同样来源于EST(BE446250)的巢式引物以扬麦5号、92R137的cDNA为模板进行RT-PCR，分别在扬麦5号和92R137中扩增出283bp和296bp的条带。将获得的cDNA片段作为探针进行Southern杂交，在抗病材料中出现了特异的杂交带。用引物BE446250对小麦易位系92R137的TAC库进行筛选，得到该基因D组拷贝的阳性克隆，并测得其中部分序列。根据所得序列设计引物，其中引物XB-10能扩增出追踪Yr26的特异条带。用该引物扩增扬麦5号×92R137的F_2(555个单株)群体的基因组DNA，结合田间鉴定结果，综合分析表明该F_2群体中有16个单株发生了交换，与Yr26的遗传距离为2.7cM。通过BLAST分析发现该特异片段与大麦的3个NBS-LRR同源基因的同源性都在90％以上，有明显的NB-ARC结构。RARl和SGT1是两个在真核生物中非常保守的基因，这两个基因共同或独立的参与了许多抗病基因的抗病过程，本研究根据小麦ESTs序列中与大麦中RAR1和SGT1同源性较高的EST为基础设计特异引物，以抗条锈病易位系的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到了小麦RAR1和SGR1的cDNA片段，用RACE方法获得这两个基因的全长，它们的氨基酸序列与大麦RAR1(AAB96982.1)和SGT1(AF523682.1)序列同源性分别为97％和93％，并对这两个基因的氨基酸序列进行了比较分析。利用基因枪将钨粉包裹的表达载体220-Ta-RAR1-GFP轰击洋葱表皮进行瞬间表达，观测到Ta-RAR1蛋白主要分布在细胞质膜上和细胞核膜上。对条锈菌诱导后的抗病材料92R137、感病材料扬麦5号进行半定量分析，结果表明在抗、感材料中RAR1基因都受诱导，均在24h时表达量达到最大，随后表达量下降。而SGT1在条锈菌诱导前后表达量没有改变，为组成型表达。在白粉病诱导后的抗病簇毛麦中，RAR1、SGT1均被诱导表达。本研究还利用大麦条斑花叶病毒(BSMV)构建了小麦RAR1、SGTl的VIGS载体，将进一步研究小麦的这两个基因有没有参与到Yr26和Pm21的抗病反应中。
熊敏[3]2002年在《水稻抗病相关基因的遗传定位和分离克隆》文中进行了进一步梳理由数量性状位点(QTL)形成的数量抗性与抗病基因形成的质量抗性相比具有更加广谱和持久的特点。本研究通过定位水稻部分抗病相关基因并建立这些基因与抗病QTL在染色体位置上的相关性，为深入研究抗病相关基因提供出发点，同时，分离水稻中WRKY类转录因子基因，对该基因的功能进行研究是揭示水稻抗病机制的重要途径。 44个cDNA克隆代表44个抗病相关基因被定位于水稻12条染色体中的9条染色体上的56个位点。其中27个cDNA克隆在水稻染色体上的32个位点落在已知抗稻瘟病、抗白叶枯病、抗纹枯病及抗黄斑病毒的QTL区域内。同一克隆的多个拷贝往往位于不同染色体的相似位点，且有少数几个克隆的多个拷贝全部与抗病QTL相关联。以上研究结果表明，部分基因可能在水稻抵御病原物侵染的防卫反应中发挥着重要的调控作用，这些基因对于水稻数量抗性机理的研究具有重要意义。 cDNA克隆EI12I1在水稻抗病品种中受病原菌诱导后表达增强，该克隆是一个WRKY类转录因子基因的片段。以EI12I1为出发点从明恢63和珍汕97中分别分离出与WRKY类基因高度同源的基因，这个基因包含WRKY类转录因子家族典型的保守氨基酸序列WRKYGQK及锌指结构C-X_5-C-X_(23)-H-X-H。将明恢63中WRKY类基因的反义链通过农杆菌介导法转化明恢63与珍汕97重组自交系中的一个家系RIL15，获得T_0代转反义链植株65株。转反义链植株的报告基因PCR阳性率为65％，GUS染色阳性率为42％。接种病原菌后，2株转反义链植株A36、A37的感病性有较明显增强。此结果显示WRKY类基因可能在抗病反应的调控中发挥了一定的作用。
