白光春[1]1999年在《沙眼衣原体重组口服活疫苗的构建及其免疫学特性的初步研究》文中研究表明沙眼衣原体(Ct)既是感染致盲的主要病原体，又是性传播疾病最常见的病原体之一，目前仍无有效疫苗。Ct疫苗研制存在的主要问题有：①灭活疫苗、亚单位疫苗及合成肽疫苗不能有效刺激机体产生特异性粘膜免疫；②疫苗诱发的特异性IgG在体外往往具有较好的中和活性，体内实验却对Ct感染的保护性较差；③抗原在体内维持时间较短，不能有效预防Ct的感染。 减毒沙门氏菌不仅被用于预防沙门氏菌的感染，还可以作为异源抗原的载体，构建成能表达其它病原体保护性抗原的活疫苗，通过口服形成自限性感染，在免疫动物或人体内稳定、高效表达外源抗原，获得相应粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。该类疫苗具有安全、高效、简便和经济等优点。Ct主要外膜蛋白(MOMP)是对Ct感染保护性较好的靶抗原，其编码基因(momp)序列明确，将momp通过与减毒沙门氏菌重组诱发特异性粘膜免疫有可能成为预防Ct感染的有效途径之一。 本研究以D型Ct的DNA为模板，用所设计的特异性引物扩增编码Ct MOMP高变区(VDⅠ～VDⅣ)基因，将扩增产物定向克隆至质粒
张秀香[2]2009年在《表达LTB-MOMP融合蛋白转基因水稻的建立及免疫试验》文中研究指明为了研制一种廉价、方便的鹦鹉热衣原体口服疫苗,本研究以其主要保护性抗原基因momp基因和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位ltb基因为研究对象,分别构建了表达MOMP蛋白和LTB-MOMP融合蛋白的原核表达载体,使其在大肠杆菌中都高效表达。通过小鼠的免疫试验,确定了LTB-MOMP融合蛋白的免疫效果要优于MOMP蛋白单独免疫效果。所以本实验通过前期试验结果,利用分子克隆、农杆菌介导和分子生物学常规检测技术等方法,构建了表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株,试图探索出一种利用水稻作为生物反应器生产鹦鹉热衣原体口服疫苗的免疫途径和作用模式。通过农杆菌介导法,将ltb-momp融合基因导入水稻植株中,通过抗性筛选及整合性鉴定,证明获得了表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株。用间接ELISA的方法测定了转基因水稻叶片中融合蛋白的平均含量可占植物总可溶性蛋白的0.0055%,而在种子中的平均含量为0.0069%。实验中以BALB/c小鼠为哺乳类实验动物模型,用获得的表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株种子在小鼠体内进行了口服免疫实验研究,通过对体液、细胞及粘膜免疫等相关指标的检测,结果表明:口服转基因水稻种子能够诱导小鼠机体产生体液、细胞及粘膜免疫反应,但以细胞和粘膜免疫应答为主。同时,还证明了LTB在转基因水稻口服免疫实验中具有良好的粘膜佐剂效应。通过本实验研究,将为下一步应用表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻在禽源动物体内口服免疫实验研究奠定基础,也为禽类鹦鹉热衣原体病的预防提供新思路。
韩丽[3]2009年在《抑制素新型基因工程疫苗的构建及其免疫效果研究》文中认为抑制素具有抑制促卵泡素合成与分泌的功能,其主动或被动免疫动物,可以促进排卵、提高产仔数,进而提高繁殖力。国内外科学家致力于抑制素疫苗的研究,从天然提取,人工合成,重组表达到基因免疫。基因免疫技术是上世纪90年代发展起来的免疫新技术,与第一代、第二代免疫技术相比,具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点,因而受到广泛重视。前期研究证明,抑制素DNA疫苗具有抑制素蛋白质疫苗的作用,但与蛋白质疫苗相比,抑制素DNA疫苗免疫原性相对较低;之外,目前抑制素DNA疫苗是以抗性基因标记筛选的,而美国FDA组织规定在临床上严禁使用含有抗性基因筛选标记的疫苗。为解决上述问题,本研究选择牛疱疹病毒(bovine herpes virus-BHV-1)的BVP22基因佐剂来增强激素类基因疫苗的免疫效果,主要包括抑制素和生长抑素的基因疫苗。而DNA疫苗的抗性基因则以营养筛选标记替代,且以缺失相关营养标记基因的减毒沙门氏菌为载体传递疫苗,构建成对基因治疗更为有效安全的染色体-质粒平衡致死系统。具体内容如下:(1)BVP22基因佐剂对抑制素DNA疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的抑制素DNA疫苗pEGISI-VP22,将pEGISI-VP22与pEGISI免疫雌性昆明小鼠,结果pEGISI-VP22诱导的ELISA抗体及小鼠的产仔数均显著高于pEGISI免疫组,表明与BVP22融合表达能显著增强抑制素DNA疫苗的体液免疫,并能进一步提高小鼠的繁殖力,是一种极有希望的抑制素新型DNA疫苗。(2)BVP22基因佐剂对生长抑素基因疫苗免疫效果的研究:构建与BVP22融合的生长抑素DNA疫苗pEGS2SS-VP22,体外试验证实pEGS2SS-VP22可表达生长抑素融合蛋白BVP22-S2SS。表达质粒免疫昆明小鼠,发现与BVP22融合能快速增强SS特异性ELISA抗体,提高小鼠的生长速度,表明BVP22能增强生长抑素DNA疫苗的免疫反应。同时验证BVP22基因佐剂是增强激素类基因疫苗免疫反应的新途径。(3)以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗的研究:首先利用asd基因营养筛选标记取代pVAX载体的kan抗性基因筛选标记,成功构建不含抗性筛选标记的真核表达质粒pVAX-asd。从而构建无抗性抑制素真核表达质粒pVAX-asd-IS。该质粒pVAX-asd-IS以减毒菌为载体进行传递,构建成抑制素重组菌C501(pVAX-asd-IS)。