陈哲明[1]2006年在《Brugada综合征分子遗传学及细胞电生理机制的研究》文中指出背景及目的： 自1992年首次被报道后，Brugada综合征已得到医学界的普遍认同，根据2002年及2003年两次欧洲心律失常工作组会议达成的共识，Brugada综合征被定义为一种“疾病”。本病属常染色体显性遗传病，好发于东南亚、日本等国家地区，而在美国、北欧发病率相对较低，临床特征主要包括：多以心因性猝死或频发晕厥为首发症状，发病时心电图记录到极短配对间期室性期前收缩、多形性室性心动过速、心室颤动，但常规的临床检查，包括体格检查，影像学、超声学、冠状动脉造影等均无心脏器质性病变的证据；静息常规12导联心电图有特征性改变：右心前区V_1～V_3导联J点抬高≥2mm(0.2mV)而形成明显的J波，继而ST段呈斗篷状或鞍形抬高，T波可继发倒置，QT间期一般正常，这种特征性心电图表现也被称作“Brugada心电图征”，并且根据J-ST-T的不同形态可区分为3型(1，2，3型)；J-ST可呈动态变化，3型之间可互相转变，甚至一过性正常，但在I_C类抗心律失常药物(如氟卡尼等)的作用下，可被重新暴露
陈哲明[2]2003年在《Brugada综合征分子遗传学研究》文中研究指明背景：心脏电压门控钠离子通道蛋白α亚单位(简称钠通道)基因SCN5A已被证明为Brugada综合征的致病基因，目前国外已经报道了数十种不同的SCN5A基因突变，并通过功能表达研究证明了部分基因突变可导致钠通道电生理特征异常。国内对Brugada综合征的认识正逐渐深入，个案报道已经很多，但尚无直接证据表明遗传缺陷与中国人的Brugada综合征有相关。 目的：对我们所发现的5个Brugada综合征家系进行SCN5A基因突变检测，研究SCN5A是否为中国人Brugada综合征的致病基因，并初步探讨遗传缺陷与疾病的发病机制、临床表现的关系。 方法：抽取所有5个家系成员的外血标本，酚-氯仿法抽提基因组DNA，设计41对引物，结合应用PCR扩增及单链构象多态性电泳技术(PCR-SSCP)分析SCN5A基因所有28个外显子，若PCR-SSCP发现异常带型，则再与200个正常健康人进行对照，并同时直接将PCR产物进行DNA序列测定。 结果：5个病人均有晕厥史，心电图静息时均表现为右侧胸前区导联V1，V2，V3中至少一个以上有ST段呈下斜形或鞍背状抬高，J点抬高超过2mm。突变检测发现一个病人(编号J3001)SCN5A基因第8外显子PCR-SSCP有异常的带型，同时在超过200个正常健康人(400条等位基因)中均无此现象，DNA序列测定结果显示其SCN5A基因编码区第317位密码子的第3个碱基鸟嘌呤(G)被胞嘧啶(C)所取代，并导致其所编码的Na~+通道蛋白Ⅰ区钠通道“孔”相关结构上的一个赖氨酸(K)被天冬酰胺(N)取代，即：K317N。另外4个病人的突变检测未发现SCN5A基因突变。对携带基因突变的病人家系进行遗传学调查后发现，总共21名家系成员中，共有11人携带此基因突变，其中有7人有症状或心电图异常，因此此家系中Brugada综合征的外显率为64％。 结论：我们首次在中国人的Brugada综合征家系中发现了一个新的召CNJ月基因突变K3 1 7N，突变可能通过改变Na+通道的流入道结构，导致Na+在动作电位复极早期内流障碍，最终引起一系列电生理异常而致病。这表明中国人Brugada综合征的发病与S〔从巧月基因缺陷密切相关，且Brugada综合征的外显率并不高，并可能存在遗传异质性，‘C人巧月基因并非唯一的致病基因。
陈哲明, 孟素荣, 彭健, 郭志刚, 赵永忠[3]2002年在《中国人Brugada综合征分子遗传学研究发现一个新的SCN5A基因突变》文中进行了进一步梳理目的 研究探索中国人Brugada综合征是否存在基因突变及突变类型 ,并分析突变可能的致病机制。方法 以SCN5A作为候选基因 ,应用PCR SSCP技术对 4例患者及其家系成员进行突变检测 ,并用DNA直接测序验证。结果 SSCP分析在一个家系内发现SCN5A基因第 8外显子PCR产物出现异常带型 ,而在 2 0 0例正常对照者中均未发现此改变。DNA直接测序显示SCN5A编码区第317位密码子的第叁位碱基G→C的错义突变 ,并导致位于DⅠS5与DⅠS6节段之间与钠通道蛋白“孔”区相关的第一个P Loop结构上一个赖氨酸 (K)被天冬酰胺 (N)取代 (K317N)。一个家系调查表明 ,2 1例家系成员中共有 10例携带者 ,其中有症状者 (4例 )均为携带者 ,2例无症状携带者有心电图改变 ,隐性携带者占 4 0 %。结论 在中国人中发现了Brugada综合征一个新的SCN5A基因突变。
