【摘 要】目的：研究不同年龄段正常人群和冠状动脉粥样硬化患者血管内皮细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，验证iNOS对冠状动脉粥样硬化疾病的作用。方法：每个年龄组（20-40岁、41-50岁、51-60岁、61-70岁、70岁以上）取心脏左前降支中的一段，每组正常人群及患者各2个。制成石蜡切片，通过免疫组化染色，观察结果。结果：iNOS在冠状动脉粥样硬化患者血管内皮细胞中的表达明显高于正常人群血管内皮细胞中的表达。结论：iNOS在冠状动脉粥样硬化患者血管内皮中的表达高，说明iNOS在冠状动脉粥样硬化的发生发展中起重要作用。
【关键词】iNOS；冠状动脉粥样硬化；内皮细胞
冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，也是严重危害人类健康的常见病。动脉粥样硬化的病理改变是内皮舒张因子产生减少及内皮细胞受损，平滑肌细胞增殖、脂质沉积，从而引起血管壁增厚乃至管腔狭窄，血管张力增加。一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内的主要舒血管活性物质，具有维持血管张力，调节血压，扩张冠状动脉，调节心肌收缩与舒张[1]，增加心肌供血等作用。在体内，NO 主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthasen，NOS）催化L-精氨酸产生。NOS在体内广泛分布[2]，其中血管内皮细胞是最为集中的部位[3]。NOS 主要有三种不同的亚型[4]：神经型NOS（nNOS）、诱导型NOS（iNOS）及内皮细胞型（eNOS）。当内皮细胞受到炎症等细胞因子刺激时，iNOS 会受刺激诱导而开始表达[5]。iNOS一经表达，即具有高度的活性，且持续时间长，催化生成较高浓度的NO，参与心血管的许多病理过程[6、7]。本次实验用免疫组化Envision二步法检测iNOS在冠状动脉血管内皮中的表达，验证iNOS对冠状动脉粥样硬化疾病的作用。
1 材料
1.1 冠状动脉样本 取自浙江大学司法鉴定中心。
1.2 免疫组化试剂 一氧化氮合成酶1型，编号BA0360购于武汉博士德生物工程有限公司；羊抗免IgG抗体-HRP多聚体，编号PV-6001，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；浓缩型DAB试剂盒，编号ZLI-9031/9032/9033，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 其它试剂和材料 不同浓度二甲苯溶液、不同浓度酒精溶液、PBS缓冲液、苏木精染液、0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液、3%H2O2溶液、多聚左旋赖氨酸载玻片、树胶、微量加样器、冰箱、湿盒、切片架、显微镜。
2 方法
2.1 冠状动脉材料准备 挑选出符合要求的非冠状动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化的尸体标本各10例，然后找到心脏冠状动脉左前降支，切取约2-4mm的一段血管，制成切片。
2.2 切片制成后，于60℃烘箱烘烤切片4-6小时。
2.3 HE染色
切片脱蜡 将切片依次浸入：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 5分钟，无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟，95%乙醇5分钟，90%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，水洗2分钟。
染色 苏木精染色10分钟，水洗1分钟，1%盐酸乙醇分化数秒，再用水洗1分钟。用0.2%氨水返蓝约30秒，水洗1分钟。伊红染色5分钟，快速用水洗去染料。
脱水、透明、封固 将切片依次浸入：80%乙醇20秒，90%乙醇20秒，95%乙醇I 3分钟，95%乙醇II 3分钟，无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟，二甲苯I 3分钟，二甲苯II 3分钟，二甲苯III 3分钟。
最后用中性树胶封片。
2.4 免疫组化法染色 采用免疫组化envision二步法：
切片脱蜡和水化 将切片放入60℃恒温箱中烘烤20分钟，取出后将组织切片依次置于下列溶液中浸泡：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟，无水乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟。取出后用PBS洗三次，每次3分钟；
封闭内源性过氧化物酶活性 将切片在3% H2O2溶液中浸泡15分钟。取出后再在PBS中洗一次，3分钟；
抗原修复 用电磁炉加热水浴锅，水浴加热0.01ml/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95±3℃，将切片放入缓冲液中，稳定温度保持30分钟。结束后连枸橼酸钠缓冲液一起从水浴锅中取出，放在室温下自然冷却；
滴加一抗 将自然冷却的切片用PBS洗两次，每次3分钟。然后滴加1：100稀释的一抗，稀释后抗体浓度为2μg/ml，液体完全盖过组织块，整个操作不能干片。滴加完一抗以后，抗ETA和抗ETB两套抗体的切片必须分开操作，不能相互接触。将滴加完一抗的切片放入湿盒切片架，放入4℃冰箱中过夜（约20小时）；
滴加二抗 取出过夜后的切片，待其恢复至室温后，用PBS溶液洗三次，每次3分钟。滴加二抗，即山羊抗免IgG抗体-HRP多聚体，湿盒孵育30分钟，取出，PBS洗三次，每次3分钟；
DAB显色 按DAB试剂说明书，在进行DAB染色前数分钟配好DAB溶液。在水槽边向切片滴加DAB溶液，待颜色微黄后立即用水冲去多余染液；
苏木精复染 将切片浸入苏木精染液中5分钟，取出用水洗净；
封片 中性树脂封片。
3 结果
判定标准 细胞浆被染成棕黄色作为阳性细胞判定标准。阳性细胞< 5 %为浅黄色（±）；5 %～25 %之间为棕黄色（+）；26 %～50 %之间为中度棕色（++）；> 50 %为深棕色（+++）。
从表1可看出：正常血管内皮和冠状动脉粥样硬化血管内皮中iNOS的表达差异明显。冠心病患者冠状动脉血管内皮细胞中iNOS阳性表达高于正常人冠状动脉血管内皮中的iNOS表达。
表1 iNOS在冠状动脉血管内皮表达程度
4 讨论
iNOS在免疫系统主要存在于白细胞、巨噬细胞、肥大细胞，在心血管系统主要表达于心肌、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心内膜，主要受细胞因子、需氧应激、IFN-γ、TNF-α及脂多糖等诱导表达[8]。NO通过扩张血管，抑制中性粒细胞和血小板粘附、聚集，保持血管内环境稳定。生理条件下iNOS在体内活性很低，表达较少，产生少量NO具有上述作用。而在缺血、缺氧和炎症反应等病理条件下，多种细胞因子上调，巨噬细胞内iNOS mRNA表达增加，使iNOS增加，产生大量NO，可发挥细胞毒性而损伤细胞[9]。
Ohishi等[10]研究发现，iNOS增强表达于动脉粥样硬化病变或脂质核心内，或邻近的巨噬细胞和平滑肌细胞；iNOS在细胞因子的诱导下或炎症过程中产生了大量的NO，这些NO对细胞是有毒性的，并能导致动脉粥样硬化。可能的机制：（1）与超氧自由基反应形成过氧亚硝基，后者可以损伤细胞蛋白；（2）诱导增强血管反应性；（3）促进白细胞黏附和血小板聚集。
在动物实验中已证实，iNOS抑制剂能阻断这些病理过程，发挥心血管保护作用[11、12、13]。在临床治疗中，如何通过iNOS抑制剂的使用，抑制iNOS 的表达，减少NO的生成，减少急性心肌坏死和凋亡，仍需要循证医学的不断探索。
参考文献：
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论文作者:苏琳
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2018年5月上第9期
论文发表时间:2018/11/22
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