李冰, 司勇锋, 覃扬达, 张政[1]2017年在《应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA定量分析及其临床意义》文中研究指明目的应用FQ-PCR技术测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。方法选取132例鼻咽癌患者,取其外周血样本,其中84例治疗前血样,48例治疗后血样(放疗或加化疗)。另收集60例健康血样作为正常对照。使用广州中山医科大学达安基因诊断中心提供(Cat.#DA-061)的EB病毒DNA-PCR试剂盒,测定鼻咽癌患者血浆中游离EB病毒DNA拷贝,阴性对照为空白PCR反应液,阳性对照为10~6、10~4、10~2拷贝/ul的阳性模板。结果鼻咽癌组治疗前84例样本,阳性率为67.86%,鼻咽癌组治疗后48例样本阳性率为35.42%,正常对照者30例样本阳性率仅为8.33%,鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA的阳性率显着高于对照组,差异显着(χ~2=11.497,P=0.001);鼻咽癌组治疗后与对照组血浆游离EB病毒DNA的阳性率比较,差异较显着(χ~2=6.782,P=0.018);鼻咽癌组治疗前血浆中游离EB病毒-DNA阳性率约是治疗后的2倍,差异显着(χ~2=6.271,P=0.023)。鼻咽癌组治疗前血浆游离EB病毒DNA拷贝中位数为522.0 copies/ml,治疗后中位数为0.0,对照组中位数为0.0,鼻咽癌组治疗前的血浆游离EB病毒DNA拷贝数显着高于治疗后,两者差异具有统计学意义(U=350.0,P=0.029),而且与正常对照组拷贝数比较,差异亦显着(U=274.0,P=0.001)。Ⅰ~Ⅱ期患者的血浆游离EB病毒DNA水平显着低于Ⅲ~Ⅳ期患者(U=141.0,P=0.039)。N_0+N_1期患者的血浆EB病毒DNA水平显着低于N_2+N_3期患者(U=147.0,P=0.031)。结论 FQ-PCR技术具有快速、精确和高灵敏性的特点,比其它传统检测手段更实用。血浆EB病毒DNA的定量PCR分析对鼻咽癌的筛选检查具有应用价值。
张浩然[2]2010年在《复发/转移鼻咽癌患者化疗前后血浆EB病毒DNA水平检测的临床意义》文中研究指明背景与目的近年来随着分子生物学的发展,提供了多项EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)相关的检测指标。EB病毒感染与鼻咽癌关系密切,近年来,有报道鼻咽癌患者血浆/血清中可检测到游离EBV-DNA,应用实时荧光定量PCR技术,在鼻咽癌患者外周血中可定量检测EBV-DNA水平。但血浆EBV-DNA水平检测在复发/转移性鼻咽癌患者化疗前后的临床意义尚少有研究报道。本研究定量检测鼻咽癌患者化疗前后血浆EBV-DNA水平,探讨其对于复发/转移鼻咽癌患者在疗效和预后方面的临床意义。方法收集2008年5月～2010年2月在广西医科大学附属肿瘤医院化疗2科诊治、病理诊断明确的33例鼻咽癌患者的外周血66份,此33例患者均收集到自身对照的治疗前、后双份血样。另收集11例非鼻咽癌肿瘤患者血样作为对照。对33例临床复发/转移鼻咽癌患者和11例非NPC肿瘤患者的血浆,用荧光定量PCR方法在DA7600型检测仪上定量检测血浆中EBV-DNA水平。结果1.荧光定量PCR方法可检测鼻咽癌患者血浆EBV-DNA,复发/转移鼻咽癌患者化疗前后血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA。复发/转移鼻咽癌患者化疗前血浆EBV-DNA的检出率为81.8%(27/33),中位浓度为4900copies/ml(四分位数:3075～54900 copies/ml)。复发/转移鼻咽癌患者化疗后血浆中仍可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,化疗后血浆EBV-DNA的检出率为51.5%(17/33),中位浓度为520copies/ml(四分位数:0～33695copies/ml)。在非NPC肿瘤组组患者中,仅9.1%(1/11)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为0copies/ml。NPC患者化疗前血浆EBV-DNA水平与化疗后及非NPC肿瘤患者血浆EBV-DNA水平差异有统计学意义(P均<0.05)。NPC患者化疗前血浆EBV-DNA阳性检出率与化疗后及非NPC肿瘤患者EBV-DNA阳性检出率差异有统计学意义(P均<0.01)。NPC患者化疗前血浆EBV-DNA水平及阳性率显着高于化疗后和非NPC肿瘤患者的血浆EBV-DNA水平及阳性率。NPC患者化疗后血浆EBV-DNA阳性检出率与非NPC肿瘤患者比较,差异也有显着意义(P=0.034)。2.化疗前临床获益组72.7%(16/22)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为3110copies/ml,化疗后临床获益组31.8% (7/22)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为0copies/ml,在临床获益组化疗前后EBV-DNA阳性率及浓度水平的比较差异均有统计学意义(P各为0.007和0.009)。对临床获益组亚组分析显示:化疗前临床有效组70.6% (12/17)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为3090 copies/ml,化疗后临床有效组23.5%(4/17)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为0copies/ml,在临床有效组化疗前后EBV-DNA阳性率及浓度水平的比较差异均有统计学意义(P各为0.015和0.005)。对临床获益组亚组分析显示:化疗前病情稳定组80.0%(4/5)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为5260 copies/ml,化疗后病情稳定组60.0%(3/5)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为2530copies/ml,在病情稳定组化疗前后EBV-DNA阳性率及浓度水平的比较差异均无统计学意义(P各为1.000和0.345)。