陈新[4]2002年在《统一Brugada综合征的诊断标准并加强对其分子遗传学研究》文中提出本期刊登了杨新春医生等对Ｂｒｕｇａｄａ综合征近年认识进展的综述 ,值得一读。这个综述就心电图特征、诊断标准、鉴别诊断、以及危险分层和预后等方面 ,作了简要阐述。在我国 ,近年来报道的Ｂｒｕｇａｄａ综合征家系和散发病例日益增多。欧洲心脏病学会 (ＥＳＣ)今
刘福强[5]2012年在《Brugada综合征患者心脏钠通道蛋白α亚基编码基因检测及致病机理探讨》文中认为研究背景Brugada综合征(Brugada Syndrome)自1992年被西班牙学者Brugada两兄弟报道以来,世界各地学者对其的认识程度也不断加深,它是一种以右胸导联ST段抬高为特征,并且经常伴有心脏不同水平的传导延缓,具有发生致命性室性心律失常的潜在风险或者家族史中有猝死病史等为特点的遗传性心律失常疾病。虽然目前已经发现最小的患者为几个月大的婴儿,而最大的患者高达84岁,但大多数典型的Brugada综合征首次发病多发生于患者的30-40岁期间,而男性发病率明显高于女性,是导致青年男子猝死的重要病因。据估计,Brugada综合征占全部猝死病因的4-12%,而在没有器质性心脏病的猝死病例中,Brugada综合征患者比例高达20%。据文献报道,Brugada综合征全球发病率大约为5/10000,有明确临床表现的Brugada综合征在西方国家的发病率为1/5000-10000,东南亚及日本地区发病率为0.12-0.14%。值得一提的是,在东南亚地区,Brugada综合征导致的青年人猝死率仅次于交通事故致死率,而成为该地区年轻男子的第二大“杀手”。近年来,借助当今日新月异迅猛发展的分子生物学、分子遗传学等领域的新技术,世界各地学者针对发生于“健康”人群的猝死患者展开了深入细致的研究,Brugada综合征的神秘面纱已经被学者们逐渐揭开。研究发现,Brugada综合征和先天性QT间期延长综合征(LQTS)一样,是一种编码心脏离子通道蛋白的基因发生异常从而导致的遗传性心律失常疾病,其遗传方式为常染色体显性遗传,但表现型受到多种因素(发热,饮酒,基因多态性等)影响而导致其具有不完全外显的特征。自1998年美国学者Chen等发现了第一个导致BrS发病的相关基因——编码心脏钠离子通道蛋白α亚基的基因(SCN5A)开始,到目前为止,在Brugada综合征患者的SCN5A基因上共发现100余个可能与之发病有关系的点突变,学者们对部分突变已经展开了功能表达研究,确定了它们的致病作用。SCN5A基因位于人类叁号染色体上,负责编码心脏电压门控性钠通道蛋白α亚基,该亚基共2016个氨基酸,在细胞膜上形成4个类似的同源结构域(DI-DIV),每个区域由6个跨膜片段(S1-S6)组成,各区连接段在胞内形成一个叫P-Loop的结构,4个区的P-Loop结构形成一个供钠通道流入的孔。研究表明,该基因缺陷影响钠离子通道蛋白的结构和功能,导致瞬时外向钾离子电流(Ito)绝对或相对增强,使得心室肌外层复极1期末切迹加深,心肌细胞进入动作电位平台期后,心内外层复极时同一时间跨壁电压差持续存在导致体表心电图的ST段持续抬高。而Ito离子流强弱程度导致Brugada波呈现不同形态,在Ito离子流较弱时,T波直立,心电图ST段呈现“马鞍形”抬高；反之则出现帐篷样改变伴T波倒置。而同时1期复极末切迹过深使得动作电位2期不但内外层心肌存在跨壁电压差,并且在外层各部分之间存在复极离散,造成2相折返,引发室性心律失常。近些年来,基于对Brugada综合征发病机制研究的越来越清晰化,在各国学者共同努力之下,在针对Brugada综合征的分子遗传学研究方面取得了突飞猛进的成果,不断发现其他几个相关基因,如GPD1-L、SCNlb、SCN3b、CACNAlC、 CACNBβ2b、KCNE3和KCNH2。2011HRS/EHRA新公布的针对遗传性离子通道病的基因检测的专家共识明确指出：目前发现Brugada综合征的致病基因至少牵涉8个基因。SCN5A基因占了基因型阳性的Brugada综合征病例的绝大部分(>75%)。