（岳阳县疾病预防控制中心 湖南岳阳 414100）
摘要：目的 对比并分析荧光定量PCR检测结核杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检结果。方法 选取2016年1月~2016年12月在我中心确诊的结核病患者150痰样本作为结核组，另选取同期来我中心就诊的无结核表现的其他病例患者的40份痰样本作为对照组，两组分别同期进行荧光定量PCR检测和涂片抗酸染色镜检，对检测结果进行比较分析。结果 荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%，差异具有统计学意义（P＜0. 05）。150 例痰样本中，抗酸涂片结果阴性112例，阳性34例，疑似4例。在112例阴性结果中，有40例荧光定量PCR检测为阴性，72例检测为阳性，其中结合杆菌DNA拷贝数以102~103数量级居多；38例阳性（含疑似）结果中，有1例荧光定量PCR检测为阴性，37例检测为阳性，其中结合杆菌DNA拷贝数以103~104数量级居多，结果显示，DNA拷贝数数量级与涂片阳性程度基本呈正相关性。结论 对于结核杆菌的检测，采用荧光定量PCR法较涂片抗酸染色法，敏感度更高，特异性更强，且前者检测结核杆菌DNA拷贝数与后者镜检阳性程度具有较好的相关性，两种方法联合使用可为临床诊疗提供可靠的依据。
关键词：结核杆菌；荧光定量PCR；DNA拷贝数；涂片抗酸染色
[Abstract] objective to compare and analyze the results of the test results of the detection of the DNA copy number of tuberculosis bacillus in fluorescence and PCR. Selection methods from January 2016 to December 2016 in our center diagnosed TB patients 150 sputum samples as tuberculosis group，the other selected at the same time to the center of TB show no other cases of sputum samples as control group，40 patients with two groups respectively over the same period with fluorescent quantitative PCR detection and smear microscopy acid-fast stain，a comparative analysis of test results. Results the positive rate of the cca was 72.67%，obviously higher than the 2600% of the anti-acid smear method，and the difference was statistically significant （P < 0.05）. In 150 sputum samples，antiacid smear results were negative 112，positive 34，and suspected 4 cases. Of the 112 cases of negative results，40 were negative and 72 were positive，with the bacterial DNA being copied between 102 and 103 orders of magnitude. 38 cases were positive （suspected）results，there are negative for 1 case of fluorescence quantitative PCR detection，testing positive for 37 cases，including combined bacillus DNA copy of 103 ~ 104 orders of magnitude，the results showed that DNA copy number order of magnitude and smear positive degree of positive correlation between the basic. Conclusion for the detection of mycobacterium tuberculosis，and using the fluorescent quantitative PCR method with smear acid staining method，higher sensitivity，specificity，and the former microscopy to detect mycobacterium tuberculosis DNA copy number and the latter has good correlation，positive degree combined two methods can provide reliable basis for clinical diagnosis and treatment.
[Keywords] tuberculosis bacillus；Fluorescence quantitative PCR；DNA copy number；Smear anti-acid dyeing