口服途径免疫45只小鼠,对其免疫剂量(10~(10),10~9,10~8CFU/mL)、免疫次数(1、2、3)进行比较。结果以10~(10)CFU/mL的剂量仅免疫一次后的小鼠产仔数显著高于其他试验组与对照组。免疫后小鼠可诱导Th1和Th2型免疫反应,以诱导Th2型免疫为主。在试验结束后宰杀小鼠,取其内脏等组织,通过石蜡切片和基因整合等检测方法证明以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素DNA疫苗是安全、有效的。(4)重组菌C501(pVAX-asd-IS)免疫途径(口服、肌注)比较研究。36只小鼠分为6组,免疫后对诱导的体液免疫、粘膜免疫以及细胞免疫中的IL-4和IFN-γ进行比较。结果说明肌注和口服免疫都可诱导机体Th1型和Th2型免疫反应,但肌注效果更好,且能提高产仔数。(5)以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体传递抑制素重组抗原的研究:将抑制素基因片段融合入asd筛选标记原核表达质粒pYA3493中,制备抑制素重组原核表达质粒pYAIS。将质粒pYAIS电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌asar缺失株C500中,制备重组菌C501(pYAIS)。结果表明重组菌C501(pYAIS)能稳定遗传并可表达抑制素重组抗原。分别将重组菌以三个剂量(10~(10),10~9,10~8CFU/mL)和不同免疫次数(1、2、3)口服免疫昆明小鼠,结果显示试验组均产生较高水平IgG抗体。与其他试验组和对照组相比,以10~9CFU/mL剂量免疫三次后小鼠产仔数最高,差异显著。试验中小鼠均无异常临床表现,对机体不存在急性、慢性以及生殖等方面毒性作用。
栗绍文[4]2008年在《猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究》文中进行了进一步梳理流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus,CAB)是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体,孕妇也可感染而发生流产。建立准确、快速的诊断方法和研制安全、高效的疫苗是预防和控制本病的重要措施。本研究应用PCR技术获得CAB主要外膜蛋白(MOMP)全长基因和四种不同片段大小多型性外膜蛋白90(POMP90)的编码基因,构建重组表达质粒,进行原核表达获得重组蛋白,探讨了其在猪CAB感染血清学检测中的应用价值,建立了猪CAB间接ELISA抗体检测方法;并构建了momp基因真核表达质粒,及细胞因子IL-2、IFN-γ编码基因与momp基因真核共表达质粒,比较了pcDNA3.1和PCI-neo两种真核表达载体基因免疫效应的差异,探索了细胞因子和中药提取成分枸杞多糖对基因免疫的佐剂效应。1.本研究根据已知基因序列设计引物,以流产嗜性衣原体CP/12株的总DNA为模板,PCR扩增了momp全长基因和四种不同片段大小的pomp90基因,与pMD18-T载体连接后进行测序鉴定。将目的基因与原核表达载体pGEX-KG进行连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌E.coli BL21中实现了高效表达,表达产物经Western-blot检测分析,结果表明具有较强的免疫原性。进而以纯化后的五种重组蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法,并对临床血清进行了检测。结果表明,重组MOMP蛋白不适合于建立间接ELISA抗体检测方法,而四种重组POMP蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法均具有灵敏度高、特异性好、准确等优点,且克服了传统间接血凝试验低灵敏度、判断主观性强等缺点。2.将momp基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1和PCI-neo,构建真核表达质粒pcDNA3.1-MOMP和PCI-MOMP,并进行了小鼠免疫试验,比较不同真核表达载体构建基因疫苗免疫效应的差异。结果表明,PCI-MOMP可诱导更高的体液免疫效应和微弱的细胞免疫,但未观察到更有效的免疫保护。3.将获得的猪IL-2和IFN-γ编码基因插入真核表达质粒PCI-MOMP中构建真核共表达质粒,并通过小鼠接种试验评价了两种细胞因子通过真核表达质粒混合免疫和基因共表达对基因免疫的佐剂效应。结果表明,两种细胞因子既不能增强体液免疫效应,也未观察到增强的细胞免疫效应和有效的免疫保护。4.将中药提取成分枸杞多糖与真核表达质粒PCI-MOMP同时对小鼠进行免疫,评价了枸杞多糖对基因免疫的佐剂效应。结果表明1,枸杞多糖可显著增强体液免疫效应,但未观察到更高的细胞免疫效应和免疫保护效果。本论文建立了猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法,探索了momp基因疫苗的免疫效应,以及不同真核表达载体对基因免疫效应的影响,细胞因子和枸杞多糖对momp基因疫苗的免疫佐剂效应,并取得了一定效果,为进一步开展猪流产嗜性衣原体病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。