然而,在对那些具有明确临床表现的Brugada综合征患者进行基因检测时,SCN5A基因异常的检出率仅为25%。尚有大部分(>65%)的Brugada综合征患者不能确定其致病基因。这表明,尚有其他基因可能导致出现Brugada综合征,由此看来,目前我们对Brugada综合征致病基因的认识还十分肤浅,仅仅是冰山一角,所以Brugada综合征致病基因研究任重而道远。正因如此,该共识也推荐对确诊为Brugada综合征的患者及其家属进行以SCN5A基因为主兼顾其他基因的全面基因,一方面明确患者的致病位点,另一方面有利于发现尚未报道的新基因位点,为此,美国心、肺、血研究所(NHLBI)和少见病办公室(ORD)于2006年9月也联合召开了专题研讨会议,建议加强遗传性离子通道病的研究,推动科研以期改进遗传性心律失常疾病的诊断和治疗。目前,遗传性心律失常的遗传学研究已经成为当今心律失常学领域的研究热点,它不但能揭示心律失常背后的本质,而且能为临床决策提供强有力的指导证据。目的我们以因不明原因晕厥来南方医院心内科就诊并依据国际通用准则确诊为Brugada综合征的3名患者作为研究对象,建立临床资料,抽取其外周全血样本,提取白细胞中全基因组DNA,以SCN5A基因为候选基因,取用DNA提取产物对其28个外显子部分进行PCR扩增,将产物直接测序分析,明确患者是否携带SCN5A基因变异位点,有助于发现致中国人群发生Brugada综合征新的基因变异位点,进一步明确其致病原因,并结合相关文献探讨其致病机理,丰富我们对中国人群中Brugada综合征发病的分子遗传学的认识。研究对象全部研究对象均来自2009年1月-2011年1月在南方医院心内科就诊并确诊为Brugada综合征的住院患者,3名患者均为男性,年龄32-70岁,3例患者均接受血生化、心肌酶谱、肌钙蛋白、胸片、脑电图、头颅CT及超声心动图等检查,45岁以上患者加行冠脉造影检查,所有患者均有晕厥病史但并未发现明显器质性心脑血管疾病,3例患者心电图均可见Ⅰ型Brugada波改变(V1-3导联至少一个导联呈现完全性右束支传导阻滞并ST段下斜型抬高的“帐篷样”改变,同时伴有T波倒置),患者家族史调查均无阳性发现,心内电生理检查诱发心室颤动。其诊断标准依据2005年ESC发布的有关Brugada综合征的专家共识确立诊断：若在排除其他继发因素(药物、低温、急性前壁心肌梗死等)后,患者自发或经药物诱发出现Ⅰ型Brugada心电图模式的情况下,同时满足下列至少一项条件时,即可诊断为BrS,①、记录到患者出现多形性室性心动过速或心室颤动,②、电生理检查可诱发患者出现上述心律失常,③患者既往有晕厥或夜间濒死样呼吸病史,④家族中有成员出现Ⅰ型Brugada心电图,⑤家族中有成员在45岁以前发生猝死。入选健康体检患者103例作为对照研究组,对照组入选标准为：除不符合Brugda综合征诊断标准外,(1)经病史询问无晕厥、抽搐及室性心律失常等病史,家族中无猝死病史；(2)排除心房纤颤(AF)、扩张性心肌病(DCM)、长QT间期综合征(LQTS)、病窦综合症(SSS)、房室传导阻滞(AVB)及左室致密化不全(LVNC)等已经证实与SCN5A基因异常相关的疾病。以上研究对象均获知情同意。方法用EDTA抗凝管留取各受试对象的全血每人4ml,至于-20℃冰箱内保存,用DNA提取试剂盒针对先证患者的血液样本抽提白细胞全基因组DNA,将所得DNA提取物采用聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增,共设计34对引物,分别扩增SCN5A基因的28个外显子。PCR反应体系如下：采用Platinum(?)Taq反应体系共25uL,除了luL模板DNA,其余24uL的Supermix组成为：10×PCR缓冲液2.5uL,2.5mM dNTP混合液2uL,50mM MgCl20.75uL,5uM上游及下游引物各luL, Platinum(?)Taq DNA聚合酶0.2uL,其余加入灭菌蒸馏水补足体积。上述反应体系的扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸90s,经过35个循环后,再以72℃5min延伸,终末以4℃保存。PCR完成后采用1.5%的琼脂糖进行电泳鉴定,不理想者再对反应体系及条件进行优化,直到达到最佳效果。