黄雪珊[1]2004年在《联合药物预处理及TGF-β1转基因治疗对豚鼠—大鼠非协调性异种心脏移植物的影响》文中认为采用改良Heron法颈部袖套血管吻合法建立豚鼠—SD大鼠非协调性异种心脏移植模型，应用适应剂量的中华眼镜蛇毒因子清除受体的补体C_3，可克服异种超急性排斥反应，建立异种急性血管性排斥反应模型；联合应用不同作用机理和效应细胞不同的药物环孢素A、来氟米特和银杏叶提取物Ginaton预处理移植受体，可对抗异种移植急性血管性排斥反应，延长异种心脏移植物的存活时间，其机理与增加保护性基因表达、减少细胞凋亡、减轻免疫损害有关；在供心冷保存期间经冠脉缓慢灌注腺病毒表达载体以介导多功能免疫抑制性细胞因子——转化生长因子基因转移治疗，外源性小鼠TGF-β1广泛表达减少炎症细胞浸润、减轻免疫损害，明显延长异种移植物存活时间；应用基因转移技术在移植物局部表达抑制性细胞因子可成为异种移植免疫抑制治疗的一种新方法。
戚峰, 朱理玮, 何向辉, 邱宇杰, 王鹏志[2]2010年在《中华眼镜蛇毒结合免疫抑制剂控制异种移植排斥反应》文中研究说明目的:探讨协调性和非协调性异种移植免疫排斥不同机理,寻找中华眼镜蛇毒结合免疫抑制药物的最佳治疗方案。方法:采用改良的Heron颈部套袖法分别建立小鼠对大鼠,豚鼠对大鼠异种异位心脏移植模型,受体大鼠各分为4组:1组仅行异种移植不给药;2组联合应用中华眼镜蛇蛇毒因子、环磷酰胺、FK506;3组将2组中华眼镜蛇毒剂量加倍;4组在2组用药组合基础上再加用前列腺素E1。结果:给药组移植供心存活时间明显延长,尤其在小鼠对大鼠模型给予PGE1后(小鼠4组6.92d)及豚鼠对大鼠模型蛇毒因子剂量加倍后(豚鼠3组27.33h)。两类模型给药后CH50,异种抗体IgM明显降低,并逐渐出现急性血管排斥反应改变。结论:异种移植后的超急性排斥反应和急性血管排斥反应存在着密切的相互关联,是统一的排斥过程中具有不同特点的两个阶段。中华眼镜蛇毒联合多种免疫抑制药物可控制异种排斥,尤其对非协调性异种移植有更大的作用。
沈振亚, 欧阳忠, 倪斌, 于曙东, 余云生[3]2001年在《眼镜蛇蛇毒与全身照射在非协调性异种心脏移植排斥中作用的研究》文中认为供体豚鼠和受体SD大鼠各 32只随机分成空白对照、单用中华眼镜蛇蛇毒CCV (0 4mg/kg )、单用全身照射WBI (5Gy)、CCV与WBI合用 4组进行异位心脏移植 ,结果表明 :(1)存活时间CCV +WBI组 (12 36± 4 5 3h ) >CCV组 (7 0 6± 3 3h ) >WBI组 (0 42± 0 0 7h )和空白对照组 (0 36± 0 16h ) ,差别显著 ;WBI组与空白对照组无明显差别 (P >0 0 5 ) ;(2 )供心停跳后与移植前比较 :空白对照组血清IgG升高、IgM下降 ,而其余 3组IgG和IgM均下降 ;(3)病理检查空白对照组与WBI组呈超急性排斥 (HAR )改变 ;CCV组和CCV +WBI组呈延迟性异种排斥 (DXR )改变。结论 :在本模型中 ,CCV能延缓超急性排斥反应的发生 ,WBI能降低天然抗体水平 ,但不能延缓DXR的发生。WBI与CCV合用有协同作用 ,可能涉及抗体的减少。其中IgM与HAR有关 ,IgG与DXR有关。
关兆杰[4]2003年在《抗凝治疗对延迟性异种移植排斥反应的作用》文中指出目的：异种移植是解决目前器官移植中供体严重不足现状的可能途径。异种心脏移植后将面临剧烈的超急性排斥反应(HAR)。延迟性异种移植排斥反应(DXR)是异种移植超急性排斥反应被避免或者抑制后发生的一种反应，表现为内皮细胞激活，单核细胞、NK细胞浸润，细胞因子、粘附分子表达上调，血小板聚集，血栓形成。通过转基因猪成功克服了HAR后的几天内，将出现DXR。研究表明免疫激活与凝血激活是相互关联的两个重要因素。抗凝治疗成为对抗DXR的重要方法之一。本研究应用中药川芎嗪、丹参或西药阿司匹林、低分子量肝素联合对抗DXR，以找到能够延长移植物存活时间的有效抗凝治疗方法。 