化疗前肿瘤进展组100.0%(11/11)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为37800copies/ml,化疗后肿瘤进展组90.9%(10/11)的患者血浆中可检测到较高拷贝数的EBV-DNA,中位浓度为60200copies/ml,在肿瘤进展组化疗前后EBV-DNA阳性率及浓度水平的比较差异均无统计学意义(P均>0. 05)。3.对于33例复发/转移鼻咽癌患者Kaplan-Meier生存分析显示:化疗前后的血浆EBV-DNA阳性及阴性两组患者无进展生存期均值在化疗前为7.6个月及14.2个月,化疗后为6.0个月及11.9个月。复发/转移NPC患者无论在化疗前或化疗后血浆EBV-DNA表达阳性和阴性两组患者的生存时间差异均有统计学意义(P各为0.044和0.002)。生存分析结果显示复发/转移NPC患者无论在化疗前或化疗后血浆EBV-DNA表达阴性患者的生存时间高于血浆EBV-DNA表达阳性患者的生存时间。结论复发/转移性鼻咽癌患者化疗前后血浆EB病毒DNA水平变化可能对鼻咽癌疗效、预后方面是一个很有价值的观测指标,值得进一步研究。1.血浆EB病毒游离DNA水平变化可用于监测复发/转移性鼻咽癌患者的治疗效果。且多数治疗有效患者在化疗后血浆EBV-DNA水平下降至低于检测水平。2.复发/转移鼻咽癌患者化疗前后的血浆EBV-DNA水平可能是影响患者预后的因素。
袁晖[3]2002年在《鼻咽癌患者血浆游离EB病毒DNA定量分析及其临床意义》文中认为Epstein-Bart(EB)病毒感染与鼻咽癌发生之间的关系一直受到关注，事实上，几乎所有的未分化鼻咽癌组织中均能检测到EB病毒DNA，而且鼻咽癌组织中的EB病毒-DNA是呈克隆性的，即来自于单个的病毒感染细胞，提示病毒在促进恶性转化的过程中发挥了作用。EB病毒甚至能诱发裸鼠移植入胚鼻咽粘膜上皮细胞癌变。 鼻咽癌病人血清中含有高滴度的EB病毒相关抗原的抗体，除病毒壳抗原-抗体(Viral capsid antigen-immunoglobin A，VCA-IgA)外，还有多种EB病毒相关抗原的抗体，例如EB病毒的核抗原(EBNA)-抗体。VCA-IgA在我国常用作鼻咽癌的筛选检查，但是VCA-IgA滴度水平未显示与鼻咽癌分期相关，其滴度变化与临床病程和治疗效果也无关。因此，VCA-IgA可用于指示发生鼻咽癌的危险度，而不能用来监测鼻咽癌进展。 某些恶性肿瘤患者外周血存在肿瘤来源的DNA是近五年的研究发现。从此开辟了非侵入性监测肿瘤进展的新途径。Lo等首先采用荧光定量 （eorescence eAnive，FQ）－PCR技术，在 96％鼻咽癌患者血浆中测得 不同水平的EB病毒、DNA拷贝。从此，建立了实时定量测定鼻咽癌患者血 浆中肿瘤相关的EB病毒－DNA的精确系统。 本文应用下QPCR技术测定鼻咽癌患者治疗前、后血浆中游离EB病 毒－DNA拷贝，同时应用非同位素原位杂交技术检测鼻咽癌原发组织中EB 病毒编码的 RNA－l（EB hCoded RNA－l，EBERI），分析血浆中游离 EB病 毒DNA的来源，探讨血浆EB病毒DNA定量测定的临床意义。 一材料和方祛 1 实验材料 收集2（Xk年5月－2001年5月在浙江大学医学院附属二院耳鼻咽喉科 和肿瘤放疗科诊治、病理诊断明确的55例鼻咽癌患者的外周血，包括治疗 前血样 42例，治疗后（放疗或加化疗）血样 24例。其中 11例收集到自身 对照的治疗前、后双份血样。另收集30例健康助血员血样作为正常对照。 均取外周血SInl于EDTA抗凝试管，静置片刻离心，取血浆15llil，－20C 保存。上述鼻咽癌患者的石蜡包埋活检组织标本选近期16例用于原位杂交 实验。 鼻咽癌55例中，男4O例，女15例，年龄19－75岁，中位年龄530岁。 经鼻内窥镜检查和鼻咽部CT扫描，按照UICC／AJCC（1997）分期标准， I期 5例，11期 25例，ill期 10例，W期 15例。3O例腔康助血员中，男 22例，女8例，年龄34－50岁，平均430岁。 二 实验方法 血浆EB病毒．DNA定量PCR测定： 取外周血浆 15nd，4’CX 12mpm离心 10分钟，取沉淀，加 DNA 2 提取液（含OS％SDS、100Vg／ml蛋白酶 K），煮拂、冰浴各 10分钟，4C Xlpom离心5分钟，取上清液ZPI，用美国PE公司SeqUneeDetector 777行 PCR定量扩增。引物序列为 5’－TCTCTGCCTCCAGGCAAG－3’和 5’－AGAGGGCCTGTCCACCGT．3’，双标记荧光探针的序列为 5’－（FAM） CTGTCTGTAAAGTCCAACTCC－（TAMRA）－3’。扩增程序为①93℃X 2 分钟预变性；匡D3℃X45秒一55℃x 120秒，狈个循环；③33℃x3分钟 延伸。荧光检测波长为 slsnm。阳性对照为 10‘、104、102拷贝／ul的阳性 模板，阴性对照为空白PCR反应液。 非同位素原位杂交 EBER检测 约 in g合成 EBERI模板加入 DEPC灭菌蒸馏水至 16 yi，沸水浴 10 分钟后立即置人冰盒，加入 DigPrime标记液 4 nl，置入 37℃水浴 4小时， 加 02M EDTA（PH 80）4V，终止反应，20’C冰箱保存。 石蜡标本 5 u m行连续切片，每例切取 3片，分别作常规 HE染色、原 位杂交和阴性对照试验。 切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，稀酸（02N盐酸）处理15分钟， 蛋白酶K消化15分钟，加预杂交液后置于湿盒中30分钟，配制含地高辛 标记探针的杂交液，66oC变性10分钟滴加于湿盒内的切片中，42t杂交过 夜。阴性对照组则直接滴加不含探针的杂交液。 次日，切片用 2 X SSC和 IX SSC浸泡 2次后，先滴加 Bu囚盯 1稀释的 Titon－XIOO和 NSS，尔后滴加 Btlner稀释的偶联碱性蛋白酶的抗地高辛 抗体，再用Bill：I7erl和BI．－－－－－－－r ill浸泡?
