河南省许昌县疾病预防控制中心 河南许昌 461000
【摘 要】聚合酶链式反应（PCR技术）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。本文采用该反应设计研究绿脓杆菌的快速检测方法，设计绿脓杆菌特异性的PCR扩增ETA基因序列设计的，同时考察该PCR方法的特异性和敏感性。另外，一种不提取基因组DNA而直接制备简易模板的直接PCR方法。研究表明PCR技术的应用能够快速简便的检测出绿脓杆菌的存在及鉴定。
【关键词】绿脓杆菌；PCRETE1；决速检测
1、前言
绿脓杆菌是一种非常常见的治病细菌，在空气、水、土壤中都有分布，会导致人们的皮肤化脓感染，如果有烧烫伤和眼部疾病的患者感染了这种细菌，会让加剧病人的病情，严重者还会导致败血症。
绿脓杆菌的检测，大多是建立在这种细菌的生物学特征的基础之上：绿脓杆菌属于革兰氏阴性杆菌，其氧化酶呈阳性，会有其独特的绿脓菌素产生[1-3]。另外，绿脓杆菌的生存条件是在42℃，并且有还原性，可以把硝酸盐还原成亚硝酸盐。这种检测方法在实际操作中需要耗费大量的时间与精力，如果样品量比较多，这种方法的缺点就暴露无疑，效率低下，并且在临床上还有可能延误诊断和治疗。所以急需一种能够高效率的绿脓杆菌检测方法。分子生物学的发展，为细菌、病毒基因的检测带来了新的契机，并且可以大大提高检测和鉴定效率。Saint-Onge等和Mayer 分别提出了利用PCR技术检测绿脓杆菌。本文在此基础上，也提出一种绿脓杆菌的PCR检测技术，这种技术主要是利用绿脓杆菌外毒素A（ETA）基因。
2、材料与方法
2.1材料
2.1.1菌株 绿脓杆菌ATCC15442由湖北省疾病预防控制中心赠；其它实验菌株均为本实验室从环境样品中采集分离所得。
2.1.2培养基 营养肉汤培养基、普通琼脂平板培养基。
2.1.3试剂 TaqDNA聚合酶、dIVTPs琼脂糖、DNAmaker均购自武汉天源生物有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品。
2.1.4PCR扩增引物 两个特异性引物参照Khan等，根据已报道的绿脓杆菌ETA基因序列设计，扩增该基因上一段396by的区域。ETA1和ETA2的序列分别为：5、-GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC-3、和5、-CGCTGGCCCA'FTCGCTCCAGCGCT-3、；委托上海博亚生物技术有限公司合成。
2.2方法
2.2.1绿脓杆菌增菌培养 用无菌接种环挑取绿脓杆菌（ATCC15442）接种到50ml营养肉汤培养基中，置37℃摇床过夜培养。
2.2.2分离培养从增菌液中挑取培养物，划线接种在普通琼脂平板上，置37℃培养18-24h。
2.2.3基因组DNA提取细菌基因组DNA的提取采用细菌DNA抽提试剂盒（上海华舜）来完成。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆整个提取步骤参照其产品说明书进行，1ml过夜培养至对数生长期菌液经过切破壁及ProteinaseK消化后上柱，DNA与吸附膜特异性联结，而绝大部分RNA蛋白质及其它杂质被离心去除。再经过洗涤更彻底去除杂质后，用2mmol/LTris将DNA从吸附膜上洗脱下来。提取的DNA用含有EB的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用分光光度计测定其浓度和纯度。
1.2.4PCR反应简易模板的制备用无菌牙签从分离培养平板上挑取少量菌体重悬于20μ1无菌ddH2O中，沸水中煮沸l0min立即置于冰上5min4℃。10000g离心5min立即置于冰上，使用时取20μ1上清直接作为PCR反应的模板。
3.结果
3.1PCR反应的特异性
3.21PCR反应的特异性
本实验根据已经报道的绿脓杆菌ETA基因序列来设计PCR反应所需要的ETA引物，并且利用绿脓杆菌与别的的细菌基因组的DNA分别作为模板，来设计PCR反应实验，用这种方法来确定这种绿脓杆菌的特异性。PCR反应后会得到新的产物，我们需要对这些产物进行检测，本实验采用的是琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示：在所有参与PCR的细菌中，只有绿脓杆菌的产物中含有396by带型清晰可辨的DNA条带。这个实验结果很好的证明了ETA引物对绿脓杆菌的特异性。
3.3PCR反应的敏感性
对PCR反应的敏感性的检测，本文采用的方法是准确检测为了产生所需要的目的条带所必须的模板DNA的最小数量。本实验把绿脓杆菌和其他细菌的模板DNA利用系列10倍稀释，降低其浓度，然后再各自进行PCR反应，在反应过程中除开模板DNA被稀释以外其他条件均保持不变，最后依然利用脂糖凝胶电泳来检测PCR产物。检测结果表明：即便模板DNA的量只有10pg，我们依然可以清楚的辨认大小为396by的目的条带。这充分说明ETA引物对绿脓杆菌的敏感性。
为了提高检测效率，我们需要在最短的时间内进行准确的检测，笔者找到了利用简易模板制备方法来进行直接PCR反应的方法，实验证明这种方法能大大的减少检测的所需要的时间[4-6]。具体制备方法跟前面叙述的一样，不一样的是将样本细菌菌体进行煮沸加热，让菌体破裂，用这种方法快速获取实验所需的细菌基因组DNA，将细菌基因组DNA经过离心后上清处理，然后就可以直接作为PCR反应的模板。
4、结语
在利用PCR技术检测绿脓杆菌的过程中，模板的制备是一个很关键的环节。传统的做法是，提取细菌基因组DNA作为PCR的反应模板，但是费时长，即使借助抽提试剂盒来完成提取过程，也只能将末班制备的时间时间压缩到1-2h，而且抽提试剂盒里面通常含有有害的有机溶剂，会对基因组DNA造成影响。本研究提出了一种PCR模板的简易制备方法，将菌体煮沸10min，菌体破裂以后释放出实验所需的细菌基因组DNA，将模板制备过程缩短到20min，整个细菌检测过程也仅仅只需要4h，并且经过检测，细菌基因组DNA直接PCR方法结果呈现阳性，也具有一定的敏感性，降低了提取过程中DNA的损失。
其实可以用来鉴定细菌、病毒等的生物技术还有很多，比如质粒指纹图谱分析、脉冲场凝胶电泳分析和，16SDNA分型鉴定技术，但是跟PCR技术相比，PCR技术无疑具有简单、快速的优点，也便于在实际工作中推广。
参考文献：
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论文作者:黄晓光
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年6月第14期
论文发表时间:2016/11/23
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