李忠玉[5]2008年在《沙眼衣原体质粒蛋白及预测的包涵体膜蛋白定位与生物学特性研究》文中指出沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)泌尿生殖道感染是世界范围内严重危害公众健康的一种细菌感染性疾病。Ct的生殖道感染常引起女性盆腔炎、宫颈炎等,常引起男性尿道炎、睾丸炎和前列腺炎等。由于无症状性衣原体感染的普遍存在,致使该疾病不易被发现而得不到及时治疗,导致Ct在宿主体内持续存在并引起不孕、异位妊娠等严重并发症,故阐明Ct致病机制,寻找免疫优势抗原基因研制疫苗,是预防、控制Ct感染的关键。质粒蛋白与衣原体毒力直接相关,O'Connell等报道质粒缺失Ct不引起生殖道的病变,说明质粒蛋白在衣原体致病中发挥重要作用。包涵体(Inclusion,InC)膜蛋白能介导衣原体与宿主细胞的相互作用,鉴定新的InC蛋白可为衣原体与宿主细胞相互作用机制提供重要信息。因此,为阐明Ct质粒蛋白致病机理,寻找新的膜定位分子以及研制有效的Ct疫苗,我们进行了以下研究:一、沙眼衣原体质粒蛋白定位与生物学特性分析及质粒蛋白pORF5核酸疫苗免疫效果研究研究目的构建Ct 8种质粒蛋白原核表达载体pGEX-6p-pCTs,制备单克隆抗体和多克隆抗体,旨在分析8种质粒蛋白在衣原体感染细胞中的定位,探讨衣原体致病机理;构建真核表达载体pcDNA3.1-pORF5,与免疫佐剂pcDNA3.1-IL-12以鼻粘膜方式联合免疫小鼠,建立小鼠生殖道感染模型,观察生殖道局部病理变化以及其诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制新型的Ct核酸疫苗提供实验依据。研究方法1、从GenBank中查询Ct质粒蛋白基因序列,设计并合成8对特异性引物,PCR扩增8个质粒蛋白全长基因片段,构建pGEX-6p-pCTs原核表达重组体;重组体经IPTG诱导在E.coliXL1Blue中表达融合蛋白GST-pCTs,Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化融合蛋白;纯化的融合蛋白免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体;间接免疫荧光试验检测8种质粒蛋白在感染细胞中的定位及pORF5在感染细胞中的表达模式及存在方式;ELISA分析比较8种质粒蛋白的免疫原性及pORF5质粒蛋白体外刺激Raw264.7细胞产生细胞因子水平。2、将pORF5基因亚克隆至真核表达载体构建pcDNA3.1-pORF5重组体,以BALB/c为免疫动物,采用鼻粘膜免疫方式进行免疫。将小鼠分为pcDNA3.1空质粒对照组、PBS对照组、pcDNA3.1-IL12对照组、pcDNA3.1-pORF5单独免疫组、pcDNA3.1-pORF5与pcDNA3.1-IL12联合免疫组;ELISA检测血清和生殖道局部抗体滴度和细胞因子产生水平;MTT法检测脾淋巴细胞特异性增殖反应;建立Ct鼠肺炎型(MoPn)生殖道感染模型,检测衣原体生殖道攻击后其清除情况、体重变化及局部组织病理学变化,综合分析pORF5联合疫苗免疫保护效果。研究结果1、以D型Ct基因组为模板PCR扩增得到了8种质粒蛋白全长基因片段;构建了质粒蛋白原核表达系统pGEX-6p-pCTs,原核表达重组体均在E.coli中表达出相应的融合蛋白,各融合蛋白主要以可溶性的形式存在;采用Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化得到了高纯度的8种质粒融合蛋白;制备了8种融合蛋白的多克隆抗体,各抗体效价均在1:6400以上;获得了17株特异性且抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株。2、8种质粒蛋白能与Ct生殖道感染患者血清发生免疫反应,但反应强度、反应频率不同,在所检测的15个病人血清中,pORF5识别所有病人的血清,且免疫反应最强;N端缺失66氨基酸的F6片段在与患者血清ELISA反应中,免疫反应强度与pORF5全长基本相似。3、pORF5在感染细胞中的分布模式与CPAF一致,分布于宿主细胞胞浆中,但也少量分布在EB、RB上,其余7种质粒蛋白与MOMP的分布模式相同,分布于衣原体菌体上;pORF5在Ct感染后12h就有表达,常以单体、三聚体、多聚体的形式存在;胞浆表达pORF5不影响其后Ct的感染(p>0.05)。4、pORF5蛋白诱导Raw264.7细胞产生TNF-α、IL-6、IL-8的水平随着pORF5浓度的升高而增多,当pORF5蛋白的浓度升为10μg/mL时,TNF-α、IL-6、IL-8的产生量分别为1658.87±255.34pg/mL、7511.55±720.13 pg/mL、4643.20±412.24 pg/mL。5、pORF5单独免疫组、pORF5与IL-12联合免疫组血清抗体随着接种次数的增多,滴度逐渐升高。第一次免疫后第3w部分小鼠血清中可明显检测到特异性抗体,第6w特异性抗体升高显著,血清抗体持续升高,直至第9w抗体产生水平基本稳定,联合免疫组血清抗体总量及IgG2a抗体升高显著,对照组的抗体未出现明显变化;同时,pORF5联合免疫组生殖道局部粘膜抗体显著高于单独免疫组。5组中以联合免疫组IFN-γ产生水平最高,淋巴细胞增殖反应最强。6、pORF5单独免疫组、pORF5与IL-12联合免疫组MoPn感染后体重下降较慢,恢复较快,分别在接种后第15d、12d体重恢复正常,3组对照组在接种MoPn后第21天体重恢复正常。pORF5单独组、pORF5与IL-12联合免疫组清除Ct的速度较早,分别在接种MoPn后第24d、18d完全清除,而对照组在接种MoPn后第30d完全清除。7、3组对照组小鼠输卵管壶腹部、峡部肿胀,管壁血管扩张充血,管腔内充满透明液体,输卵管单侧或双侧积水;免疫组化结果显示粘膜柱状上皮细胞成矮柱状,顶部纤毛显著减少或消失,浆膜层毛细血管扩张,大量淋巴细胞、浆细胞浸润;pORF5单独免疫组出现输卵管管壁增厚,炎性细胞浸润,联合免疫组病理改变最轻;空质粒组,IL-12组、PBS组小鼠炎症积分分别为3.0±0.4、2.6±0.4、2.4±0.3明显高于pORF5单独免疫(1.5±0.3)、pORF5与IL-12联合免疫小鼠(0.8±0.2)。结论1、成功地构建了8种质粒蛋白pGEX-6p-pCTs原核表达载体,并均在E.coli XL1Blue中表达出相应的融合蛋白;成功地制备了17株分泌质粒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体具有特异性。