袁晖, 杨蓓蓓[4]2002年在《鼻咽癌患者血浆Epstein-Barr病毒DNA定量分析》文中研究指明目的 探讨鼻咽癌患者血浆游离 EBV - DNA水平测定的临床应用价值。方法 采用荧光定量 PCR技术测定鼻咽癌患者治疗前 2 3例、治疗后 2 3例以及正常对照者 30例血浆 EBV- DNA水平 ,并用免疫酶法检测血清VCA - Ig A水平。结果 鼻咽癌患者血浆游离 EBV- DNA水平高于正常对照者 ,治疗后低于治疗前。结论 (1)血浆EBV- DNA的实时定量 PCR分析对鼻咽癌的筛选检查有实用价值 ;(2 )血浆 EBV- DNA水平可能是当前反映鼻咽癌局部肿瘤负荷和治疗效果的较理想指标。
李宇红, 邵建永, 冯惠霞, 郜红艺, 张力[5]2004年在《鼻咽癌患者血浆游离EBV/DNA的定量检测及其临床意义》文中研究指明目的:探讨血浆EBV/DNA定量分析,在鼻咽癌早期诊断、临床分期、预后判断和监测放疗后转移复发中的临床意义。方法:采用荧光定量PCR方法定量检测经病理确诊为鼻咽癌的120例初治、90例放疗后随诊患者,其中包括60例放疗后持续缓解,30例远处转移和局部复发患者的血浆EBV/DNA含量。结果:初治、远处转移和局部复发的鼻咽癌患者血浆中游离的EBV/DNA检出率分别为96.0%、95.0%和100%,显着高于治疗后持续缓解鼻咽癌患者、健康对照者和非鼻咽癌的肿瘤患者;初治鼻咽癌患者各TNM分期之间血浆EBV/DNA拷贝数有显着统计学差异,晚期患者(Ⅲ+Ⅳ)期血浆EBV/DNA中位拷贝数显着高于早期患者(Ⅰ+Ⅱ)期;初治患者治疗后已出现局部和远处转移者,治疗前血浆EBV/DNA中位数显着高于尚未出现复发转移患者;初治患者治疗前血浆EBV/DNA≥40000拷贝/ml与<40000拷贝/ml两个水平,患者22个月无复发生存率分别为46.1%和92.9%,有显着统计学差异;放疗后复发、转移鼻咽癌患者血浆EBV/DNA的中位拷贝数显着高于治疗后持续缓解患者。结论:采用荧光定量PCR方法检测鼻咽癌患者血浆中游离的EBV/DNA是一种敏感可靠的方法,对于鼻咽癌早期诊断、鉴别诊断、分期、判断预后、监测治疗后复发和远处转移具有重要的临床意义,有可能成为鼻咽癌的血清肿瘤标记物。
潘信斌[6]2012年在《血清或血浆EBV DNA诊断鼻咽癌复发或转移价值的meta分析》文中进行了进一步梳理背景：血清或血浆中游离EBV DNA水平可作为一种鼻咽癌肿瘤标记物，诊断鼻咽癌治疗后复发或转移。目的：系统评价PCR检测鼻咽癌患者血浆或血清中EBV DNA水平在鼻咽癌治疗后复发或转移的价值。方法：采用Cochrane系统评价方法,计算机检索Medline、EMBASE、中国生物医学文献数据库(CBM)、中文科技期刊全文数据库(CNKI)和中国期刊全文数据库(VIP)以及万方数据库等数据库1998年1月至2011年10月发表的EBV DNA和鼻咽癌的原始文献。采用Cochrane协作网推荐的QUADAS工具评估纳入研究的质量,使用Meta-DiSc1.4软件对纳入的研究进行定量系统评价。2名研究者独立搜索文献和提取数据,并计算出EBV DNA诊断鼻咽癌治疗后复发或转移的敏感性、特异性、阳性似然比、阴性似然比、诊断优势比和汇总的受试者工作特征(SROC)曲线。结果：本研究最终纳入符合标准的文献22篇共1709例患者，其中571例为复发或转移患者，其它1138例为临床持续缓解期患者。汇总的敏感性为0.85%(95%confidence interval [CI],82.0%-88.0%)、特异性为90.0%(95%CI88.0%-91.0%)、阳性似然比为7.11(95%CI5.88-8.59)、阴性似然比为0.15(95%CI0.10-0.24)、诊断优势比为52.00(95%CI33.36-81.06)。SROC曲线下面积为0.9451，Q值是0.8840。亚组分析显示，FQ-PCR检测方法组的敏感性和特异性分别为0.88(95%CI0.83-0.91)和0.85(95%CI0.82-0.88)。RQ-PCR检测方法组的敏感性和特异性分别为0.86(95%CI0.81-0.90)和0.94(95%CI0.91-0.96)。结论：检测血清或血浆中EBV DNA水平对诊断鼻咽癌治疗后复发或转移有较高价值。
