（湖南炎帝生物工程有限公司 湖南 株洲 412007）
【摘要】 目的：利用高效液相（HPLC）法建立蛹虫草检验标准。方法：收集10个不同产地的蛹虫草，使用高效液相色谱检测样品中共有的成分。结果：从蛹虫草中检测出8个共有峰，且方法学考察合理。结论：该方法快速简便，能有效作为蛹虫草质量控制标准。
【关键词】 蛹虫草；高效液相色谱法；质量控制
【中图分类号】R281 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2016）29-0347-02
Establishment of HPLC quality control method for Cordyceps militaris Zhu-Difan,Zhan-Hao,Zhang-Ruihua
Hunan Yandi Bioengineering?Co., Ltd, Zhuzhou 412007, China
【Abstract】Objective Establishment of inspection standard for Cordyceps militaris by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods C. militaris from 10 places were analyzed by HPLC. Result The 8 mutal peaks were indicated, and the validation of method was satisfied. Conclusion HPLC fingerprint method is feasible and repeatable and can be suitable for identifying Cordyceps militaris.
【Key words】Cordyceps militaris;HPLC;Quality Control
蛹虫草Cordyceps militaris又叫北冬虫夏草、北虫草，是一种寄生于鳞翅目昆虫蛹及幼虫的麦角菌科（Clavicipitaceae）真菌[1]。其具有抗肿瘤、抗病源微生物、保护肝肾、保护呼吸系统、清除人体自由基、调节免疫系统、调节内分泌、抗疲劳等作用[2]。蛹虫草的有效成分包括：核苷类、糖醇、甾醇类、多糖等。其中主要活性核苷类中的腺苷、虫草素、尿苷等与冬虫夏草中含量相似[3]。中国药典仅对冬虫夏草有记载，而蛹虫草在2009年方被批准为食品原料[4]。本研究采用高效液相色谱法测定蛹虫草中的腺苷和虫草素两个活性成分，并测定8个共有峰作为指纹图谱对蛹虫草进行质量控制。
1.材料
1.1 样品来源
十批不同产地蛹虫草，分别采购自湖南常德，广东江门、清远，内蒙古赤峰，山东泰安，河北沧州，辽宁沈阳、大连，四川甘孜州，青海西宁，按列出顺序编为S1-S10。
1.2 主要仪器与试剂
Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配VWD检测器；Agilent Zorbax SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；腺苷，购自中国食品药品检定研究所，110879-200202；虫草素，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，F20831-73977305; 水为美国Millipore纯水系统制备；甲醇（色谱纯）购自国药集团化学试剂有限公司；超声波清洗器（天津奥特赛恩仪器有限公司）；高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）。
2.方法与结果
2.1.1供试品溶液的制备
精密称取蛹虫草粉末0.5g，置于50ml量瓶中，加10%甲醇水溶液至刻度线，精密称量，超声提取（55kHz，20℃）10min，冷却至室温，用10%甲醇水溶液补足失重，摇匀，离心10min（4000r/min），过滤，滤液4℃保存为供试品溶液。
2.1.2对照品溶液的制备
精密称取虫草素和腺苷标准品各10mg于50ml量瓶中，用10%甲醇定容至刻度，摇匀，分别吸取虫草素和腺苷溶液适量制成质量浓度为10μg/ml和20μg/ml的标准品溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得对照品溶液。
2.1.3高效液相色谱条件
色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0ml/min；检测波长260nm；进样体积10μl；柱温：25℃；流动相A：甲醇，流动相B：水；梯度洗脱程序：0 min (90%B)→5 min (78%B)→12 min(74.5%B)。
2.1.4方法学考察
标准品线性:腺苷：进样量0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μg作线性，得线性范围0.1～1μg，线性方程y=32.835x，R2=0.9982；虫草素：进样量0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μg作线性，得线性范围0.05～1μg，线性方程y=30.501x，R2=0.9973。证明对照品线性良好。
稳定性试验：取1号样品分别于0、1、2、4、8、12、24h检测，保留时间RSD：0.40～0.87；峰面积RSD：0.46～4.94，仅峰6（峰面积＜5%）为15.42；相似度≥0.999。证明稳定性良好。
精密度试验：取1号样品连续进样5次，记录色谱图；保留时间RSD：0.46～0.80；峰面积RSD：0.28～9.52；相似度=1。证明精密度良好。
重复性试验：取1号样品，平行制备供试品6份，记录色谱图；保留时间RSD：0.09～0.14；峰面积RSD：0.57～3.68，仅峰6（峰面积＜5%）为14.44；相似度≥0.999。证明重复性良好。
2.1.5数据分析
由中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）完成。
2.1.6特征峰分析
取腺苷和虫草素标准品溶液注入高效液相色谱，与样品1各峰保留时间进行对比，确定样品中含有腺苷（峰5）和虫草素（峰7）两个特征峰。
2.1.7指纹图谱建立
将10批次蛹虫草S1-S10进行HPLC检测，记录的色谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”，以腺苷和虫草素进行多点校正，导出标准指纹图谱，见图1。将10批次蛹虫草对比得到图2，通过计算得到10批次蛹虫草相似度在0.885～0.986之间，可见10批次蛹虫草之间有较高的相似度。
图1 蛹虫草标准指纹图谱
Fig.1 Standard HPLC fingerprint for C. militaris
图2 10批蛹虫草图谱匹配结果
Fig.2 Matching result of ten C. militaris HPLC chromatograms
3.讨论
本文通过HPLC检测蛹虫草，发现其腺苷和虫草素线性、分析方法的稳定性、精密度、重复性良好，方法学考察符合要求，建立了蛹虫草的HPLC指纹图谱和含量检测两个分析方法。通过此方法对10批次不同产地的蛹虫草进行检测，并通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”分析得到蛹虫草标准指纹图谱，且相似度在0.885以上。本方法的建立可以有效的对不同产地蛹虫草药材的质量进行控制，亦能进行蛹虫草中标志性成分的检测，有利于蛹虫草的规范化生产。
【参考文献】
[1]梁宗琦．中国真菌志[M].北京：科学出版社，2007, Vol.32: 36-42.
[2]林群英.宋斌、李泰辉.蛹虫草研究进展[J].微生物学通报, 2006, 33(4): 154-7.
[3]苏颖、李竞.人工蛹虫草HPLC指纹图谱的建立[J].亚太传统医药, 2012, 8(3): 10-11.
[4]中华人民共和国卫生部.卫生部关于批准蛹虫草为新资源食品的公告2009年第3号[Z]. 2009-3-16
论文作者:朱迪凡,占豪,张瑞华
论文发表刊物:《医药前沿》2016年10月第29期
论文发表时间:2016/10/31
标签：虫草论文; 色谱论文; 腺苷论文; 图谱论文; 指纹论文; 高效论文; 溶液论文; 《医药前沿》2016年10月第29期论文;