2、8种质粒融合蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。3、在自然感染状态下,Ct 8种质粒蛋白基因均被激活产生内源性靶蛋白,其中,pORF5免疫原性最强;pORF5为构象依赖性抗原;在天然状态下以单体、三聚体、多聚体等多种形式存在宿主细胞中。4、首次证实pORF5为一种分泌性蛋白,这是继CPAF以来迄今所发现的衣原体第二种分泌性蛋白,而其它7种蛋白均位于衣原体菌体上。5、pORF5能刺激RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-6、IL-8等前炎症细胞因子,并具有剂量依赖性。6、首次将pORF5核酸疫苗与IL-12联合免疫小鼠,该联合疫苗能刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,减少输卵管炎性病理改变,显著改变衣原体感染的正常进程,发挥了免疫保护作用。二、沙眼衣原体预测的包涵体膜蛋白定位及特性研究研究目的构建50种预测的Ct包涵体膜(InC)蛋白基因原核表达载体pGEX-6p-InCs,制备多克隆抗体,分析50种预测的InC蛋白在衣原体感染细胞中的定位及生物学特性,为阐明Ct致病机理提供实验依据。研究方法1、从GenBank中查询预测的Ct InC基因序列,设计并合成50对特异性引物;PCR扩增50个膜蛋白基因片段,构建pGEX-6p-InCs原核表达重组体,重组体经IPTG诱导在E.coli XL1Blue中表达融合蛋白GST-InCs;Glutathione Sepharose 4B Beads亲和层析纯化融合蛋白,Western-blot分析鉴定表达产物。2、纯化的融合蛋白与弗氏佐剂充分乳化后,腹腔免疫3～6周龄的BALB/c鼠,制备多克隆抗体,ELISA鉴定50种预测的InC免疫原性;间接免疫荧光实验分析预测的膜蛋白在感染细胞中的分布;同时,检测Ct在自然感染状态下,InCs的表达情况及机体针对InC蛋白所产生抗体滴度水平。3、将免疫优势InC基因分成N、C片段,重新克隆构建pGEX-6p-InC/N重组体;所获得的片段分别在E.coli XL1Blue诱导表达GST融合蛋白;Western blot鉴定其免疫原性部位,确定免疫优势表位。4、将50种预测的膜蛋白基因克隆到pDSRed-C1真核表达载体中,构建真核表达载体重组体pDSRed-C1-InCs,重组体转染Hela细胞表达RFP融合蛋白,该RFP融合蛋白用于检测小鼠产生的抗融合蛋白抗体的特异性及分析胞浆表达的RFP-InCs蛋白对衣原体感染的影响。研究结果1、成功地构建了pGEX-6p-InCs原核表达载体,并均在E.coliXL1Blue中表达出相应的重组融合蛋白;Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到了较高纯度的融合蛋白;重组融合蛋白具有较强的免疫原性,能刺激小鼠产生较高滴度的抗体。2、成功地构建了pDSRed-C1-InCs真核表达载体,各基因均在HeLa细胞胞浆部位表达靶蛋白;胞浆表达CT119能显著抑制Ct感染率,在转染阳性的HeLa细胞中衣原体的感染率为29.3±9.5%,而在转染阴性的HeLa细胞中衣原体的感染率为64.1±15.4%。而其它49种预测的InC蛋白不影响衣原体的感染率(P>0.05)。3、CT089、CT115、CT116、CT118、CT119、CT147、CT223、CT225、CT226、CT228、CT229、CT442、CT529、CT618、CT813等15种包涵体蛋白与病人血清发生较强的免疫反应,为免疫优势抗原。进一步分析15种包涵体蛋白的免疫原性部位,发现除了CT223,CT529、CT618抗原表位定位于N端外,其余InC蛋白的抗原表位定位于C端。4、CT225、CT228、CT358、CT440分布模式与CT119相似,定位于包涵体膜上,为InC蛋白;CT058、CT192、CT195、CT383、CT484、CT565、CT850分布模式与MOMP、HSP60相似,为衣原体菌体蛋白。结论1、首次证实CT225、CT228、CT358、CT440为包涵体膜蛋白,CT058、CT192、CT195、CT383、CT484、CT565、CT850为衣原体菌体蛋白。2、多数InC蛋白具有较强的免疫原性,可作为疫苗的侯选抗原。3、InC蛋白的免疫原性主要定位于C端。4、胞浆表达的RFP融合蛋白,除了CT119外,其它49种预测InC蛋白不影响衣原体的感染。
王雪鹏[6]2009年在《迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的构建及动物免疫试验》文中认为迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是危害水产养殖的病原菌之一,可引起多种类型的感染,致病机理复杂。由迟缓爱德华菌引起的疾病在世界海水、淡水养殖动物中普遍流行。化学药物是治疗迟缓爱德华菌感染的一种重要手段,但又会引起食品药物残留、细菌耐药性等问题。尽管预防迟缓爱德华菌感染的疫苗报道很多,但这些常用疫苗多是福尔马林(或热)灭活疫苗或亚单位疫苗,影响了细菌表面抗原的物理化学结构,影响了疫苗的免疫效果,而一些亚单位疫苗又缺少足够的免疫原性,常需加入免疫佐剂使用,而这些免疫佐剂有可能具有副作用。细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳,因其保持了细菌原有的细胞形态、细菌表面抗原性和黏附性等特性,即使象菌毛一样脆弱的结构也能被保护。同时,菌蜕包含LPS、类脂、肽聚糖等天然的免疫刺激复合物,无须使用佐剂。因此,菌蜕疫苗能诱导更强的免疫反应,是一种比常规疫苗更理想的新型疫苗体系。本研究首次在国内报道迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的制备及应用。