何凤姣[7]2011年在《鼻咽癌的分子靶向治疗联合放疗的临床实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国最常见的头颈部肿瘤,爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein barr virus,EBV)感染为鼻咽癌的主要的致病因素之一,研究发现,鼻咽癌与Burkitt淋巴瘤一样,在瘤细胞中存在明确的EBV标志物(EB病毒DNA和EB病毒核抗原),在EBV相关肿瘤中EBV基因组的持续存在为肿瘤治疗提供了一个新的以病毒为靶的基因治疗策略。在鼻咽癌上皮细胞中EB病毒感染大多数是潜伏感染,EB病毒编码的潜伏膜蛋白1 (epstein-bar virus-encoded latent membrane proteinl, LMP1)被认为是致病的癌基因之一,能活化多种细胞内信号途径,使细胞发生恶性转化,并赋予肿瘤细胞更强的转化能力。脱氧核酶(DNAzyme DZ)是一种具有酶活性的DNA分子,由于具有很高的剪切活性和剪切特异性,以及化学性质的相对稳定性等多种优势,在基因治疗方面具有广泛的前景,已成为目前分子生物学及新药开发等多种领域研究的热点。鼻咽癌病理以低分化鳞癌为主,放射治疗是其最主要治疗,由于鼻咽部位置隐蔽,早期诊断,早期治疗的比例低,确诊患者70%已为中晚期,Ⅲ、Ⅳ期患者单纯放疗复发率及远处转移率均很高,5年生存率较低,近年来,放疗加化疗的综合治疗是鼻咽癌治疗研究的热点,其进展迅速,然而,鼻咽癌的总体治疗效果仍不尽人意,复发及远处转移为鼻咽癌治疗失败的主要模式。EBV与鼻咽癌的发生、发展密切相关,在患者外周血中存在着多种EBV的相关抗原、抗体,目前,常规应用的EBV血液学检查项目为VCA/IgA.它仍是鼻咽癌患者临床筛查和辅助诊断的常用方法,但尚无证据证明其是判断疗效、预后及诊断复发的可靠指标。原因主要在于该种抗体在人体内的半衰期较长,即使体内EBV清除后仍有较长时间维持在较高的浓度。鼻咽癌患者复发或远处转移的诊断主要依赖影像学检查,但影像学检查有时对诊断复发或转移不敏感。一方面,CT、MRI等作为一种局部显像检查在诊断较小的转移、放疗后肿瘤侵润与纤维化的鉴别、以及残存肿瘤性质的判断方面往往无能为力。随着核酸分子杂交及PCR技术的出现,人们运用技术在鼻咽癌组织中检测到EBV基因。有学者尝试运用PCR技术检测鼻咽癌患者血浆中游离到EBV-DNA并获得满意答案。EBV的游离DNA片段可以灵敏的反映体内肿瘤的负荷变化,并且,血EBV-DNA水平随体内肿瘤负荷变化而迅速变化,同时也说明外周血中的EBV-DNA来源于肿瘤细胞。肿瘤消失后没有EBV-DNA能很好的反映肿瘤的消长,EBV-DNA片段可以作为肿瘤是否消退的有效指标,是诊断鼻咽癌残留、复发及远处转移的敏感指标。前期工作研究表明靶向EBV-LMP 1的脱氧核酶联合放疗,明显诱导CNE 1-LMP1鼻咽癌细胞的凋亡,增强在细胞水平及NPC裸鼠移植瘤的放疗敏感性。为了进一步研究靶向LMP1的脱氧核酶增强鼻咽癌病人对放疗敏感性的临床应用,我院自2007年3月至2009年1月收治40例经鼻咽活检及鼻咽MRI诊断为鼻咽癌的患者,在常规放射治疗的同时,局部给予脱氧核酶处理,治疗后随访36月,以观察脱氧核酶的临床近期及远期疗效。本临床试验前期工作已总结了靶向EMV-LMP1的脱氧核酶能增强放疗敏感性,加快肿瘤缩小速率,较好的控制了肿瘤的消退,显着提高近期疗效。本文在前期临床试验观察靶向EBV-LMP1的脱氧核酶增强鼻咽癌放疗敏感性的近期临床疗效的基础上,追踪其远期疗效,并针对影响靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的因素进行深入分析,并通过巢式-荧光定量PCR方法检测人血清中EB病毒拷贝数,分析EBV-DNA复制与鼻咽癌相关性。研究内容一、靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的观察目的：本研究在前期临床试验观察靶向EBV-LMP 1的脱氧核酶增强鼻咽癌放疗敏感性的近期临床疗效的基础上,追踪36月局部复发率、远处无瘤生存率及总生存率等远期疗效。方法：追踪疗后18月、24月、30月、以及36月门诊随访,观察胸片、腹部B超和鼻咽MRI检查及全是骨扫描等几个指标来评价远期疗效。根据1995年SOMA (Subjective Objective Management Analytic)标准评价放疗晚期副反应。结果：本次临床试验观察点以18月为起点,直至放疗结束后36月。其远期临床疗效情况如下：治疗组和对照组3月、12月、18月、24月、30月、36月总的生存率、无远处转移生存率、无复发生存率及死亡率无明显差异,各时间点p>0.05。观察口干、龋齿、颈部纤维化、张口困难、听力减退、骨坏死、放射性脑病、颅神经损伤、第二原发肿瘤的发生等指标来评价放疗晚期损伤,两组比较P值均>0.05,在统计学上无明显差异。结论：从远期临床疗效情况来看,由于样本量较小,临床随访时间不长,EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗靶向治疗鼻咽癌未观察到改善局部复发率、远处无瘤生存率及总生存率,未增加放疗后的晚期损伤。二、靶向EBV LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的深入分析目的：针对影响40例样本预后的各种因素,本文就靶向EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗临床疗效的进行深入分析。