由invitrogen生物有限公司采用3730XL型DNA测序仪对产物进行直接测序。测序结果应用Chromas软件进行BLAST同源比较,若有碱基改变,在NCBI的SNP数据库中进行查找,看既往是否已经对变异位点进行公布,同时找出是否存在氨基酸序列的改变。若发现存在氨基酸改变,则以同样引物扩增变异点所在外显子,在103个健康者中筛查用以排除遗传多态性可能。结果在3例患者中,除发现一些已经公布的同义多态性位点外,在1号患者的20号外显子上发现导致氨基酸编码改变的碱基替换,该位点由鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A),导致钠通道α亚单位蛋白一级结构的1192位氨基酸密码子由CGG[精氨酸Arg (R)]变为CAG[谷氨酰胺Gln(Q)],在103例健康者体检中发现1例患者携带此变异位点(1例/103例,0.0097),且在NCBI中SCN5A基因SNP数据库中未见公布,但曾有学者在2002年报道,同样变异位点在日本Brugada综合征患者中存在。结论1、中国人Brugada综合征患者编码心脏钠通道蛋白α亚基的SCN5A基因同样存在G3769A变异,与之相应的氨基酸改变为R1192Q；2、Brugada综合征患者存在除SCN5A基因以外的致病基因；
孟素荣, 陈哲明, 彭健, 李曦, 赵永忠[6]2003年在《心电图不典型的Brugada综合征家系调查及初步分子遗传学研究》文中研究说明目的 在 1个Brugada综合征病人发现特殊的心电图表现 :胸前导联ST段呈上斜形抬高 ,凸面向上 ,无明显J波 ,无右束支阻滞 (RBBB)。对其家系进行了临床调查及SCN5A基因 (编码心脏电压门控Na+ 通道蛋白α亚单位基因 )突变检测 ,分析其临床及分子遗传学特征。方法 家系临床调查包括收集所有 15个家系成员的病史资料及进行常规体格检查 ,12导联心电图、超声心动图、X光胸片检查等。采用PCR 单链构象多态性技术 (SSCP)结合DNA序列测定证实 ,对病人SCN5A的全部 2 8个外显子进行突变检测。结果 所有成员均无器质性心脏病的证据 ,先证者有晕厥病史 ,并被记录到频发极短配对间期的室性早搏、多形室性心动过速及心室颤动 ,而其他家族成员均无晕厥或猝死病史 ,先证者的 1个儿子及侄儿与其静息心电图表现相似。基因突变检测未能在病人的SCN5A基殷中发现遗传缺陷。结论 发现了一种特殊的Brugada心电图模式 ,对目前Brugada综合征诊断标准提出质疑 ,并提示存在遗传不均一性 ,SCN5A可能不是惟一的致病基因。
刘欣[7]2017年在《钙通道CACNA1C基因突变致心原性猝死相关早期复极的分子遗传学机制探讨》文中研究说明研究背景心原性猝死(sudden cardiac death,SCD)是人类健康头号杀手心血管疾病导致的突发性自然死亡。在诸多SCD高发的心血管疾病中,具有极高风险尤其对年轻人造成危害的遗传性心律失常综合征日渐受到关注。主要由各种离子通道蛋白及其调控蛋白编码基因突变导致的遗传性心律失常综合征通常不伴心脏结构功能异常,而呈现以各种特征性的心电图形态,在特殊环境状态下诱发严重的心电生理活动紊乱促使恶性心律失常发生,从而导致SCD。早期复极(early repolarization,ER)是部分心肌提前复极形成心电图上J点抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形,在人群中广泛存在,且在半个世纪以来被认为是一种正常的心电图表现。随着流行病学调查研究的大力开展,部分有ER表现的人群被发现存在SCD风险及家族聚集现象。如何辨别具有SCD风险的ER表现成为临床医生所面临的棘手问题。在最新的遗传性心律失常综合征诊治共识中,这类具有恶性心律失常病史或SCD家族史且心脏结构正常,≧2个连续下壁和/或侧壁导联出现J点抬高≧1 mm心电图表现的一组临床症候群被定义为早期复极综合征(earl repolarization syndrome,ERS)。近年来分子遗传学理论和技术的飞速发展极大地推动了人们对遗传性心律失常综合征中各类疾病的认知与探索。编码ATP敏感性钾离子通道Kir6.1的KCNJ8和ABCC9基因,编码L型钙离子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因,以及编码钠离子通道的SCN5A基因突变相继在ERS中报道。