1迟缓爱德华菌制苗菌株的筛选通过形态学观察、选择性培养基筛选、生理生化分析、PCR鉴定及16S rDNA序列测定,证明本实验室保存的细菌为迟缓爱德华菌。应用PCR方法检测了迟缓爱德华菌的6个毒力基因在国内外分离株中的分布情况,并根据其溶血活性、对斑马鱼和小鼠的致病性研究,筛选出强毒株,为进一步后续研究奠定了基础。2迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的制备本研究成功构建溶菌质粒载体,并将其转入迟缓爱德华菌真鲷分离株,通过温度诱导并跟踪检测其溶菌动力学过程,制备出迟缓爱德华菌菌蜕疫苗。扫描电镜和透射电镜观察,证实细菌结构未改变,且不含内容物。3以小鼠动物模型评价迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的口服免疫效果分别用菌蜕疫苗(ETG)、福尔马林全菌灭活疫苗(FKC)和PBS口服免疫小鼠,并跟踪检测其体液免疫水平和细胞免疫水平的变化。结果表明,ETG免疫组血清IgA和IgG的抗体滴度与FKC和PBS免疫组相比,差异显著；ETG免疫组小鼠外周血淋巴细胞中CD3+／CD4+／CD8+阳性的百分率与FKC和PBS免疫组相比,差异显著。同源菌攻击试验表明,ETG、FKC和PBS组的相对保护率分别为86.7%(26／30),73.3%(22／30)和33.3%(10／30)。结果表明,ETG疫苗能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫,提高免疫保护能力。4迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对斑马鱼的免疫保护试验详细阐述研究斑马鱼白细胞吞噬活性的方法,并研究了迟缓爱德华菌蜕疫苗对斑马鱼白细胞吞噬活性的影响。试验表明,ETG免疫组的白细胞吞噬活性明显高于FKC和PBS免疫组,差异显著。攻击试验结果显示,ETG的免疫保护率高达83.3%(25／30)与FKC和PBS免疫组的70%(21／30)和6.7%(2／30)相比,差异显著。结果表明,ETG疫苗能有效地激活鱼类的免疫系统,产生免疫保护。5应用裂解基因和核酸酶基因共表达制备菌蜕疫苗葡萄球菌核酸酶A(SNA)对单链、双链DNA或RNA均具有较强的降解能力。成功构建表达葡萄球菌核酸酶A不同片段的质粒载体,通过诱导表达发现酶活性只与N’末端氨基酸序列有关,并发现编码SNA N’末端26个氨基酸的序列与λ噬菌体Cro基因融合表达可以降解细菌核酸,又可以被入噬菌体的cI857ts／PR调节系统调控。因此,利用这一技术成功构建调控噬菌体裂解基因和葡萄球菌核酸酶基因先后表达的质粒载体,制备出安全性更高的菌蜕疫苗。
刘开云[7]2011年在《减毒鼠伤寒沙门菌为载体的幽门螺杆菌治疗性疫苗实验研究》文中指出幽门螺杆菌(H.pylori)是一种定植于人胃和十二指肠粘膜的螺旋形革兰阴性菌,主要导致慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌。目前临床治疗H.pylori感染的方案,多采用包括两种抗生素和一种质子泵抑制剂的“三联疗法”,在一定程度上能清除H.pylori感染并治愈溃疡。虽然抗生素在短期内具有较好的根除疗效,但抗生素的滥用已导致H.pylori耐药率逐年上升。H.pylori高耐药性是导致根除治疗失败的最主要原因,长此以往,可能出现H.pylori感染无药可治的严重后果。此外,抗生素疗法还存在治疗后易复发、可再感染和肠道菌群微生态失衡等不足,大大限制了其使用。在临床上H.pylori高耐药性的条件下,新抗生素因其研发周期长难以满足临床用药需求,因此,寻求非抗生素的替代疗法已迫在眉睫。目前,国际上针对H.pylori感染已广泛开展免疫治疗研究,动物和人体试验结果表明,免疫治疗具有清除H.pylori的效果,提示治疗性疫苗有希望成为治疗或辅助抗生素治疗H.pylori感染的方法。H.pylori全菌疫苗(包括灭活全菌和全菌裂解物为抗原的疫苗)非常有效。然而,这种以全菌组分作为抗原的疫苗方式有着严重的局限性,比如菌体中LPS和Lewis抗原可能导致内毒素血症、炎症反应和自身免疫性疾病等严重后果。以重组亚单位为抗原的疫苗和表位疫苗都表现出较好的抗H.pylori作用。目前已经确定了一些H.pylori保护性抗原(如UreB、CagA和VacA等),已作为候选抗原用于开发H.pylori疫苗。自然感染H.pylor后,引起Th1细胞活化,导致胃粘膜发生炎症损伤甚至溃疡。机体通过Treg细胞抑制胃粘膜过强的免疫应答,这有利于胃粘膜炎症损伤的修复,但同时使免疫系统对H.pylor处于免疫耐受状态。CD4+T细胞在抗H.pylori保护性免疫中发挥重要作用的观点已被广泛接受,大多数研究表明:高水平Th1偏向应答是保护性免疫和清除H.pylori感染必需的。治疗性疫苗要立足于打破机体对H.pylor的免疫耐受,诱导以Th1为主的CD4细胞免疫应答,产生高水平IFN-γ等细胞因子,进一步激活巨噬细胞等天然免疫,同时诱导粘膜sIgA应答,发挥清除H.pylori感染和预防再感染的作用。口服沙门菌载体疫苗可以诱导典型的Th1型应答,同时还能诱导显著的粘膜sIgA产生。此外,沙门菌还可以通过微皱细胞(microfold cell,M细胞)的转胞吞作用或通过树突状细胞(dendritic cell,DC)直接提呈抗原诱导粘膜免疫应答。已有大量文献报道,表达外源蛋白抗原的减毒沙门菌活载体疫苗用于抗不同的病原体(包括病毒、细菌和寄生虫)感染,在动物模型实验中均取得了良好的效果。相关的研究表明,口服免疫重组沙门菌疫苗具有安全性好,免疫原性良好的特点。全长的H.pylori蛋白分子作为疫苗抗原含有非必要的抗原表位,而且分子量较大,难以表达和纯化。而融合表位抗原易于表达和纯化,融合蛋白疫苗是一种新的疫苗策略,可用于增强对多抗原组分的优势抗原表位的特异性免疫应答。【研究目的】1.本研究拟在H.pylori感染的小鼠模型体内评价表达不同抗原表位融合蛋白的减毒沙门菌载体疫苗的治疗效果。