方法：将所有入组患者的一般资料以及相关记录结果及检测结果输入SPSS13.0软件,观察起点自放疗开始日起算至36月,无失访病例,死于其他原因的按截尾处理,将治疗组与对照组的生存时间与生存率进行Life Tables生存分析。两样本率比较的卡方检验或者fisher's确切概率法,并进行影响预后的单因素分析,用Cox模型进行预后的多因素回归分析。检验水准仅取0.05,均取双侧概率。结果：1.总体而言,两组在年龄、性别、分期等方面组间比较P值均>0.05。2.多因素分析发现T分期影响40例患者预后因素的P=0.033,性别(P=0.177)、T分期(P=0.033)的偏回归系数(β)与相对危险度(RR)均大于1,治疗方式(脱氧核酶组)的β和RR均小于1(P=0.657),表明T分期为影响预后的危险因素,性别为影响预后的危险因素的趋势,脱氧核酶联合放疗为影响预后的保护因素的趋势。3.单因素分析,治疗组男性的预后好于对照组,女性好于男性,特别是治疗组的女性好于对照组；年龄<40的预后好于年龄≥40,年龄较轻的两组均无进展期病例,并且治疗组较对照组少(TTD: 7.1%/23.5%,TTP:14.3%/29.4%);从T分期、N分期还是临床分期来看,特别对于局部晚期(T3-4、NX、Ⅲ+Ⅳa)治疗组均有好于对照组趋势。但各因素在治疗组间的差异均无明显统计学意义,其P值均>0.05。结论：1.两组总体上在年龄、性别、分期等方面组间比较无显着差异。2.多因素分析T分期影响预后的独立因素,并且为影响预后的危险因素。3.从单因素分析,由于本研究因病例数较少,随访时间不够长,不足以说明年龄、性别、T、N分期、临床分期为影响预后的独立因素。叁. EBV-DNA拷贝数与鼻咽癌的相关性目的：本文通过观察治疗前、治疗期间、治疗结束、疗后3月至随访36月共14个时间点EBV-DNA拷贝数,分析EBV-DNA复制与鼻咽癌的相关性,从分子水平探讨LMP1放疗增敏的疗效。方法：40例参加临床试验的患者于治疗前、第1-6周每周1次、治疗结束、疗后3月、12月、18月、24月、30月、36月共14个时间点分别采集静脉血6-8ml,用EDTA抗凝,收集血浆,用于EBV-DNA检测。用巢式-荧光定量PCR方法检测人血浆中EB病毒拷贝数,观察原始数据将两组治疗后12月或以后的EB病毒拷贝数分为3组,第一组EB病毒拷贝数为0的为归零组,第二组EB病毒拷贝数未降为0,但也未升高的为持续存在组,第叁组EB病毒拷贝数降到一定水平又升高的为升高组。结果：1.治疗组的归零的病例数明显多于对照组(70%/15%P=0.000),持续存在组治疗组明显低于对照组(5%/40%P=0.023),这两组都明显具有统计学意义,反弹组治疗组亦低于对照组(25%/45%P=0.185)。2. EBV-DNA的拷贝数出现反弹的时间与患者出现复发转移的时间成直线相关(R2=0.430,P=0.015)。临床或者影像学资料显示复发转移明显滞后于EBV-DNA复制时间,中位时间前者为13月,后者的为2月。3.在治疗第5周及治疗后36月,时间因素、两种治疗方法、以及二者的交互关系,对EBV-DNA拷贝数的差异性的影响,P值均小于0.05；观察治疗第5周、治疗结束、疗后3月及疗后12月几个时间点后发现,时间因素和二者的交互作用均有统计学意义,说明EBV-DNA拷贝数在不同时间点存在差别。结论：1.EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗非常有效的控制了EBV-DNA的复制,从分子水平证明了靶向EBV-LMPl脱氧核酶具有较好的增敏作用。2. EBV-DNA的拷贝数出现反弹的时间与患者出现复发转移到时间的关系成直线相关,临床或者影像学资料显示复发转移明显滞后于EBV-DNA复制时间,也证明了EBV-DNA是判断鼻咽癌疗效,预测复发转移的敏感指标。3.在治疗至随访期间不同的时间点EBV-DNA的拷贝数是逐渐下降的,并且治疗组下降更加显着,再次证明了EBV-LMP1脱氧核酶联合放疗非常有效的控制了EBV-DNA的复制。
杨德辉, 柳青[8]2006年在《鼻咽癌患者血浆游离EBVDNA检测的研究现状》文中研究指明EB病毒与鼻咽癌发生发展密切相关,在患者外周血中存在多种EB病毒的相关抗原抗体,在检测鼻咽癌以及早期筛查方面都采用EB病毒相关的血液学指标,但传统的指标如VCA/IgA、EA/IgA等落后于体内EB病毒的变化,需要发展更好的指标来检测和监测NPC肿瘤的变化。本篇文章概括说明近年来EB病毒DNA研究上的进展