付冬[4]2011年在《水稻抗纹枯病QTLs定位及抗病候选基因发掘》文中指出水稻是世界上最重要的粮食作物之一,而水稻生产受到诸多生物和非生物逆境胁迫。纹枯病为我国水稻叁大病害之一,每年造成水稻产量的重大损失,部分地区甚至成为水稻病害之首。深入了解水稻抗病遗传机理,发现和利用抗病相关基因从而提高水稻的抗病性意义重大。本研究通过构建遗传群体、抗病性表型鉴定及分子标记作图,对水稻抗纹枯病QTLs定位；利用全基因组表达谱芯片筛选抗病基因,克隆了2个位于QTL定位区间的候选基因；构建了超表达载体并转化水稻,对抗病基因的分子功能进行了初步研究。研究的主要结果如下：1.利用来自中国广西的一个深水稻品种RSB03,与节水抗旱稻保持系沪旱1B(HH1B)杂交构建了包含286单株的F2群体及包含121个体的重组自交系(RILs)群体(F6：9),采用人工接种的方法对群体及亲本材料进行了抗病性鉴定,鉴定指标包括病级(DG)、病斑长(LL)、病斑高(LH)、相对病斑长(RLL)以及相对病斑高(RLH)等；2.2008年在上海(E1)和海南(E2)以及2009年在上海(E3)和海南(E4)分别对亲本及RILs群体进行表型鉴定,结果表明RSB03的抗病性显着优于HH1B。在四个环境中HH1B的DG、LL及RLL平均值分别为5.2、23.7cm及28.1%,而RSB03则平均为3.3、23.7cm和12.7%,其他几个抗病相关性状也表现同样特点,群体的表型呈现正态分布,对群体进行分子标记并构建遗传连锁图谱,进而对四个不同环境下的抗病QTLs进行定位,结果分别检测到与抗病相关的加性QTLs位点16、12、4和4个,分布于水稻10条染色体上,其中有多个位点被检测到同时控制几个性状,分别检测到上位性互作QTLs位点15、25、23和22对；其中在E4单环境、E2和E4联合定位以及四个环境的联合定位中均检测到位于第11染色体RM5704-RM202区间的抗病QTLs,这一结果与F2群体定位结果接近。3.2007年在海南对F2群体进行抗病性鉴定,亲本HH1B及RSB03的DG分别为5.4和4.3,群体表型呈现正态分布。对群体进行分子标记及QTLs定位分析,共检测到12个主效QTLs位点。在第11和12染色体上分别检测到一个控制DG的加性QTL位点,分别可以解释表型变异的18.07%和12.27%,其中位于第11染色体RM5349-RM202区间的位点还同时控制RLL及RLH两个性状,来自父本RSB03的等位基因起增强抗病性的作用；4.对材料RSB03人工接种纹枯病菌,对接种后第36h叶鞘及空白叶鞘取样提取RNA进行全基因组表达谱芯片,结果发现共有383个基因受纹枯病菌诱导表达且表达量变化倍率超过2倍；对已知功能的基因进行功能分类,发现共涉及生理进程,新陈代谢,细胞组分以及生物调节等21类,其中植物生理进程相关基因最多,达27个；5.结合F2群体QTLs定位及芯片表达谱实验结果,发现在第11染色体RM5389-RM202标记区间有9个差异表达基因(变化倍率≥2.0倍),对这批基因的表达量进行定量PCR分析,发现有5个基因受病菌诱导表达趋势与芯片结果吻合,其中2个基因受病菌诱导上调表达,3个基因下降表达；6.以RSB03材料的cDNA为模板克隆了定位于第11染色体RM5389-RM202区间的2个抗病候选基因Cg3和Cg8,这两个基因的表达量在接种病菌后分别表现为上调和下降,分别对这两个基因构建了超表达载体并转化水稻品种日本晴(Nipponbare),获得了单拷贝后代植株；7.