2.初步明确Th1和Th2细胞应答在疫苗免疫清除H.pylori感染中的作用。【研究方法】1.构建表达H.pylori按不同顺序排列的CagA、VacA和UreB抗原表位融合蛋白的减毒沙门菌载体疫苗,在H.pylori感染的小鼠模型体内评价其疗效。2.Real-time PCR检测免疫治疗后小鼠胃内H.pylori定植量改变,ELISA检测血清、胃和小肠样本中的特异性抗体水平变化,ELISA检测小鼠脾淋巴细胞IL-4和IFN-γ表达量的差异。【研究结果】1.口服表达抗原表位融合蛋白CagA160-VacA62-UreB138 (CVU)的减毒沙门菌免疫治疗效果最好,清除率达62.5%,未清除小鼠胃内H.pylori定植量与空质粒菌组相比较显著降低。2.疫苗免疫后Th1应答与未免疫组相比较显著增强;疫苗免疫后H.pylori特异性抗体应答与未免疫组相比较显著增强。【结论】本研究结果表明:减毒沙门菌载体疫苗对H.pylori感染具有显著的免疫清除作用,免疫保护效果与特异性CD4 + T细胞Th1型应答、血清IgG和粘膜sIgA抗体的应答相关,且其疗效与融合表位蛋白的排列顺序有关。表达的抗原表位融合蛋白CVU的减毒沙门菌载体疫苗,疗效优于其他排列方式,可能成为抗H.pylori的候选疫苗。
蔺国珍[8]2012年在《布鲁氏菌病LAMP检测方法的建立及双基因共表达分子疫苗研究》文中认为布鲁氏菌病，简称布病（Brucellosis），是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种的人畜共患传染病。目前，该病已在世界范围内广泛流行，并呈一定上升态势，严重危害畜牧业发展和人类健康。建立方便快捷的布鲁氏菌检测技术，研发安全有效的新一代布病疫苗已成为控制和消灭动物布病的必然趋势。本研究主要内容如下：1.选择布鲁氏菌OMP25诊断基因和P39、18KD、L7/L12和BCSP31优势抗原基因，扩增后分别与pMD18-T载体连接，制备了克隆质粒。分析比对GenBank中OMP25基因序列，设计2套特异性引物，通过反应物浓度和反应条件的优化，建立了布鲁氏菌快速检测LAMP方法。该方法能从奶样和血样中检出6个种的布鲁氏菌病原，所能检测出的最低限度为9fg/μl，较PCR方法高出10倍，具有很高的特异性、敏感性和稳定性。对田间样品进行检测发现，LAMP方法与巢式PCR方法符合率达98.95%，可为临床布鲁氏菌的快速检测提供新的技术手段。2.借助pQCXIX和pcDNA3.1真核载体，成功构建了P39和18KD双基因共表达核酸质粒pcDNA-P39/18KD。体外转染293AD细胞，经RT-PCR鉴定、间接免疫荧光和Western blot检测，证实P39和18KD目的蛋白可在293AD细胞中有效共表达，反应原性良好。3.经测序鉴定成功构建了L7/L12和BCSP31双基因穿梭载体pSh-LL/BP。然后与复制缺陷型Ad5腺病毒于BJ5183工程菌内同源重组，成功筛选到腺病毒重组子质粒pAd-LL/BP。将其转染293AD细胞，成功包装并纯化出共表达重组腺病毒Ad-LL/BP，滴度达10~(9.68)TCID50/mL。连续传代后经PCR检测、电镜观察、IFA、Western blot等实验证实该重组病毒没有发生外源基因缺失，两个目的蛋白获得了稳定共表达，且反应性良好。4.以上述构建的共表达DNA疫苗和腺病毒载体疫苗单独和联合免疫BALB/c小鼠，共免疫三次。ELISA检测血清特异性抗体发现，各免疫组均能产生IgG特异性抗体，联合免疫组显著高于单独免疫组，抗体水平最高的为pcDNA-P39/18KD（prime）和Ad-LL/BP（boost）组，最低的为pcDNA-P39/18KD组；除IgA外，IgG、IgG1、IgG2a水平随免疫次数和免疫时间增加逐渐升高，IgG2a较IgG1升高更快（p<0.05）。MTT法检测脾淋巴细胞增殖指数（SI）显示，抗原和ConA刺激均能使各组SI升高，但以ConA略高（p>0.05），组间对比Cp>V3>V4>V1>V2>Cn。FCM脾脏T淋巴细胞亚群分析显示，除CD~(8+)及CD~(4+)/CD~(8+)外，各疫苗免疫组CD3+、CD4+脾脏T淋巴细胞数均显著升高（P<0.05），联合免疫组显著高于其单独免疫组。ELISA检测脾淋巴细胞诱导上清IL-12和IL-10显示，联合免疫组IL-12水平，DNA/Ad和Ad/DNA分别为70.7±8.1pg/mL和64.2±7.5pg/mL，明显高于单独DNA免疫组36.4±4.4pg/mL或重组腺病毒免疫组38.7±5.15pg/mL，但都低于A19弱毒苗免疫组85.3±8.2pg/mL（p<0.05）；而各组IL-10水平与阴性对照组相比，均无显著差异（p>0.05）。由此可见，本研究所构建的双基因表达DNA疫苗和腺病毒活载体疫苗均能产生高水平的IgG抗体，能有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应。首次证实布鲁氏菌DNA和重组腺病毒疫苗联合免疫效果优于单独免疫，以pcDNA-P39/18KD（prime）和Ad-LL/BP（boost）免疫效果最好。