付新洒[9]2015年在《鼻咽癌患者外周血浆及循环肿瘤细胞中hTERT mRNA的定量检测及其临床意义》文中研究说明研究背景：鼻咽癌是我国南方高发的一种恶性肿瘤,特别是在广东地区。目前鼻咽癌确切的发病原因尚未研究清楚,大量的研究结果显示遗传因素、EB病毒感染、环境因素及饮食因素等与其密切相关。鼻咽癌多发于男性,高发于40-50岁患者。随着影像水平的迅猛发展和放射治疗水平的不断提高,鼻咽癌早期患者5年生存率高达70%以上。但是大部分鼻咽癌早期发病无明显的特异性,也缺乏有效的早期诊断指标,大部分就诊时已发展至晚期,大多伴有颈部淋巴结的转移甚至远处转移。这无疑大大降低了鼻咽癌的临床治愈率,生存率及生存质量也急剧降低。EB病毒已研究证实与鼻咽癌的发生息息相关,各种针对EB病毒的特异性抗原和抗体的检测是目前临床早期诊断和筛查鼻咽癌的主要手段,常用的VCA-IgA及EA-IgA检测,但灵敏度和特异性都不高,这不仅可能使早期肿瘤漏网,也给非肿瘤患者增加精神负担。关于鼻咽癌的早期诊断指标的探寻和确定,是相关研究者的重要任务。随着分子生物学的迅猛发展,肿瘤相关分子标记物的检测给肿瘤的早期诊断、疗效评估及预后随访开启了新的篇章。肿瘤患者外周循环游离核酸分子的检测是医学工作者关注的热点。在正常人和肿瘤患者的外周血液中均存在各种各样的游离核酸,与肿瘤相关的的特异性核酸的检测对于肿瘤患者的诊断和治疗有着重要的价值。端粒是近年来生命科学研究的热点,端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生发展密切相关。端粒酶是-种自身携带模板的逆转录酶,它在细胞中负责延长端粒,而端粒长度是决定细胞增殖能力和寿命的分子标志。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的亚单位,能以端粒自身所携带的RNA为模板合成端粒DNA,并加到染色体末端以延长端粒维持染色体的稳定进而延长细胞的寿命甚至可促使细胞永生化。hTERT只能在具有端粒酶活性的细胞中检测到,包括胚胎干细胞、生殖细胞、活化的淋巴细胞及绝大多数肿瘤细胞,其表达水平与端粒酶的活性呈正相关。已有大量研究证实,端粒酶及其亚单位在鼻咽癌及绝大多数恶性肿瘤中高表达,而在正常人体细胞中为阴性表达。近期人们在血浆端粒酶hTERT mRNA方面做了许多的工作,血浆hTERT mRNA有望成为肿瘤早期诊断、疗效评估和预后判断的一个新的分子生物学指标。循环肿瘤细胞近年来日益成为研究的热点。关于循环肿瘤细胞的大量报道已证实,循环肿瘤细胞和肿瘤的诊断及复发转移相关,同时实时监测疗程中肿瘤循环肿瘤细胞的变化,有助于及时评价治疗效果,随时调整治疗方案。因此,深入了解循环肿瘤细胞对于肿瘤的诊断、治疗及预后均具有重要的意义。国内外已有大量研究报道以肿瘤特异性分子标记物为载体,用实时定量PCR方法检测研究肿瘤患者外周血微量肿瘤细胞,已经应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等微转移的研究。综上：外周循环肿瘤细胞及血浆中肿瘤特异性RNA在肿瘤研究中均具有重要的价值。联合检测外周血肿瘤细胞及游离RNA用于肿瘤的诊断及治疗目前也尚未有报道。我们将用前瞻性的研究方法,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Q-PCR)检测鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞及外周游离血浆中hTERT mRNA的表达水平,来了解其在鼻咽癌诊断及治疗中的临床应用价值。目的：利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Q-PCR)技术定量检测鼻咽癌患者外周血浆及循环肿瘤细胞中人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT) mRNA的表达,研究其其表达与患者的性别、年龄及肿瘤瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素的关系,并探讨其在鼻咽癌中的诊断及治疗中意义,并将两者进行相关性分析,进一步探讨血浆中hTERT mRNA的来源。方法：1血浆中hTERT mRNA:33例鼻咽癌患者均来自南方医科大学珠江医院耳鼻喉科,治疗前所有患者按常规进行胸部正侧位片、腹部B超、头颈部增强CT、 MRI、全身骨扫描(SPECT)确定肿瘤的侵犯的范围和临床分期。入组标准：既往未接受过放射治疗者；无远处转移；疗程中断不超过5天；患者签署化疗及放疗同意书；病理为鼻咽低分化鳞癌；不伴有第二原发癌；年龄<75岁；卡氏评分>70。排除标准：放疗后复发再治疗；未完成治疗者；合并其他内科严重疾患(脑中风、糖尿病、高血压、心脏病等)；病理为非低分化鳞癌存在系统性疾病；发生远处转移；妊娠或哺乳期妇女；严重骨髓功能障碍者,任何其他状况为放化疗禁忌症者。按鼻咽癌2008临床分期标准进行系统分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均为M0,病理学检测全部为未分化型鳞状细胞癌。33例患者年龄跨度为23-70岁,中位年龄为49岁,其中男16例,女17例。放疗方案：所有患者均于诱导化疗结束后5-15天内接受放射治疗。放射源使用直线加速器6MVX线。调强放疗组肿瘤区(GTV)处方量为68-72Gy,每次分割量为2.2-2.4Gy,每周照射5次。