基因Cg3开放阅读框(ORF)长度为930bp,与日本晴序列相比仅有2处碱基差异,但并未导致氨基酸水平上的不同,其编码的蛋白包含3个线粒体转运蛋白结构域,为一种跨膜类蛋白；转基因后代材料中Cg3基因的表达量显着上升,T1代株系与对照(Nipponbare)相比表现了良好的抗病性,其DG平均值为5.1～5.5,LL平均为14.0～21.3cm,而对照材料DG和LL分别为6.5和29.9cm,转基因株系与对照之间的差异达到极显着水平(P<0.01)；2010年在上海对转基因T2代材料人工接种,其发病较轻微,平均病级为4.0,低于对照材料的病级4.3,然而转基因材料与对照之间的差异不显着,鉴于当年异常的气候条件,真实病情有待进一步确定；8.基因Cg8的完整ORF全长为825bp,其编码的蛋白与日本晴相比有32个氨基酸(AA)的差异,其蛋白具有前端信号肽、跨膜区及亮氨酸重复等结构域,同样归为一类跨膜类蛋白；定量PCR结果表明转基因后代材料中该基因的表达量显着升高,对T1代进行接种鉴定发现除了转基因材料的株高显着高于对照外,其他几个抗病相关的性状上两者并没有显着差异,对T2进一步鉴定,同样发现转基因后代与对照并无显着差异,转基因后代的抗病性并没有提高。
史利玉[5]2007年在《玉米抗粗缩病及灰斑病基因的初步定位》文中指出玉米是世界上重要的粮食、饲料及工业原料作物。玉米粗缩病和灰斑病是影响产量高低的重要因素，培育和种植抗病品种是防治病害的经济有效途径，而抗病育种的成效取决于对抗源和抗病遗传规律的认识。本论文拟开展抗玉米粗缩病及灰斑病基因定位研究，为抗病育种技术创新及种质改良提供理论依据。主要研究结果如下：(一)以黄早4×掖107组合衍生的179个F8代株系为供试群体，在玉米粗缩病的重病区(山西临汾与河北保定)两年种植，获得叁个环境下的田间统计数据(05临汾、06年临汾及06年保定)；并应用此群体构建了相应的玉米分子图谱，包括74个SSR分子标记，覆盖10条玉米染色体；运行WinQTLCart2.5软件进行QTL定位。采用叁种病情指标，病株率(BZL)、病指(BZ)、校正病指(JZBZ)，综合叁个环境共检测出4个抗病QTL位点，分别位于第1、2、5、9染色体上，可解释的表型变异率介于4.9％～43.5％。其中，第1、2、5染色体上的等位基因来自黄早4；第9染色体上的等位基因来自掖107。对叁个环境的病情指标进行联合QTL分析，共检测到2个抗病QTL，位于第1染色体和第5染色体上。(二)采用生物信息学手段，收集已定位的57个玉米抗灰斑病QTL，构建用于抗病QTL定位和分子标记发掘的整合图谱，确定出7个一致性QTL。分别位于染色体1.06(1个)、2.06(1个)、3.04(1个)、4.06(1个)、4.08(1个)、5.03(1个)与8.06(1个)区域，图距分别为552.53cM、425.72cM、279.2cM、368.97cM、583.21cM、308.68cM和446.14cM。从Gramene网站收集95个水稻和33个玉米抗性相关基因序列，基于水稻和玉米基因组间同源片断的共线性关系，构建了抗性基因整合图谱。通过拟合玉米抗灰斑病QTL和抗性基因整合图谱，在染色体2.06、3.04和8.06叁个热点抗病QTL区间内，分别确定2个(Rgene-32、ht1)、4个(Rgene-5、rp3、scmv2及wsm2)和4个(ht2、Rgene-6、Rgene-8和Rgene-7)位置候选基因，为精细定位和克隆抗病基因创造了条件。
陈利娜[6]2012年在《水稻抗白叶枯病主效QTL的定位与候选基因的筛选》文中进行了进一步梳理水稻是重要的粮食作物,由黄单胞杆菌水稻变种引起的白叶枯病是一种严重的水稻病害。采用化学方法防治该病污染环境且效果不佳；利用抗病基因培育抗病新品种是防御该病的一种经济有效的途径。疣粒野生稻(Oryza meyeriana)高抗水稻白叶枯病,其抗病基因在水稻新品种的培育中具有广阔的应用前景。然而由于疣粒野生稻和栽培稻杂交不亲和,其抗病基因的克隆工作一直进展缓慢。