潘志明[9]2004年在《重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究》文中研究表明减毒细菌，包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、李斯特菌等，以它们作为疫苗载体可运送表达的外源抗原或DNA疫苗到宿主特定的免疫器官和细胞，激发机体产生保护性的体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫。但是目前对重组细菌诱导机体针对CD8~+T细胞表位应答的细胞和分子机理还不清楚，这方面的免疫生物学研究，对于理性地设计疫苗，特别是针对胞内病原体引发的疾病以及肿瘤新型基因工程疫苗研制具有重要的意义。为此，本研究以减毒大肠杆菌13A和25A以及减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207为载体，构建了运送卵清白蛋白(OVA)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)CD8~+T细胞表位的重组细菌，试图阐明重组细菌体外诱导CD8~+T细胞应答的规律。 新城疫(ND)是危害养禽业的主要传染病之一。虽然常规疫苗对控制ND的发生和流行起到了非常重要的作用，但也存在难以克服的缺点，如生产成本高、有散毒危险等。为研制一种安全、高效、廉价的新型基因工程粘膜疫苗，本研究对鹅源新城疫病毒(NDV)JS5分离株的F基因进行了克隆、序列分析，在此基础上，构建了运送NDV DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门氏菌，并对其免疫生物学特性作了探讨。 1．重组减毒细菌运送CD8~+T细胞表位的机理研究 以脂质体为载体，将真核表达质粒pG2F、pDG2F或pG1B运送到抗原提呈细胞LK~b和LL~d中，经流式细胞术(FACS)检测，质粒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因在细胞中获得了表达。抗原提呈结果显示，OvA257一264和LCMV 1 18一132CDS+T细胞表位基因在抗原提呈细胞(APC)中表达后，可被APC直接加工、提呈给特异性T细胞杂交瘤B3Z和nVIH7，并刺激T细胞杂交瘤分泌产生了IL一2。而且，随着外源基因表达量的增多，其后所获得的抗原提呈效应也相应增强。此结果说明，重组质粒pGZF、pDGZF和pGIB构建正确，即抗原表位基因无论是连接在GFP基因的N末端还是C末端，都能获得成功表达。 感染试验证实，减毒大肠杆菌13A和25A以及减毒沙门氏菌sL7207对LKb细胞或LLd细胞均具有良好的侵袭能力;而且骨髓源树突状细胞(BMDC)对重组大肠杆菌具有很好的摄取功能。三种细菌载体均能向LKb或LLd细胞运送真核表达质粒pGZF，并且外源GFP基因获得表达，但是对于不同的细胞类型，细菌的运送效率存在差异。 LKb和LLd细胞对原核表达的cDS+T细胞表位的抗原提呈结果显示，LK”细胞经重组大肠杆菌x3A(ptGZF)和重组沙门氏菌SL7207(ptGZF)、SL7207(pDGZF)感染作用，在感染早期(Zh)，LK“细胞可提呈13A和sL7207表达的ovA257一264cDS+T细胞表位，在感染晚期(48h)，这一提呈效应降低;LLd经重组大肠杆菌13A(ptGZF)感染，在感染早期(Zh)，LLd细胞能提呈13A表达的LeMvl一s一132CDS+T细胞表位，且随着感染时间的推移，提呈效应随之增强。鉴于25A(PtGZF)感染的LK”和LLd细胞均未能有效地刺激相应的T细胞杂交瘤，说明25A没有成功地运送两个T细胞表位。 在LK”和LL“细胞对细菌运送的真核表达质粒的抗原提呈试验中发现，重组大肠杆菌13A(pGZF)和25A(pGZF)感染L对细胞Zh，L砂细胞就可将其表达的OVA CDS+T细胞表位提呈给B3ZT细胞杂交瘤，在感染48h时，提呈效应获得温和的增强;经重组沙门氏菌sL7207(pGZF)处理的LKb细胞，在早期(Zh)缺乏刺激相应T细胞杂交瘤的能力，但在晚期(48h)则表现出提呈ovA cDS+T细胞表位的活性。这说明，13A和25A所携带的hly基因有助于真核表达质粒在细胞中的释放和表达。 BMDC对减毒大肠杆菌运送的T细胞表位的抗原提呈结果表明，BMDC经13A(ptGZF)和13A(pGZF)作用后，均能有效提呈OVA257一264和LCMV 118一132CDS+T细胞表位给相应的T细胞杂交瘤，而且在同样的作用条件下，BMDC对13A运送的抗原表位的提呈效应要强于LK”和LLd细胞;由于25A(PtGZF)和25A(pGZF)感染的BMDc未能有效地刺激两种T细胞杂交瘤，说明LPS缺失的25A刺激BMDC成熟的能力不强。2.携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 以RT一PCR扩增出NDv JSS株融合蛋白(F)基因，将PCR产物克隆入pGEM一Teasy vector，获得重组质粒pGEM一TF。序列测定表明，克隆的F基因全长1 679bp，编码由553个氨基酸组成的前体蛋白F。。在第116一117位氨基酸处，F。被切割成Fl和F:多肤，切割位点的序列为RRQKR 4F，具有强毒株的明显特征。FO中有3个主要由硫水性氨基酸组成的重要功能区，其中F:多肤N端起信号肤作用，介导蛋白质跨膜转位;Fl多肤的N端是起融合作用的主要部位;Fl亚单位的C端为跨膜区。在F。氨基酸序列中，存在6个潜在的糖基化位点和12个半肤氨基酸残基。对F。氨基酸序列同源性比较发现，JSS株与其它鹅源NDV毒株的同源性在97.5%一98.6%之间;与鸡源NDV强毒分离株的同源性在93.1%一98.0%。由于JSS株与上述分离株的F蛋白具有较高的同源性，且主要功能区保守，因此其F基因可以作为构建DNA疫苗的目的基因。 将F基因从pGEM一TF中切出，克隆入真核表达质粒pVAXI中，酶切电泳鉴定正确，获得重组表达质粒pVAXI一F。pVAXI一F经脂质体转染cos一7细胞，间接免疫荧光试验检测出F基因在COS一7细胞中的表达产物。通过电穿孔转化法