近年来随着流动人口数量和比例的增加，加上艾滋病的传播率提高，使得临床上结核病的发病率也呈现了逐年上升的趋势，然而结核杆菌的传统检测多采用痰标本直接涂片进行抗酸染色计数，但假阳性率较高，敏感性和特异性较低[1]。随着检测技术的不断进步，PCR技术在结核杆菌的检测上获得了广泛应用和认可[2]，为此本研究特利用荧光定量PCR检测结核杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检的结果进行对比并分析。现具体报告如下。
1 资料与方法
1.1一般资料
选取2016年1月~2016年12月在我中心确诊的结核病患者150痰样本作为结核组，其中男89例，女61例，年龄12~58岁，平均（42.2±7.1）岁；另选取同期来我中心就诊的无结核表现的其他病例患者的40份痰样本作为对照组，其中男24例，女16例，均为接受过抗痨治疗。
1.2样本采集
两组患者清早起床痰液1~2口，痰液中注意避免混入唾液，由灭菌样本盒加盖送检。
1.3方法
抗酸染色采用梅里埃诊断产品（上海）有限公司代理销售的染色液，结核杆菌DNA 荧光定量PCR检测试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，检测仪器为美国ABI公司生产的7300荧光定量PCR仪。
1.3.1 荧光定量PCR检测
向痰液样本中按2~4倍量加入浓度2%的NaOH，持续震荡5min后于室温下静置0.5h，静置期间可振荡3次以使痰液充分液化。取液化的痰液离心处理后弃上清液，加100uLDNA浓缩液，混合均匀后在离心弃上清液，加入20uLDNA浓缩液，给予100℃恒温及离心处理后取3uL进行PCR反应实验，其中反应条件：37℃，180s；93℃，60s；93℃，5 s；60℃，40 s，40循环次。
1.3.2 抗酸染色镜检
将细菌涂片标本经制备涂片、初染、脱色、复染、干燥固定，镜检观察：连续观察300个视野未发现结核分枝杆菌视为抗酸杆菌阴性（－）；连续观察300视野发现1～8条杆菌视为疑似结果（±）；连续观察100视野内发现3条以上杆菌视为抗酸杆菌阳性（+）。以上严格按照实验规程及试剂说明进行操作。
1.4统计学处理
应用SPSSl9. 0版软件对本次研究数据进行统计分析，n或%表示计数资料，采用X2检验，以P<0.05为具有统计学意义。
2结果
2.1 两种不同方法检测结核杆菌阳性率的比较
结核组结果显示，荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%，差异具有统计学意义（P＜0. 05）。见表1。
3讨论
结核病的细菌学检查临床公认的结核杆菌检测的“金标准”，是临床发现结核病患者、判断治疗效果、以及疾病控制和评价等的重要依据，也是临床对结核患者进行确诊以及治疗和预后的诊断标准的[3]。但是值得注意的是该操作过程中由于受人为、设备等的干扰因素较为显著，导致误差较大，本研究中对照组就出现了1例阳性，因此其特异性不强；此外该方法对结核杆菌和非结核分枝杆菌的分辨效果不佳，而且对结核分枝杆菌的药物敏感性已无法获知；尤其是“金标准”中要求的细菌培养，在时间上需要4～6周时间，且对培养条件要求较高，失去了早期诊断和疗效判定意义，故临床意义大打折扣，难能满足临床诊疗的需要[4]。
FQ-PCR技术是在常规PCR的基础上利用了荧光探针标记技术，在融合了核酸扩增与光谱技术下，使得探针和待检测基因进行有效的特异性结合；同时该技术实现了操作流程的“全封闭式”，并辅以dUPT一UNG酶防污染体系，有效降低了因产物污染而导致的假阳性[5]。因此本研究结果显示荧光定量PCR法检测结核杆菌阳性率为72.67%，明显高于抗酸涂片法的26.00%；并且表二的结果也显示DNA拷贝数数量级与涂片阳性程度基本呈正相关性，这与林瀛等[6]的研究结果相一致，说明FQ-PCR的定量检测具有较高的准确度[7]。
综上所述，对于结核杆菌的检测，采用荧光定量PCR法较涂片抗酸染色法，敏感度更高，特异性更强，且前者检测结核杆菌DNA拷贝数与后者镜检阳性程度具有较好的相关性，两种方法联合使用可为临床诊疗提供可靠的依据。
参考文献
[1]常新剑，裴秋玲. 用三种检测法检测结核分枝杆菌的效果[J]. 当代医药论丛，2015，13（24）：58-59.
[2]王俊妨，靳颖，牛伟霞，等. 荧光定量PCR在脑脊液结核分枝杆菌DNA检测中的应用[J]. 检验医学，2017，32（2）：135-137.
[3]周稳兰，陆春芬，朱蔚岗，等. 荧光定量PCR检测技术在肺结核诊断中的应用[J]. 江苏医药，2015（23）：2874-2875.
[4]杨振兴，陈威，许敏，等. 五种检测方法在结核病诊断中的应用评价[J]. 中国热带医学，2016，16（10）：1024-1026.
[5]王霖，王辉，李才信，等. 荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的应用研究[J]. 中国卫生标准管理，2016，7（11）：169-171.
[6]林瀛，陈小岩，俞训彬. 结核分枝杆菌DNA实时定量PCR技术在临床病理诊断中的应用[J]. 实用检验医师杂志，2015，7（3）：143-147.
[7]陈杏媛，郭琴华. 结核杆菌三种实验方法的应用评估[J]. 实验与检验医学，2016，34（3）：373-374.
论文作者:黄琼
论文发表刊物:《航空军医》2017年第11期
论文发表时间:2017/8/21
标签：结核杆菌论文; 涂片论文; 定量论文; 荧光论文; 阳性论文; 结核论文; 杆菌论文; 《航空军医》2017年第11期论文;