在以前的工作中,我们利用不对称体细胞杂交的方法将疣粒野生稻高抗白叶枯病特性导入到了栽培稻中,获得了以栽培稻为传背景的高抗白叶枯病的水稻新种质Y73,并对Y73进行了抗病数量性状位点(quantitative trait loci,QTLs)的定位,从中鉴定到位于第5号染色体上的一个QTL对Y73抗性的贡献率最大(约37%),初步命名该QTL为qR5(QTL for Resistance on chromosome5)。本研究在前面工作的基础上,对抗白叶枯病主效QTL qR5进行了精细定位和候选基因的筛选,取得的主要结果如下：1、基于前期抗性QTL分析,qR5被初步定位在第5号染色体上的分子标记R05D87和RM6360之间。利用来自水稻12条染色体上的分子标记,分析Y73/IR24高代回交群体BC4F2,获得了遗传背景纯化为感病亲本IR24的具有单个抗性位点的单染色体片段替换系(chromosome segment substitution lines, CSSLs)单株2CK6-5。2、以2CK6-5和感病品种IR24为亲本构建定位分离群体,对qR5进行了精细定位,最终将qR5定位于分子标记RM3476和RM18910之间。依据水稻基因组数据库网站(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/, RAP-DB),两个分子标记之间的物理距离约为220kb。3、利用Solexa技术对Y73进行了全基因组重测序分析,在定位区间内获得了38个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)突变位点和38个插入／缺失(Insert/Deletion, InDel)突变位点。基于水稻基因组数据库网站(http://rapdb.dna.affrc.go.jp和http://rice.plantbiology.msu.edu/),对获得的76个突变位点进行基因注释,共得到24个相关基因。4、对重测序所预测的突变进行序列克隆和测序验证,结果显示叁个相关基因(Os05g0481500、Os05g0490300-01和Os05g0485000)的突变真实存在,推测叁个基因中可能存在qR5的候选基因。本研究的结果为qR5候选基因的克隆、抗性机理的研究以及该基因在分子标记辅助育种中的应用提供了重要的基础。
孙利军[7]2012年在《水稻ONAC家族基因重迭表达特性及其在抗病抗逆中的功能研究》文中研究指明植物在生长发育的过程中,经常会受到干旱、高盐、低温、病原菌等各种非生物和生物胁迫的影响。这些胁迫通常会造成植物细胞的损伤,进而严重影响植物的生长发育和作物产量。在长期的进化过程中,植物形成了一系列生理、生化、代谢及防御机制,以适应和抵御各种生物和非生物逆境。在众多的适应和抗逆机制中,基因表达的转录调控在植物适应环境和抵御逆境胁迫中起重要作用。NAC (NAM/ATAF/CUC)家族基因是植物特有的一类转录因子,存在于多种植物中,其共同特点是在N端含有一段高度保守、约由150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。研究表明,NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控、而且在植物抗病抗逆反应中具有重要的调控作用。本研究系统分析了ONAC家族基因对生物与非生物胁迫的响应、并分离克隆21个抗病抗逆相关的(?)NAC基因。在此基础上,研究了这21个ONAC基因在抗病信号分子处理、水稻-稻瘟菌和水稻-白叶枯病菌互作中的表达模式,以及初步分析了部分基因的生化特性和在抗病抗逆中的功能,旨在发现潜在的抗病抗逆胁迫相关的基因,为基因工程提高水稻抗病抗逆性能提供理论基础。