杨志军[10]2008年在《我国慢性传染病预防与治疗监测的经济学分析》文中指出传染病是世界范围内引起死亡最多的疾病,也是我国死亡率最高的三类疾病之一。医学技术的进展使传染病的预防与控制取得了重要成果。传染病预防与治疗监测进行经济学分析对传染病防治和医学技术发展策略的制定具有重要意义。本文的目的是建立传染病预防与治疗监测经济学分析的数学模型,并分析和评估我国慢性乙型肝炎的预防和治疗监测技术的经济学影响。本文的第一章为绪论,简要介绍了本文的研究背景、研究内容和研究方法以及拟解决的关键问题。同时对文章的结构安排进行了说明。本文的第二章为文献综述,对传染病的经济负担、卫生经济学中的评估工具、慢性传染病防治技术的发展、卫生经济学中关于生产和成本研究、新技术的扩散、新技术的评价以及我国慢性传染病防治研究的现状进行了综述,完整介绍了国内外在本文相关领域的研究成果,为本文的研究提供了充分的背景资料。本文第三章建立了模拟传染病扩散和估算我国慢性传染病经济负担的数学模型。传染病扩散模型可以估算人群中感染者、易感染和健康者的数量,估算传染病经济负担的模型可以根据感染者所处的不同疾病状态的直接和间接成本估算出疾病负担。据此估算的我国2007年慢性乙型肝炎的直接医疗成本高达367亿元人民币。如果不进行免疫预防,我国2007年出生的人口在将来造成的经济损失高达1154亿元人民币。在此之前,本章还分析了我国经济法发展与传染病控制的相关关系。第四章建立了分析疫苗免疫技术经济学影响的数学模型,并对我国乙型肝炎疫苗免疫的经济学影响进行分析和评价。根据最新公布的慢性乙肝调查数据,通过成本-效果分析、成本-效益分析和成本-效用分析,证明疫苗免疫的经济效果非常显著,每年可以节约50多亿元人民币的治疗费。第五章建立数学模型对慢性传染病治疗监测进行经济学分析和评价。建立了确定最佳耐药检测时间的数学模型、确定定性检测条件下更换治疗方案的最优策略的数学模型、确定定量检测条件下更换治疗方案的最优策略的数学模型以及不同检测方法比较评价的数学模型。确定拉米夫定耐药监测时间间隔,分析和评估拉米夫定耐药检测经济学影响,发现如果采用慢性乙型肝炎治疗监测手段,每年可以节约治疗费用5亿多元人民币。最后一章给出本文的如下结论:(1)现阶段我国传染病发病率与国内生产总值和国家财政支出呈显著负相关,病死率与农村恩格尔系数呈显著正相关;(2)我国慢性传染病的经济负担非常沉重,采用疫苗预防具有很高的经济效果;(3)采用本文建立的马尔科夫决策模型和增量成本效果分析模型可以对慢性传染病的预防与治疗监测进行经济学分析和评价;(4)我国慢性乙型肝炎的经济负担十分严重,采用疫苗免疫和合适的治疗监测可以节约大量治疗费用。文章的最后根据研究结果提出了对我国传染病防治与医学技术发展的政策建议。本文的主要创新之处卫生技术经济学分析的研究在我国处于刚刚起步阶段,有许多理论和实践的具体问题需要探索和研究。本论文针对我国慢性传染性疾病的预防和控制的特点,建立评估我国传染病经济负担的数学模型、评价传染病预防技术及策略的数学模型和评价传染病治疗监测的数学模型,同时详细估算了我国慢性乙型肝炎的经济负担、预防技术和策略的经济学影响和治疗监测技术的经济学影响。主要创新点有以下几个方面:1、建立了确定慢性传染病治疗监测最优策略的数学模型:国内外的研究人员虽然对疾病负担、预防技术、诊断技术和治疗技术的评估进行了广泛研究,但对治疗监测技术的经济学分析缺乏深入研究,这可能与治疗监测技术仅仅在最近几年才得到迅速发展有关。本论文应用马尔可夫决策方法建立了确定慢性传染病治疗监测最优策略的数学模型,为更加有效地治疗慢性传染性疾病、降低医疗费用和节约卫生资源提供了理论依据。2、建立了确定慢性传染病最佳治疗监测时间的数学模型:虽然对慢性传染病的治疗效果进行监测已经成为临床专家的共识,但目前对治疗监测时间的确定仍然基于专家的经验判断,缺乏理论上的支持。本论文采用决策分析方法,建立了确定慢性传染病最佳治疗监测时间的数学模型,为慢性传染病的治疗监测提供了理论依据。3、建立了对慢性传染病治疗监测技术进行经济学分析的数学模型:治疗监测技术是近几年发展起来的基于药物基因组学的新技术,其临床应用的范围日益扩大,但对其进行经济学分析的研究尚未见报道。本文采用成本-效益分析方法建立了对治疗监测技术进行经济学评价的模型,为进一步研究慢性疾病治疗监测策略的经济学意义奠定了基础。4、系统分析了我国慢性乙型肝炎的经济负担、预防技术和策略的经济学影响以及慢性乙型肝炎治疗监测技术的经济学影响:我国是慢性乙型肝炎重负担国家,但目前仍缺乏对我国慢性乙型肝炎的经济负担估算的系统研究。对免疫预防技术的评估也仅限于城市区域,对慢性乙型肝炎治疗监测技术的经济学分析的研究尚未见报道。本文采用我国2006年慢性乙型肝炎全国普查的最新资料(本资料于2008年4月21日公布)对我国慢性乙型肝炎的经济负担进行估算,并根据我国乙型肝炎免疫规划分析疫苗免疫接种的经济学影响,同时还对目前的慢性乙型肝炎治疗监测策略进行经济学分析和评价,为我国慢性乙型肝炎的预防和控制决策提供了具体的资料。
参考文献：
[1]. 沙眼衣原体重组口服活疫苗的构建及其免疫学特性的初步研究[D]. 白光春. 第四军医大学. 1999
[2]. 表达LTB-MOMP融合蛋白转基因水稻的建立及免疫试验[D]. 张秀香. 吉林大学. 2009
[3]. 抑制素新型基因工程疫苗的构建及其免疫效果研究[D]. 韩丽. 华中农业大学. 2009
[4]. 猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究[D]. 栗绍文. 华中农业大学. 2008
[5]. 沙眼衣原体质粒蛋白及预测的包涵体膜蛋白定位与生物学特性研究[D]. 李忠玉. 中南大学. 2008
[6]. 迟缓爱德华菌菌蜕疫苗的构建及动物免疫试验[D]. 王雪鹏. 南京农业大学. 2009
[7]. 减毒鼠伤寒沙门菌为载体的幽门螺杆菌治疗性疫苗实验研究[D]. 刘开云. 第三军医大学. 2011
[8]. 布鲁氏菌病LAMP检测方法的建立及双基因共表达分子疫苗研究[D]. 蔺国珍. 中国农业科学院. 2012
[9]. 重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究[D]. 潘志明. 扬州大学. 2004
[10]. 我国慢性传染病预防与治疗监测的经济学分析[D]. 杨志军. 上海交通大学. 2008
标签：基础医学论文; 衣原体论文; 特异性论文; 融合蛋白论文; 沙眼衣原体论文; 抗原抗体反应论文; 抗原表位论文; 细胞免疫论文; 重组蛋白论文; 抗原抗体论文; 基因合成论文; 免疫学论文; 免疫策略论文; 免疫抑制论文; 质粒载体论文; 融合基因论文; 问题疫苗论文; dna提取论文; 生物技术论文; igg抗体论文;