（南阳医学高等专科学校 河南 南阳 473061）
【摘要】 目的：构建Nurr1腺病毒表达载体。方法：设计带有酶切位点的Nurr1引物，采用PCR法从Nurr1基因载体中扩增目的基因，经限制性酶切后与pHBAd-EF1-MCS-GFP连接，转化感受态细胞。验证后，与骨架质粒pHBAd-BHG共同转染293细胞，通过反复冻融传代提高病毒载体滴度。结果：成功构建具有目的基因NURR1的过表达腺病毒载体。
【关键词】NURR1；过表达；载体
【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）29-0126-02
Nurr1属于孤儿核受体NR4A亚家族成员之一，被认为是生物体内调控发育、代谢、炎症和免疫等生物作用的转录因子，是迅速的早期反应基因，其表达水平很大程度上决定其转录活性。一般认为，Nurr1能以单体形式与NGFI-B反应元件（NBRE，AAAGGTCA）结合，或以同二聚体形式与NR4A1反应元件结合，或以异二聚体形式与维甲类X受体（RXR）反应元件结合激活DNA的转录[1，2]。研究表明Nurr1在细胞水平主要与增殖、凋亡和分化有关[3，4]。
本研究从Nurr1载体中扩增Nurr1表达序列，构建腺病毒过表达载体，为深入研究该基因在动脉粥样硬化中的调控机理打下基础。
1.材料方法
1.1 材料
HEK293细胞株（人胚肾细胞系）由购自国家实验平台共享服务平台；Nurr1基因载体购自上海恒大生物科技有限公司，载体pHBAd-EF1-MCS-GFP购自Hanbio，大肠埃希菌株DH5α购自Invitrogen，限制性内切酶和DNA ladder Marker购自Fermentas Inc.，One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，小量以及大量质粒核糖核酸提取试剂盒购自康为世纪，凝胶回收试剂盒购自Axygen Inc.，琼脂粉，高级琼脂糖等购自上海生工。DMEM 购于Hyclone公司；LipofiterTM转染试剂购自汉恒生物；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA购于Hyclone公司；60mm细胞培养皿、10cm细胞培养皿、96微孔培养板、一次性移液管（5ml和10ml）、15ml及50ml离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore Inc。
1.2 引物设计与合成
根据NCBI human Nurr1基因序列，分别设计上、下游引物：h-NR4A2-yy-Eco/Bam-Fad：GTGACCGGCGCCTACGAATTCGCCACCATGCCTTGTGTTCAGGCG；h-NR4A2-yy-Eco/Bam-Rad：TCGATGGACCGGTCGGGATCC GAAAGGTAAAGTGTCCA，引物由上海生工合成。
1.3 重组表达载体的构建与鉴定
pHBAd-EF1-MCS-GFP载体用EcoRI，BamHI酶切，反应体系为40ul，37度2小时左右，载体酶切完成后胶回收。PCR扩增NURR1序列，采用50ul反应体系，PCR反应条件为：95℃ 5 min，94℃ 20sec，55℃ 20sec，72℃ 1.5min，循环25次，72℃ 10min。扩增产物用EcoRI，BamHI酶切后胶回收。处理好的目的片段与载体在重组酶反应体系，于37℃温育30min进行连接。反应产物转化感受态细胞DH5a，Amp抗性 37℃培养过夜。转化后的NURR1平板挑菌，37℃ 250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。
1.4 体外重组腺病毒载体的组装、毒液收集及群体扩增
在正式转染开始前的一天，将HEK293细胞株按适宜密度接种于60mm培养皿，培养基的组成为DMEM培养基，添加10% HyclonFBS血清，放于37℃（通入5% CO2）的培养箱中过夜培养。当培养细胞的汇合度达到70%左右时，配制体外重组腺病毒载体NR4A2质粒及pHBAd-BHG骨架质粒混合物，使用LipofiterTM试剂对HEK293细胞株进行转染。每天观察细胞出毒迹象。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。使用15ml离心管收集所有HEK293细胞以及培养液。调节恒温水浴锅温度至37℃，将上述收集的HEK293细胞以及培养液在液氮和37℃水浴锅间反复冰冻融解三次。在转速2000g离心5分钟，保留上清液，即为第一代病毒P1。反复传代冻融三次，得到第三代病毒（P3）。
2.实验与分析
2.1 Nurr1基因扩增
NURR1基因载体经PCR扩增，琼脂糖电泳分析发现，在1500和2000bp bp间可检测到清晰的目的条带，与预期结果一致。
2.2 Nurr1单克隆PCR结果
阳性克隆菌液，经PCR扩增，琼脂糖电泳分析发现，在1500-2000bp间左右可检测到清晰的目的条带，与预期结果一致。
2.3 Nurr1腺病毒构建结果
腺病毒感染细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。
2.4 感染性滴度检测
采用改进的TCID50法，测定结果为1.58×1010PFU/ml。
3.讨论
质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP属于腺病毒基因组质粒，腺病毒作为一类分子量超过36 kb的无包膜正负双链DNA基因组病毒。其复制周期中首先吸附易感细胞，然后通过外膜蛋白与宿主细胞膜表面受体结合，利用细胞内吞作用穿越细胞膜进入宿主细胞，在宿主细胞蛋白酶作用下，脱去衣壳，其双链DNA基因组由胞质转移进入细胞核，在宿主染色体保持独立结构，不与宿主细胞基因组发生整合。以腺病毒作为基因载体转染效率极高，在in vitro实验中，其转导效率甚至能达到100%的；腺病毒载体的另一个特点是，其转导组织细胞的类型不受限制，更不会受到靶细胞细胞周期的影响；故其制备过程中能够产生极高的滴度，因而，以腺病毒作为基因转导的载体在体内和体外研究中具有广泛的应用。本研究运用腺病毒载体系统，成功构建Nurr1腺病毒载体，为进一步研究Nurr1参与动脉粥样硬化的机制打下基础。
【参考文献】
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论文作者:张东献,陶俊良,张伟,满永宏
论文发表刊物:《医药前沿》2017年10月第29期
论文发表时间:2017/10/27
标签：载体论文; 细胞论文; 基因论文; 腺病毒论文; 质粒论文; 目的论文; 转染论文; 《医药前沿》2017年10月第29期论文;