本研究的主要内容及结果如下：本研究利用水稻基因芯片公共数据库[Rice Oligonucleotide Array Database (ROAD)(http://www.ricearray.org/)],对多种生物[稻瘟病(Magnaporthe grisea)、寄生植物独脚金(Striga hermonthica)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)、水稻白叶枯病((?)(anthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)]与非生物(高盐、干旱、低温)胁迫下ONAC家族基因的响应进行分析,并选择30个ONAC基因对部分胁迫因子下的响应进行验证,结果发现该家族基因有63个ONAC基因对多种胁迫因子有重迭表达的特性,在这些重迭表达的基因中,多数基因在高盐、干旱、低温、稻瘟病、寄生植物独脚金、水稻条纹病毒诱导上调表达。对于非生物胁迫,38个ONAC基因重迭表达于任意两种胁迫条件,且选择的30个ONAC基因中有16个受脱落酸(Abscisic acid、ABA)诱导表达；而对于生物胁迫,有65个基因重迭表达于任意两种生物肋迫因子。系统进化树分析表明这些重迭表达的基因分布于ONAC家族的10个亚组[OsNAC7(SND)、ONAC11(NAC1)、 SNACⅠ、SNACⅡ (NAM/CUC3)、SNACⅢ(TIP)、SNACⅣ (ANAC34)、ONAC079(ONAC6、ONAC012(ONAC7)、ONAC135(0NAC3)和ONAC100(ONAC2)],同源搜索发现在该家族有16组基因高度同源。ONAC基因对多种胁迫因子的重迭表达特性及其基因间的高度同源性,预示着ONAC基因的功能多效性和相似性。选择克隆了21个水稻抗病抗逆相关候选ONAC基因,研究了这些ONAC基因在抗病信号分子处理、水稻-稻瘟菌以及水稻-白叶枯病菌互作中的表达模式。结果表明分离获得的21个抗病抗逆相关ONAC基因中,除了ONAC058和(ONAC066,多数ONAC基因的表达能被水杨酸(Salicylic acid, SA)、茉莉酸(Jasmonic acid, JA)、 ACC (Ethylene, ET)多个抗病信号分子所诱导,但表达模式在不同抗病信号分子处理后不尽相同,相对于SA,多数ONAC基因对ACC (ET)或JA的响应程度较强。其中,12个ONAC基因(OsNAC8、ONAC016、ONAC022、ONAC023、ONAC049、 ONAC054、ONAC061、ONAC063、ONAC075、ONAC095、ONAC122和(ONAC131)的表达可以被ACC (ET)强烈诱导,6个ONAC基因(SNAC1、OsNAC4、OsNAC5、 OsNAC6、ONAC103和ONAC121)表达受JA强烈诱导,这些结果表明这18个抗病抗逆相关ONAC基因是通过JA/ET信号途径或通过JA/ET与SA信号途径参与水稻的抗病反应。在水稻-稻瘟菌、水稻-白叶枯病菌互作模式下,11个ONAC (ONAC022、ONAC023、ONAC049、ONAC054、ONAC061、ONAC075、ONAC095、 ONAC103、ONAC121、ONAC122和ONAC131)基因在水稻-稻瘟病菌、水稻-白叶枯病菌的非亲和性互作中特异性地诱导表达,因而可能与水稻抗稻瘟病、水稻白叶枯病反应的激活有关。此外,3个ONAC基因(OsNAC6、OsNAC8、ONAC063)在水稻-稻瘟病菌的非亲和性互作中特异性地诱导表达,而在水稻-白叶枯病菌的非亲和性互作中表达下调,这3个基因可能与抗水稻稻瘟病激活有关,且与抗水稻白叶枯病的抑制有关。4个ONAC基因(OsNAC3、OsNAC4、ONAC016和ONAC058)在水稻-白叶枯病菌非亲和性互作中上调表达,可能参与水稻对白叶枯抗病的激活有关。选择研究5个ONAC基因(ONAC023、ONAC063、ONAC095、ONAc122、 ONAC131)的亚细胞定位和转录活性,发现这5个基因编码的蛋白都能定位于细胞核,且都具有转录激活活性。