化疗方案：所有患者诱导化疗方案为铂类(顺铂/泉铂)+5-FU,剂量为:DDP60-100mg/m2d1+5-FU 500-1000mg/m2d2-5,部分患者在此基础上加上艾素/环磷酰胺,艾素的剂量为60-75mg/m2d1。同步化疗使用顺铂3周一次的化疗方案(顺铂50-80mg/m2)或顺铂每周一次的化疗方案(20-40mg/m2)。其中Ⅰ、Ⅱ期患者直接行放疗,Ⅲ、Ⅳ期行两个疗程诱导化疗后再行放疗。治疗前、诱导化疗后及放疗后分别于上午6时到9时之间采集外周血2mL, EDTA抗凝,2h内2000rpm,离心10 min,分离血浆并保存于-80℃冰箱备用。24名健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,为慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、声带息肉等常见病患者,本组征得南方医科大学珠江医院伦理委员会批准,并且经患者签署知情同意书。标本处理同前。采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后血浆中hTERT mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以24例健康志愿者作为对照。2.外周循环肿瘤细胞中hTERT mRNA:入组患者为2013年9月至2014年6月南方医科大学珠江医院耳鼻喉科收治的鼻咽癌患者33例,同第一章中的纳入及排除标准,实验对象的33例患者同第一章。实验组患者取两管血液,第一管如第一章中的处理方法,收集血浆备用,第二管如下叙述,收集外周血单个核细胞,备用。患者均经病理学确诊为低分化型鳞状细胞癌且既往未经任何治疗。按鼻咽癌2008临床分期标准进行系统分期,其中4例Ⅰ期,5例Ⅱ期,17例Ⅲ期,7例Ⅳ期；11例T1,6例T2,13例T3,3例T4,4例NO；5例N1,17例N2,7例N3；所有病例均为M0,病理学检测全部为未分化型鳞状细胞癌。33例患者年龄跨度为23-70岁,中位年龄为49岁,其中男16例,女17例。同时,收集健康志愿者外周血标本20例,健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,为慢性鼻窦炎、慢性中耳炎、声带息肉等常见病患者,本组征得南方医科大学珠江医院伦理委员会批准,并且经患者签署知情同意书。本研究通过了南方医科大学珠江医院医学伦理协会审核,病理标本的采集和检测实验均经患者知情同意。鼻咽患者治疗前后分别于上午6时到9时之间于外周静脉采血,采血时第1管血弃之不用,取第2管血2mL置入真空无菌肝素抗凝的试管。2小时内加入淋巴细胞分离液2500r/min离心20min后收集界面细胞,得到单个核细胞层(肿瘤细胞在此层),最后用PBS缓冲液洗涤一次,-80℃保存。20名健康对照来自珠江医院耳鼻喉科住院患者,标本处理同前。采用实时荧光定量PCR技术(QPCR)检测33例鼻咽癌患者治疗(放疗或化疗)前后循环肿瘤细胞中hTERT mRNA的表达,并分析其与临床病理因素的关联,以20例健康志愿者作为对照。结果：1.血浆中hTERT mRNA的实验结果显示,健康志愿者血浆中hTERT mRNA相对表达量为0.95±0.37,鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA含量达到10.75±4.29(P<0.05)。鼻咽癌患者血浆中hTERT mRNA的表达与年龄、性别无统计学差异(P>0.05),而与临床分期、T分期及N分期浸润范围有显着性差异(P<0.05)。早期患者(Ⅰ、Ⅱ期),放疗后其表达量(3.43±1.42)较治疗前(5.60±2.33)明显下降；晚期患者(Ⅲ、Ⅳ期)诱导化疗及放疗后其表达量较治疗前(12.68±3.08)分别降为10.68±2.48、3.13±1.69(P<0.05)。2.鼻咽癌外周循环肿瘤细胞的实验结果显示健康志愿者中hTERT mRNA相对表达量为分别为1.09±0.40,鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA含量分别达到10.65±4.28(P<0.05)。鼻咽癌患者外周血hTERT mRNA的表达与临床分期、肿瘤侵犯范围、淋巴转移及远处转移有显着性差异(P<0.05)。治疗后hTERT mRNA的表达量由10.65±4.28降低至5.59±2.32。3.血浆hTERT mRNA相对含量与外周血循环肿瘤细胞中hTERT mRNA相对含量之间具有相关性,两者之间的相关系数为0.981,高度相关。结论：鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达明显升高,放化疗能够有效抑制该基因的表达,而且该基因的含量与肿瘤的临床分期、大小及淋巴结浸润范围等临床病理因素密切相关。鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达明显升高从而提示检测鼻咽癌患者外周血中hTERT mRNA的含量,有可能为鼻咽癌患者早期诊断及治疗预后提供重要信息。鼻咽癌患者血浆和外周循环细胞中hTERT mRNA的表达也高度相关,可以部分解释血浆中hTERT mRNA的来源。