突变导致的外向钾离子通道功能增强和内向钙离子或钠离子通道功能减弱被认为是ERS的病理性致病基础。ER不同于长QT综合征和Brugada综合征等其它具有显着遗传学特性的遗传性心律失常综合征类型,ERS致病基因突变多见于散发病例,具有家族遗传性的基因突变罕见。此外,国人ERS的遗传学研究报道罕见,由此可见国人相关致病基因突变的研究仍存在很大空间,对有明显症状或猝死家族史的家系进行级联式遗传学筛查才能高效地筛查致病基因突变,并探索ERS分子遗传学发病机制,从而寻找更加有效的ERS个体化治疗方案。第一部分心原性猝死大家系临床分析及遗传学检测目的:本研究通过对所收集的SCD大家系先证者及存活成员进行全面的临床评估,并对先证者尸检报告仔细分析以及家系成员SCD候选基因筛查检测,解析该家系SCD发生机制,以异常心电图表现为线索寻找潜在的致死性原因及致病基因突变,为该家系SCD高危成员提供诊疗建议。方法:1.临床资料收集:严格遵循医学伦理准则,经医院伦理委员会审批获准及入选研究对象知情同意,对我院心内科就诊的江西籍SCD高危患者及其亲属临床资料进行采集。诊断标准参考2013年由美国心律协会(Heart Rhythm Society,HRS)、欧洲心律学会(European Heart Rhythm Association,EHRA)和亚太心律协会(Asia Pacific Heart Rhythm Society,APHRS)共同制定的遗传性心律失常综合征患者诊断和治疗专家共识,获取家系成员病史,心电图和心脏彩超等检查信息。2.尸检资料收集:在SCD死者法定代理人知情同意的情况下,获取死者经司法机构提供的尸检报告及相关病理组织。3.先证者心肌组织HE染色:取死者心肌不同部位组织块制作切片并HE染色,观察心肌组织结构形态。4.遗传学检测:经患者及其家属知情同意后,采集外周静脉全血5 ml储存于EDTA真空抗凝管,采用血液基因组DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞全基因组DNA,选择常见的遗传性心律失常综合征致病基因作为候选基因,包括编码钠离子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因,编码钾离子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和KCND3基因,编码钙离子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及编码通道调节蛋白的ANK2和PRKAG2基因,设计相应引物,使所测范围涵盖待测基因所有外显子以及外显子与内含子交界区序列,采用DNA直接测序法(双脱氧链终止法)进行测序筛查基因变异,随机选取本实验室DNA库中400例相同遗传背景及年龄性别匹配的正常健康人群标本作为对照,以发现新的致病基因突变位点或单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)。5.统计学分析:所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P值<0.05具有统计学意义,P值<0.01具有显着统计学意义。结果:1.本研究收集到一个原因不明夜间猝死大家系,死者为包含先证者在内的5名男性成员,先后在睡眠中发生猝死,均处青壮年时期,最小23岁,最大49岁,平均年龄34±8.4岁。2.先证者尸检报告提示无机械性损伤、机械性窒息致死的法医病理学改变,也无中毒致死的依据;组织病理学检查结果排外各主要器官器质性病变,考虑猝死可能由心原性因素所致。所取心肌组织形态结构及排列均正常,可排外心肌病等各种结构性心脏病以及可伴右室心肌病变的Brugada综合征。先证者死前3年内偶发头晕、心悸,无胸闷、胸痛及晕厥;既往心脏彩超检查无明显异常,24小时3导联动态心电图记录II导联和a VF导联J点抬高≧1.5mm。3.其他家庭成员既往史及个人史无特殊,无阳性体征,静息心电图、心脏彩超及平板运动试验检查未见明显异常。24 h动态心电图检查发现3位家庭成员有ER表现。