（1 新乡医学院第一临床学院 河南 新乡 453003）
（2 新乡医学院第三临床学院 河南 新乡 453003）
（3 新乡医学院人体寄生虫教研室 河南 新乡 453003）
【摘要】目的：检测淡色库蚊体内弓形虫529片段，验证淡色库蚊叮咬弓形虫感染小鼠后，蚊虫体内弓形虫携带状况，为研究蚊传播弓形虫提供依据。方法：通过感染105个RH株速殖子建立急性弓形虫小鼠感染模型。每天将蚊子放进笼子里吸老鼠的血。捕获吸血蚊，将其粉碎，利用酚氯仿DNA提取法，巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)及实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测弓形虫529基因。结果：小鼠血液中529基因的感染率为77.37%，弓形虫的含量随感染天数的增加而增加。吸血蚊血涂片在镜检下观察到弓形虫滋养体活体。47只蚊子529基因的感染率为59.57%。在28只阳性蚊子中，弓形虫的平均拷贝数约为1529.3/只。结论：淡色库蚊可以通过吸血方式携带弓形虫。
【关键词】淡色库蚊；刚地弓形虫；弓形虫病；传播；吸血
【中图分类号】R38 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）11-0238-03
弓形虫是寄生于温血类动物和人类有核细胞内的寄生原虫，在世界范围内广泛分布，人类普遍易感，全世界将近三分之一的人感染弓形虫[1]。弓形虫感染途径有多种：生食或半生食肉类或饮用卵囊污染的水源，胎儿可经孕妇经胎盘导致感染[2]。
蚊属于双翅目、蚊科，是对人类威胁最大的卫生媒介昆虫。蚊能兼吸人和动物的血，能传播多种人兽共患疾病，如常见的疟疾、丝虫病、流行性乙型脑炎、黄热病和登革热等疾患[3]。蚊虫有多种，常见的有按蚊，库蚊和伊蚊，其中，淡色库蚊是北方地区夏季的优势吸血蚊种[4-5]。
蚊子在弓形虫传播中的作用至今尚未知晓。我们采用RH株弓形虫建立小鼠弓形虫感染模型。同时饲养当地优势蚊种-淡色库蚊，待雌蚊羽化交配后叮咬吸取弓形虫感染小鼠血液，其后检测吸血雌蚊体内弓形虫DNA。现将实验结果报道如下。
1.资料与方法
1.1 实验动物
淡色库蚊孑孓由野外捕捉。8周龄昆明小鼠由新乡医学院动物中心提供；RH株弓形虫速殖子为新乡医学院寄生虫实验室液氮保存的RH株种。此实验过程及动物使用、护理方案通过了新乡医学院动物伦理使用委员会的批准。
1.2 实验材料
饲养笼（35cm×35cm×35cm，120目），电动吸蚊器、透明塑料杯、葡萄糖、小白鼠饲料、海绵、塑料盆等均为市售；2×UltraSYBR Mixture(High ROX)、2×Es Taq MasterMix(Dye)均购自北京康为世纪生物科技有限公司，蛋白酶K缓冲液购自美国Genview公司，Tris饱和酚购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1淡色库蚊的养殖 采用标准化养殖方法[6]，饲养条件为室温（25±2）摄氏度，相对湿度为（65±15）%，光照周期为L:D=14h:10h。
1.3.2弓形虫小鼠感染模型的建立 RH株弓形虫速殖子1×105个腹腔内注射感染小鼠，建立弓形虫感染小鼠模型，感染前小鼠尾部取血200μL，感染后每天均取血，加入EDTA保存。每天18:00左右将小鼠固定于鼠板上，放入约100只成蚊(雌雄比例均衡，均选取羽化后两至三天的成蚊，根据蚊虫吸血高峰的调查，在此期间雌蚊处于第一个吸血高峰[7]，使其吸取小鼠血。第二天7:00将所有蚊子取出，挑选出大部分已吸血的雌蚊，把雌蚊分别剪碎放入1.5mL离心管内，加入ProK蛋白酶缓冲液500μL，对小鼠血液和吸血蚊组织采用酚-氯仿法提取DNA；另一小部分吸血蚊做成血涂片，以便显微镜下观察弓形虫滋养体。
1.3.3弓形虫529序列巢式PCR 分别以小鼠血液和吸血蚊组织DNA为模板，以弓形虫速殖子DNA为阳性，以ddH2O为阴性,进行PCR扩增[8] 。
1.3.4 Real-time PCR弓形虫虫体量测定 以血液DNA为模板，进行荧光定量PCR检测。外套引物F：5'-CGCTGCAGGAAGACGAAAGTTG-3'，R：5'-CGCTGCAGACACAGTGCA TCTGGATT-3',产物大小94bP，反应体系为25μL：2×UltraSYBR Mixture(High ROX)12.5μL，TemPlate DNA 4μL，Forward Primer、Reverse Primer各0.5μL，ddH2O补足至25μL。反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，35个循环；72℃ 1.5min；72℃ 7min。以拷贝数为2.7×107、2.7×105、2.7×103、2.7×101弓形虫RH株滋养体DNA做标准曲线，ddH2O为空白对照。
2.结果
2.1 血涂片镜检
将部分吸血蚊做成血涂片，经瑞氏染色后在显微镜下可见弓形虫滋养体活体，结果如图1、2。
图2 吸血蚊血涂片2（瑞氏染色）