采用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)初步对一些分离的ONAC基因的抗病功能进行初步的研究。结果发现当5个ONAC基因(ONAC023、ONAC095、ONAC122、 ONAC131(?)口(OsNAC6)分别沉默后,水稻抗稻瘟病害表现出感病性的增加,且一些抗病相关的基因(Oseds1、OsPAD4、OsLOX、OsPR3、OsPR1a、OsWRKY45、OsJamyb和(?)OsNH1/NPR1)也不同程度的表达下调,表明这5个ONAC基因通过直接或间接调控这些抗病相关的基因参与水稻对稻瘟病抗性。另外,ONAC023和ONAC095两个基因沉默后,对白叶枯病的抗病性下降,表明这两个基因可能在白叶枯抗病中具有正向调控的作用。为了深入的探讨ONAC基因在抗病抗逆反应中的功能,构建了多数克隆的ONAC基因的超表达载体和SRDX载体,并导入水稻秀水11品种中。目前已经获得一些基因的超表达转基因株系或SRDX转基因株系,正在通过分子生物学方法对转基因株系进行鉴定,其中ONAC075-oe、OsNAC6-oe转基因株系的T0代种子已获得,并对其在抗病抗逆中的功能进行初步分析。结果表明过量表达OsNAC6和ONAC075的水稻转基因株系,对稻瘟病抗性和干旱胁迫的耐受性增加,而这2个基因参与植物抗病、抗逆的机制还需进一步的研究。
邓汉卿[8]2011年在《水稻CCCH型锌指核酸结合蛋白基因C3H12的分离克隆和功能鉴定》文中提出水稻是人类重要的粮食作物。白叶枯病是造成水稻减产的主要病害之一,每年都造成巨大的经济损失,研究和发掘水稻自身携带的抗病相关基因可为培育优良的抗性品种提供新的路径,同时也可推动水稻抗病机理研究的不断发展。含有保守的叁个半胱氨酸(Cysteine, Cys或C)和一个组氨酸(Histidine,His或H)结构域的锌指蛋白被称为CCCH型锌指蛋白。研究发现在水稻中这类蛋白是一个大的家族,含有至少67个成员,但是它们的功能却鲜为人知。本研究运用植物分子生物学和生物化学领域的前沿技术,揭示了水稻中一个含有5个典型的CX8-CX5-CX3-H(X代表任意氨基酸残基)保守结构域的CCCH型锌指蛋白家族成员C3H12在抗白叶枯病反应过程中发挥作用。利用数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)分析确证了C3H12与一个微效抗白叶枯病QTL相对应,并且在定位群体中随机挑选的单株里发现C3H12的表达量与植株抗病性的改变呈正相关。通过农杆菌介导的的遗传转化在高感白叶枯的粳稻品种牡丹江8超量表达C3H12,在中感白叶枯的粳稻品种中花11中利用T-DNA插入和在中抗白叶枯的籼稻品种明恢63中利用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)抑制C3H12的表达。通过定量PCR检测证明了在转基因植株中抗性的改变与C3H12的表达量呈共分离的关系。C3H12超表达的植株对白叶枯病的抗性相对于野生型有着显着的提高,并且在C3H12超表达的植株接种白叶枯病菌后,茉莉酸路径相关基因LOX、AOS2、Cht1、PR5和PR10的表达以及茉莉酸的含量与野生型对照相比均有显着提高。与之相反,在C3H12抑制表达的植株对白叶枯病的抗性相对于野生型有着明显的下降,并且在C3H12抑制表达的植株接种白叶枯病菌后,茉莉酸路径相关基因的表达以及茉莉酸的含量与野生型对照相比均有显着降低。据此我们推断C3H12可能通过茉莉酸信号路径正调控水稻对白叶枯病的抗性。通过亚细胞定位实验发现C3H12蛋白定位在细胞核里,而且在体外表达并纯化了带有麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签的C3H12蛋白,体外核酸结合实验发现C3H12具有核酸结合能力,而在酵母中的反式激活实验里发现C3H12并没有转录激活的活性。据此我们推断,C3H12蛋白可能是通过与mRNA结合的方式在转录后水平调控基因的表达。综上所述,C3H12作为一个具有核酸结合能力的蛋白,通过茉莉酸路径正调控水稻对白叶枯病的抗性。