其中先证者弟弟ER表现最为显着,下壁II、III和a VF导联,胸前V3~V5导联J点抬高0.05 m V~0.3 m V,且可见J波,V2~V4导联T波高尖。先证者儿子及其弟弟女儿的动态心电图表现为下壁和侧壁导联ST段抬高。4.通过候选基因测序筛查发现该家系1个钙离子通道α1亚单位编码基因CACNA1C的杂合错义突变,由第48号外显子上第5747号碱基A转换为碱基G,导致第1916位谷氨酰胺变为精氨酸,即p.Q1916R。该突变见于先证者及源于父系的所有一级和二级亲属,而其母亲及母亲的兄弟姐妹和其他与先证者无血缘关系的家庭成员均不存在此突变。此外,在家系中还筛查到已被报道的5个CACNA1C基因SNPs,分别为c.2436C>T(p.D812D),c.3786C>T(p.F1262F),c.5361G>A(p.T1787T),c.5609C>T(p.T1870M)和c.5649G>A(p.P1883P),以及1个SCN5A基因SNPs,c.3578G>A(p.R1193Q)。5.CACNA1C-Q1916R突变携带者中有ER表现和无ER表现成员心电图参数比较结果显示,有ER表现成员的心率校正QT间期比无ER表现的成员短,但均在正常范围,QT间期离散度(QT dispersion,QTd)和Tp-Te间期离散度(Tp-Te dispersion,Tp-ed)则更大,但两组间各参数差异无统计学意义。结论:1.本研究从一个青壮年男性SCD高发大家系,揭示SCD可能与ERS相关。2.ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突变可能与该家系ERS致SCD相关。3.CACNA1C-Q1916R突变携带家庭成员中ER呈不完全外显性,考虑与SCN5A-R1193Q和性别相关。4.ER家庭成员心电图中有致恶性心律失常性作用的复极化跨壁离散度参数指标QTd和Tp-ed增大,但与无ER表现的CACNA1C突变携带成员比较无统计学差异,样本量有限是可能原因。5.其它所发现的CACNA1C基因SNPs(D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P)无明显致SCD效应。第二部分CACNA1C基因突变致心原性猝死相关ER的分子遗传学、细胞电生理机制及药物干预探讨目的:从组织和细胞水平探讨CACNA1C-Q1916R突变的功能变化及致SCD相关ER的分子机理,并筛选有效的治疗药物。方法:1.人心肌组织标本免疫组化:取携带CACNA1C基因突变先证者左心室肌组织,通过免疫组化法对组织内由CACNA1C基因翻译的Cav1.2蛋白表达及定位进行检测,并以成年人正常左心室标本作为对照。2.CACNA1C-Q1916R定点突变:采用经典的定点突变技术,将CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G,进行测序验证并排除其它位点突变。3.CACNA1C质粒瞬时转染:采用Lipofectamine?2000转染试剂盒,将携带野生和突变型CACNA1C,以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的质粒载体按摩尔浓度1:1:1分两组共转染入人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293)中用于后续实验,用于膜片钳细胞电生理实验的细胞则按0.3比例额外转染表达绿色荧光的p EGFP-N3质粒。4.实时荧光定量PCR(Quantitative Real time PCR,q RT-PCR):采用q RT-PCR引物扩增表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中CACNA1C的序列片段,检测突变对Cav1.2总m RNA表达的影响。5.蛋白免疫印迹(Western Blot):采用Western Blot检测表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中,Cav1.2在细胞总蛋白、膜蛋白和浆蛋白各水平的表达情况。6.细胞免疫荧光:在共聚焦荧光显微镜下观察转染野生和突变型CACNA1C并经Cav1.2特异抗体荧光染色的HEK293细胞,检测突变对Cav1.2表达定位及转运的影响。7.