2.2 定性检测
2.2.1小鼠感染情况 小鼠存活时长记为5天(在感染后在第四天陆续开始死亡，至第5天全部死亡)，对小鼠断尾取血得到血液样本共76个，其中阳性样本55个，阳性率为77.37%。实验中对每天收集的小鼠血进行PCR和凝胶电泳检测后，18只小鼠在5天内均至少有一天出现阳性条带，结果见表1。
对实验小鼠每天感染情况使用χ2检验显示小鼠血阳性率与其感染天数有关(χ2=30.193,P＜0.001)。第一天的感染率低于后四天。通过多个样本率比较，第一天与其余四天之间的阳性率有显著性差异；但除第一天外其余四天间阳性率无显著性差异(χ21-2=13.486,P1-2=0.000；χ21-3=16.200,P1-3=0.000； χ21-4=17.578,P1-4=0.000；χ21-5=7.170,P1-5=0.007；χ22-3=0.232,P2-3=0.630；χ22-4=0.885,P2-4=0.347；χ22-5=0.000,P2-5=1.000；χ23-4=0.249,P3-4=0.618；χ23-5=0.127,P3-5=0.722；χ24-5=0.573,P4-5=0.449,critical value χ20.005,1=7.88)。
对吸血蚊阳性率使用χ2检验显示吸血蚊阳性率在小鼠间无差异(χ2=2.573,P=0.632)。通过多个样本率比较，五只小鼠对应吸血蚊的阳性率之间无显著性差异(χ21-2=0.045,P1-2=0.833；χ21-3=2.036,P1-3=0.154；χ21-4=0.202,P1-4=0.653；χ21-5=0.900,P1-5=0.343；χ22-3=1.125,P2-3=0.289；χ22-4=0.032,P2-4=0.858；χ22-5=0.417,P2-5=0.519；χ23-4=1.059,P3-4=0.304；χ23-5=0.175,P3-5=0.676；χ24-5=0.303,P4-5=0.582,critical value χ20.005,1=7.88)。
2.3 定量检测
2.3.1弓形虫拷贝数标准曲线建立
对吸血蚊拷贝数使用方差分析显示阳性吸血蚊平均拷贝数与小鼠感染天数无关(F=0.457,P=0.717) 。通过多个样本均数间的多重比较，四天间阳性吸血蚊平均拷贝数无显著性差异。(F1-2=0.056,P1-2=0.818；F1-3=0.033,P1-3=0.861；F1-4=0.915,P1-4=0.361；F2-3=0.235,P2-3=0.661；F2-4=4.357,P2-4=0.091；F3-4=0.431,P3-4=0.547)。
3.讨论
通过实验研究显示，小鼠血样本感染率为77.37%，弓形虫在小鼠血液中的含量随着感染时间的增加而增加(F=15.164,P＜0.0001)，结果与先前Zenner[9]报道的研究结果一致。我们的研究通过建立了急性弓形虫感染的小鼠模型，论证了弓形虫在小鼠血液中的含量随小鼠感染时间的增加而增加。
先前业已有很多关于弓形虫传播途径的报道，主要包括先天性感染[10]和获得性感染[11-12]。获得性感染有多种途径，尤其是口腔感染；器官及骨髓移植或输血感染；性感染。
有研究表明，两种常见的节肢动物:蝇[13]和蟑螂[14]，它们具有携带弓形虫的能力。在中国北部和中部地区，淡色库蚊是一种最常见的节肢动物，它能够传播多种病毒和寄生虫等。然而，到目前为止还没有任何关于蚊能够传播弓形虫的报道。我们通过建立小鼠急性弓形虫感染模型得到目标吸血蚊。首先我们制作吸血蚊血涂片，镜下发现弓形虫滋养体活体。然后通过吸血蚊DNA样本，我们发现在蚊体中存在529基因，其平均阳性率为59.57%；此外，阳性吸血蚊体内的弓形虫含量与小鼠感染天数无关(F=0.457,P=0.717)，平均每只蚊子的弓形虫拷贝数为1529.3/只。此外，StePhanie的研究表明西尼罗病毒在蚊子体内的含量趋于一定值。在我们研究中弓形虫的变化趋势与西尼罗病毒类似[15]，这一现象说明弓形虫在蚊体内的变化趋势可能类似于西尼罗病毒，但这需要进一步的探索。
我们的实验表明,小鼠感染后第一、二天阳性吸血蚊体内弓形虫的含量高于阳性小鼠血液内含量,小鼠感染后第三、四天阳性吸血蚊体内弓形虫的含量低于阳性小鼠血液内含量。Williams[16]提到蚊子在吸血过程中会有液滴的排出现象。因此，我们推测蚊子可能在液滴排出时对弓形虫有富集现象，这可能解释了在小鼠感染后前两天蚊体内弓形虫含量高的现象。
在本研究中，我们发现淡色库蚊可携带弓形虫活体，且弓形虫在蚊子体内的含量趋于一定值。然而,在蚊吸血后正常生存状态下，弓形虫在其体内存活情况及变化情况仍不清楚。蚊是否是弓形虫在动物间传播的媒介还有待进一步研究。
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论文作者:谷晨阳2,李雅菁2,赵奕涵1,张学顺1,冯苗2,刘
论文发表刊物:《医药前沿》2019年11期
论文发表时间:2019/6/13
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