周鑫[10]2013年在《鼻咽癌患者血浆游离EBV DNA定量检测及其临床意义》文中研究表明鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)发病率在西方国家约1/10万人年,但在我国、东南亚及地中海等地区却具有显着的地方性,尤其在我国华南其发病率高达25/10万人年,发病率和死亡率均居于头颈部恶性肿瘤之首。由于该肿瘤发病的隐匿性,早期症状不明显,许多患者就诊时已是中晚期,因此,发展敏感度和特异度兼具的筛查和早期诊断手段十分重要。近年来,随着影像学、放射治疗技术的进步和多学科综合治疗的发展,鼻咽癌的局控率和远期生存预后均有了大幅提高,早期肿瘤的5年生存率达90%以上。然而在晚期肿瘤中,伴随局控率的提高,远处转移却仍旧没有明显改善,寻求更有效的治疗手段及治疗方案的个体化势在必行。在流行地区鼻咽癌的病因和发病学中,EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)具有特殊地位,其相关的血清学指标如VCAIgA, EAIgA等被广泛用于临床诊断与筛查,但其不能及时反映体内肿瘤情况,即便在肿瘤完全缓解后,其滴度仍相当高。相较之下,荧光实时定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)测定的血浆游离EBV DNA(Cell-free plasma EBV DNA,cfEBVDNA)被视作更具价值的肿瘤相关生物标志物,在鼻咽癌诊断与评估、长期生存预后方面具有积极意义。然而,目前相关数据来自多个研究中心,其检测方法不统一,定量结果差别极大,因此尚无法整合得到统一的量化指标;另一方面,其产生和入血的机制和环节尚不明确,如何与临床诊治有机结合,仍有待进一步证据支持。基于以上背景,本实验分为基础和临床两大部分,旨在探讨血浆游离EBVDNA定量方法的优化,治疗前浓度的主要影响因素及其可能入血机制,与远处转移的可能关系,以及将其应用于治疗近期疗效评估的合理性与可行性。首先在小样本血浆样品中,分别应用含目的片段的重组标准品质粒DNA和Namalwa人淋巴瘤细胞基因组DNA(目前最主流的两种定量参照)作为绝对定量标准品,通过平行测定对比及反复复测,评价两种定量方法的优劣,并择优进行后续大样本临床检测。此后,通过对比治疗前不同浓度血浆游离EBV DNA及其临床和影像学上的浸润和转移特征,通过多元线性模型寻找影响该指标的最显着因素,建立线性模型进行预测和归纳,进而探讨在肿瘤发生发展中,影响EBVDNA入血的关键环节。最后,观察分析放化疗前后血浆游离EBV DNA的变化情况,并和反映肿瘤负荷变化的影像学缓解评估手段进行对比,讨论其是否能够用于肿瘤早期缓解评估。为此,研究先行对比了叁维肿瘤大体体积(Gross tumor volume, GTV)金标准下,一维和二维径线测定法反映鼻咽癌肿瘤负荷的能力,并从WHO标准和实体瘤疗效评价标准(Response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)中择优作为最佳影像学评估手段。实验发现：1.相对标准品质粒DNA, Namalwa DNA标准品的浓度范围更加合理,能覆盖几乎全部待测样本,不会过高测定,并且其复测稳定性更高,因此更适合用作血浆游离EBV DNA的绝对定量。2.治疗前血浆游离EBV DNA的浓度和临床T、N分期,原发肿瘤侵犯范围和淋巴结转移特性等均相相关,但各因素间存在重迭。经多元线性模型筛选后,发现淋巴结体积为最显着的影响因素,其他因素包括颅底胃质受累,下颈部(含锁骨上)淋巴结转移等。叁者分别可导致血浆游离EBV DNA升高至原先5,4.2和6.7倍3.在不同的治疗模式下,多数患者血浆游离EBV DNA随肿瘤退缩发生明显下降。而个别患者中,治疗结束时高载量EBV DNA预示肿瘤未控和治疗后进展。在反映肿瘤实际负荷上,WHO二维径线测定法优于RECIST1.1一维法。。将其作为近期疗效的影像学评估手段,与血浆游离EBV DNA变化进行对比后发现,后者在反映肿瘤缓解上更为敏感,且其持续阳性提示肿瘤残留,尤其是淋巴结残留。综上,本实验得出以下结论：Namalwa细胞基因组DNA较质粒DNA更适于作为鼻咽癌血浆游离EBV DNA定量的标准品；大体积的转移淋巴结,颅底骨质受累,以及下颈部及锁骨上淋巴结转移等致使肿瘤凋亡增加和入血风险增高,从而影响治疗前血浆游离EBV DNA浓度；治疗后血浆游离EBV DNA浓度变化有望作为新的辅助标准,应用于抗肿瘤治疗近期疗效的评估。
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