全细胞膜片钳细胞电生理分析及药物筛选:采用全细胞膜片钳技术记录表达突变型CACNA1C的HEK293细胞上L型钙离子流变化,以及雄激素睾酮(10μM)对其的影响。再分别加入ER治疗药物异丙肾上腺素(10μM)和奎尼丁(5μM),观察药物对钙离子流的影响,绘制电流-电压(I-V)曲线,电压依赖的稳态激活曲线(steady state activation,SSA)和电压依赖的稳态失活曲线(steady state inactivation,SSI)。8.统计学分析:所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P值<0.05具有统计学意义,P值<0.01具有显着统计学意义。结果:1.成功诱导CACNA1C-Q1916R突变,经测序验证CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G,其它位点未发生突变。2.免疫组化结果显示携带CACNA1C基因突变的先证者心室肌组织Cav1.2蛋白表达水平低于正常对照组织(*P<0.05),异源性表达突变Cav1.2的总m RNA表达水平较野生型Cav1.2低(*P<0.01),且在细胞总蛋白、模蛋白和浆蛋白各水平的表达均下降(*P<0.05)。3.细胞免疫荧光结果显示突变型Cav1.2蛋白转运功能正常,但整体荧光强度更弱。4.全细胞膜片钳结果显示突变组钙电流密度较野生组显着降低,降低有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01),SSA和SSI两组间无差异;睾酮(10μM)可显着降低突变组电流密度,差异有统计学意义(#P<0.05);ERS治疗药物异丙肾上腺素(10μM)可增加野生型钙电流密度,对突变型钙电流的增加无统计学意义,可引起野生型和突变型钙电流的电压依赖性SSA均发生左移;奎尼丁(5μM)对野生型和突变型钙电流的幅度、密度和电压依赖性SSA均无任何影响。结论:1.CACNA1C-Q1916R为功能丧失性突变,可使Cav1.2在m RNA和蛋白质水平表达量均降低,但不影响蛋白的定位及转运,突变可能通过减少细胞膜上有效Cav1.2数量而降低钙电流。2.CACNA1C-Q1916R突变是引起本研究家系中ER表现及SCD的主要原因。3.睾酮加剧CACNA1C-Q1916R突变钙电流密度减小,证实男性是突变携带成员发生SCD和ER表现的重要危险因素。4.异丙肾上腺素可能对有ER表现及SCD高危的CACNA1C-Q1916R突变携带者有一定疗效。
张浩[8]2010年在《一个特发性Brugada综合征心电图征家系的分子遗传学分析》文中研究表明目的:研究一个湖北的Brugada心电图样改变的患者及其家系成员是否存在基因突变,若存在则分析其突变基因和可能的分子遗传学和电生理机制以及和临床表现心电图特征之间的关系。方法:收集家族成员的临床资料、心电图和血液标本。从外周血提取她们的白细胞DNA后进行连锁分析,根据连锁反应的结果筛选致病基因,针对可能性最大的致病基因SCN5A设计引物,依次经行聚合酶链反应扩增所有家族成员的28个外显子,琼脂糖凝胶电泳,回收PCR反应产物后进行BigDye单链扩增,纯化扩增产物,直接DNA测序,发现基因突变后应用限制性片段长度多态性技术(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),用限制性内切酶对含有和不含有突变的家族成员以及正常人的PCR产物经行酶切反应验证。并进行家系调查分析,分析遗传特点、突变的分布情况以及和心电图改变的关系。结果:心电图资料显示先证者存在2型Brugada波(马鞍型),其他3位家系成员的心电图分别提示混合型Brugada波和上抬的J波。连锁分析提示SCN5A这个基因的可能性最大。经过DNA测序发现先证者的SCN5A基因的第1001位密码子的第二个碱基处有一个“双峰”,经过数据库的查找发现这是一个错义突变T3002A,导致其所编码的Nav1.5离子通道α-亚单位的DII同源结构域的S5-S6跨膜节段之间的P环上的一个亮氨酸被谷氨酰胺取代(L1001P)。在此家族包括先证者及其3个兄弟姐妹和她的女儿在内共5人的DNA检测到了此突变。对家族所有成员和50个正常人的PCR产物的酶切分析提示正常人不存在此突变。同时在发现突变的家系成员中也发现了3个基因多态。