储昭晖[9]2005年在《水稻白叶枯病隐性抗病基因xa13的分离与鉴定》文中研究表明植物抗病基因的研究一直以来是植物分子生物学研究领域的热点之一，迄今已经从不同的宿主中分离了50多个抗病基因，其中仅有6个是隐性基因，这些隐性抗病基因的作用机理目前尚不能用广为接受的显性基因的作用机理来进行解释。水稻中已经鉴定32个主效抗白叶枯病基因，其中9个为隐性抗病基因。位于第8染色体长臂末端的xa13基因就是其中的一个典型，它完全隐性抗性、特异性的抗白叶枯病菌菲律宾菌系生理小种6(PXO99)、和其它显性或隐性抗白叶枯病基因存在抗性互作，说明xa13基因抗病机理的特异性。 为克隆xa13基因，采用基因组饱和杂交的原理，在9个发育时期取材构建了水稻品种明恢63全生育期均一化cDNA文库。以分子标记E6a和另一端标记S14003为起始，构建了xa13基因区段的物理图谱，并结合3个F_2群体和Shotgun测序结果将该基因定位于一个9.2kb的DNA片段上。同时通过精细物理定位xa13基因，开发了数个与该基因紧密连锁的基于PCR技术的分子标记，为采用分子标记辅助选择xa13育种提供了经济、方便的分子标记。 在优化了一套适合于水稻品种IRBB13的转基因组培体系的基础上，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将携带显性候选基因的片段转入到携带隐性抗病基因的水稻品种IRBB13中，在45株转基因植株后代中，有全长基因导入的30株的表型变为感病，并且4个单拷贝转基因的T_1代家系也符合共分离检测，从而验证了候选基因是xa13基因的显性基因Xa13，标志用图位克隆法成功克隆了隐性基因xa13和显性基因Xa13。同时，通过RNA干扰(RNAi)技术，分别抑制水稻品种明恢63和中花11中显性基因Xa13的表达，以及水稻品系IRBB13中隐性基因的表达。通过接种白叶枯病菌PXO99和定量RT-PCR分析发现，明恢63和中花11中Xa13基因表达受到抑制的植株表型由感病变为抗病，IRBB13中xa13基因表达受到抑制的植株抗性进一步加强。 有趣的是，显性基因Xa13和隐性基因xa13在花药中的表达量高于在叶片中的表达量。RNAi转基因植株中Xa13或xa13的表达受到抑制会导致植株不育或半不育，组织学观察发现这些不育单株的多数花粉的发育停留在单核花粉期或二核花粉期。原位杂交的实验证明，Xa13基因在花药中表达的时期与异常花粉发生的时期非常一致，Xa13在花粉发育的早期不表达，在单核花粉期开始高水平表达。从而说明Xa13基因在花粉的发育中也起着重要的作用。 进一步通过大量实验表明，显性基因Xa13是一个受病原调控表达的基因，由显性基因Xa13突变成隐性基因xa13的关键不是编码区内的变化，而是在启动子区的一个约18bp的区间内的突变使基因表达受病原调控的能力丧失，且这种突变不影响其在花粉中的表达。XA13蛋白是一个未知具体生化功能的细胞膜蛋白，属于MtN3家族的成员之一。但其在白叶枯病菌PXO99侵染以及在花粉的发育中发挥着重要的功能，且可能介导新的抗病途径。因此，本研究通过克隆隐性基因xa13以及它的显性基因Xa13，不