结论:在中国的一个Brugada心电图样改变的家系发现了一个新的突变位点T3002A,家系中有五名成员检测出此杂合突变,连锁分析、基因测序、酶切反应的结果一致支持Brugada症状是常染色体显性遗传的特点。先证者及其家族成员均无晕厥、夜间濒死呼吸、室颤等临床症状,也无家族成员猝死史,先证者和其3个兄妹以及先证者的女儿仅有不典型的Brugada心电图样改变,但是在基因检测时,上述5人却均在SCN5A的第1001位密码子的第二个碱基处检测到一个杂合突变T3002A,提示可能是环境因素对突变位点导致的钠离子通道功能缺陷的一种修复现象,亦可能是由于基因多态对突变所致的Na+离子通道蛋白表达下降的负性消弱作用;第叁种解释是尽管错义突变T3002A使SCN5A编码的蛋白的DII结构域的S5-S6之间的P环上的亮氨酸被谷氨酰胺取代,但是具体对其功能的影响程度有多大,则需要进行细胞功能的研究,比如突变的诱导,转染、膜片钳、动作电位等方面的研究,或许这个突变仅仅部分影响了Na离子通道的通透性和选择性,使钠通道在大多时刻仍然可以维持正常的生理功能,这也许就是先证者及其家属仅仅有心电图的不典型改变而没有任何临床症状的原因。
江茜, 周勇, 柯琰[9]2008年在《Brugada综合征患者的心电图及临床特点分析》文中指出目的分析Brugada综合征患者的心电图及临床特点。方法对我院近5年诊断的8例Brugada综合征住院患者的心电图及临床情况进行长期随访观察。结果8例Brugada综合征患者均为男性,年龄平均(40±13)岁。心电图I型Brugada波者3例,Ⅱ型4例,Ⅲ型1例;Brugada波具有多变性,提高肋间描记右胸导联心电图可显现Brugada波或使其更明显。8例中4例有猝死家族史,5例有晕厥史,3例在住院期间发生室速/室颤,随访期间2例猝死。结论心电图Brugada波(尤其I型)是诊断Brugada综合征的必要条件,明确诊断Brugada综合征尚需联合其他几项临床指标;Brugada综合征患者猝死的风险高,消除晕厥或室速/室颤的诱因是预防的关键。
袁斌斌[10]2006年在《Brugada综合征SCN5A基因突变检测及ICD治疗的研究》文中提出【目的】对7例Brugada综合征患者进行SCN5A基因突变检测，分析其分子遗传学特征。 【方法】提取7例Brugada综合征患者外周血DNA样本，设计41对引物进行PCR(多聚核苷酸聚合酶链式反应)扩增SCN5A基因28对外显子，并采用双脱氧链终止法直接测序。 【结果】SCN5A基因外显子部分未发现新的突变位点。 【结论】Brugada综合征可能存在除SCN5A基因之外的其他相关基因突变。
参考文献：
[1]. Brugada综合征分子遗传学及细胞电生理机制的研究[D]. 陈哲明. 第一军医大学. 2006
[2]. Brugada综合征分子遗传学研究[D]. 陈哲明. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[3]. 中国人Brugada综合征分子遗传学研究发现一个新的SCN5A基因突变[J]. 陈哲明, 孟素荣, 彭健, 郭志刚, 赵永忠. 中华心血管病杂志. 2002
[4]. 统一Brugada综合征的诊断标准并加强对其分子遗传学研究[J]. 陈新. 中华心律失常学杂志. 2002
[5]. Brugada综合征患者心脏钠通道蛋白α亚基编码基因检测及致病机理探讨[D]. 刘福强. 南方医科大学. 2012
[6]. 心电图不典型的Brugada综合征家系调查及初步分子遗传学研究[J]. 孟素荣, 陈哲明, 彭健, 李曦, 赵永忠. 中华心律失常学杂志. 2003
[7]. 钙通道CACNA1C基因突变致心原性猝死相关早期复极的分子遗传学机制探讨[D]. 刘欣. 南昌大学. 2017
[8]. 一个特发性Brugada综合征心电图征家系的分子遗传学分析[D]. 张浩. 华中科技大学. 2010
[9]. Brugada综合征患者的心电图及临床特点分析[J]. 江茜, 周勇, 柯琰. 临床心电学杂志. 2008
[10]. Brugada综合征SCN5A基因突变检测及ICD治疗的研究[D]. 袁斌斌. 南京医科大学. 2006
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