陈庆河[10]2005年在《稻瘟病菌群体遗传多样性及其无毒基因的遗传分析与分子标记定位》文中研究指明由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea (Hebert) Barr.(无性态为Pyricularia grisea Sacc.)]引起的稻瘟病是水稻生产上重要的病害之一,在世界上许多水稻种植区都有发生,也是我国各稻区危害最严重的水稻病害之一。目前,利用抗病品种是控制该病最经济、最有效的措施,但是,抗病品种推广3～5年后就“丧失”抗病性,给抗病品种的选育和推广带来了很大的困难。因此,研究稻瘟病菌的群体遗传结构特征,揭示其变异规律及动态,可为抗病品种的合理布局和培育抗病品种提供理论依据。同时,通过获得与稻瘟病菌无毒基因紧密连锁的分子标记,不仅可利用该无毒基因的标记作探针,研究该无毒基因在自然群体中的分布情况,揭示病菌群体毒性组成和变异特点,且为进一步物理作图法克隆该无毒基因奠定基础。本研究对中国稻瘟病菌群体结构进行了分析,同时利用分子标记技术,定位了稻瘟病菌的3个无毒基因。 采用rep-PCR指纹技术对我国13个稻区的482个稻瘟病菌菌株的DNA指纹图谱及其部分菌株的毒性结构进行了分析,以明确中国稻瘟病菌的群体遗传结构。结果表明,中国稻瘟病菌的群体结构具有较丰富的遗传多样性,在55%的指纹相似性水平上可将381个单元型划分为11个不同的遗传系谱;CHL04、CHL05和CHL06为我国稻瘟病菌的主要谱系;且不同稻区稻瘟病菌遗传空间组成有差异,但未形成明显的空间分化;不同年份的群体也没有发生明显的演替;根据对已知抗性基因的品种的致病性反应,将121个菌株分成53种致病型,rep-PCR指纹分析的遗传系谱及单元型与致病型(生理小种)存在复杂的关系。结果还发现中国稻瘟菌群体对Toridl(Pi-z~t,Pi-sh)和Tetep(Pi-k~h+?)毒性频率较低,说明在水稻抗瘟育种中可以考虑将Pi-z~t,和Pi-k~h基因累加利用。 本研究还用4个稻瘟病菌的标准交配型菌株,对1998～2003年我国13个省(市)670个稻瘟病菌单孢分离菌株的育性和交配型进行了测定,以明确中国主要稻区稻瘟病菌的交配型分布及其育性能力。结果发现中国稻瘟病菌广泛存在MAT1-1、MAT1-2两种交配型菌株。可育菌株率为40.3%,MAT1-1和MAT1-2菌株分别占测试菌株的21.9%、18.4%。不同稻区稻瘟病菌有性世代的形成能力有很大差异。用PCR技术对我国稻瘟病菌交配型进行快速分子测定,结果发现MAT1-1和MAT1-2菌株分别占62.5%和37.5%,在绝大多数稻区同时存在两种交配型菌株。结果提示,尽管在自然界中很难发现稻瘟病菌的有性世代,有性杂交导致的稻瘟病菌的遗传变异仍然是稻瘟病菌遗传多样性的一种潜在的原因。
参考文献：
[1]. 水稻白叶枯病抗性相关基因及抗病基因类似序列的克隆[D]. 王洁. 中国农业大学. 2005
[2]. 小麦条锈病抗性相关基因的克隆[D]. 张忆萍. 南京农业大学. 2007
[3]. 水稻抗病相关基因的遗传定位和分离克隆[D]. 熊敏. 华中农业大学. 2002
[4]. 水稻抗纹枯病QTLs定位及抗病候选基因发掘[D]. 付冬. 华中农业大学. 2011
[5]. 玉米抗粗缩病及灰斑病基因的初步定位[D]. 史利玉. 四川农业大学. 2007
[6]. 水稻抗白叶枯病主效QTL的定位与候选基因的筛选[D]. 陈利娜. 浙江师范大学. 2012
[7]. 水稻ONAC家族基因重迭表达特性及其在抗病抗逆中的功能研究[D]. 孙利军. 浙江大学. 2012
[8]. 水稻CCCH型锌指核酸结合蛋白基因C3H12的分离克隆和功能鉴定[D]. 邓汉卿. 华中农业大学. 2011
[9]. 水稻白叶枯病隐性抗病基因xa13的分离与鉴定[D]. 储昭晖. 华中农业大学. 2005
[10]. 稻瘟病菌群体遗传多样性及其无毒基因的遗传分析与分子标记定位[D]. 陈庆河. 南京农业大学. 2005
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