方法：用离子交换层析与凝胶过滤层析的方法从中华眼镜蛇毒冻干粉中提取眼镜蛇毒因子。在豚鼠—大鼠异种心脏移植中，给以眼镜蛇毒因子以避免发生超急性排斥反应，制作延迟性排斥反应模型。然后分别分组给予相应药物治疗，并与地塞米松合用，观察移植物排斥。 结果：各组移植物平均存活时间：超急性排斥组17±4分钟，延迟性排斥组41±3小时，应用肝素加阿司匹林组43±3小时，粉防己碱组42±3小时，川芎嗪加丹参组61±4小时，地塞米松组53±2小时，川芎嗪加丹参与地塞米松组61±2小时。经统计学分析，与延迟性排斥组相比，肝素加阿司匹林组和粉防己碱组无显著性差别(p＞0.05)，地塞米松组、川芎嗪加丹参组、地塞米松和川芎嗪加丹参联用组有极显著差异(p＜0.01)。川芎嗪加丹参组与川芎嗪加丹参和地塞米松联用相比无显著性差异(p＞0.05)。 结论 延迟性异种移植排斥反应中，较大剂量低分子量肝素加阿司匹林、单用粉防己碱未能有效延长移植物存活时间，川芎嗪加丹参、单用地塞米松可以显著延长移植物存活时间，但是川芎嗪加丹参与地塞米松联合未能进一步延长存活时间。移植物的延迟性排斥反应未能最终避免。
孟珂伟[5]2000年在《中华眼镜蛇蛇毒因子对非协调性异种心脏移植的影响》文中认为目的：（一）采用cuff技术及sleeve方法建立豚鼠对大鼠的异种心脏腹部移植模型。（二）应用中华眼镜蛇蛇毒因子（CVF）消耗补体，观察豚鼠心脏在移植入Wistar大鼠腹腔内后对超急性排斥反应的影响。 方法：（一）摘除豚鼠的心脏仅保留供心的左颈总动脉和左肺动脉，切除Wistar大鼠左肾后，用sleeve方法行供体左颈总动脉对受体左肾动脉吻合，以cuff技术行供体左肺动脉对受体左肾静脉建立心脏血管通路。（二）按0.20μg.g~(-1)CVF大鼠腹腔内分两次间隔6小时注射，18小时后进行心脏移植。脾切除及腹腔注射环磷酰胺（Cy）均为移植前一天进行。设计分为4组：A组为对照组不用任何药物，B组为仅应用CVF，C组应用CVF＋环磷酰胺（Cy）+脾切除，D组为环磷酰胺（Cy）+脾切除。环磷酰胺（Cy）的用量为60mg.kg~(-1)腹腔内注射。监测各组受体的供心组织存活时间，并在供心停跳后取出送光镜、电镜检查。A、D两组分别于心脏移植前（切除左肾后）、移植物丧失功能后，B、C两组心脏移植前（切除左肾后）、移植后1、8、24小时各抽血2ml行AST、CK、CKMB检查。对相应数据，应用SPSS软件进行统计学处理。 结果：（一）共进行40次，成功38例，成功率95％。血管吻合时间平均8分钟，整个手术54-71分钟，平均时间63分钟。（二）A组、B组、C组、D组供体心脏存活时间分别从0.15-52小时。移植心脏生存时间的统计学 撕：A狮D敝别与B、C两组L嫩p炯．晒；D、A两狮比，B、 C两组k嫩p吸05。光镜电镜病理结果提示：CVFop鹏其他两组有明 显差异。移植前后的AST、CK、CKMB的结髓，心脏移植后有叶 明显的增高，B、C两组8小时后逐渐下雌24小时时基本趋于最低。 结论：卜陷仿捏翘用方便、简单可靠，是研究异种器官移植的急、慢 蝴诉反应咀陆吸兔疫药物筛选w一种理想模型。OCVF在 中能 明显扣喘脾MMHAR的发生，从而使供体器官存活时间延 长。CVF具有扣喘异种器官移植的HAR峨，是否具有临床开发的价值 有待于进一步深入研究。
王建雄[6]2004年在《可溶性Ⅰ型补体受体对异种心脏移植超急性排斥反应作用的研究》文中研究指明目的: 异种心脏移植是为了解决供心来源严重短缺,延长受者生命,提高受者生活质量。而超急性排斥反应阻碍了异种心脏移植的临床应用。多年来心脏移植学家们不断地进行异种心脏移植的基础研究,至今异种心脏移植排斥问题尚无良好的解决办法。有关这方面的研究主要集中在基因治疗、供体器官灌注、血浆交换、全淋巴组织照射、脾切除、免疫吸附、免疫抑制药物等方面,并已证实它们具有抑制超急性排斥反应(Hyperacute rejection ,HAR)的作用。其中有文献报导持续或间断静脉注射可溶性I 型补体受体重组蛋白能够明显抑制 HAR,供心存活时间明显延长。但采用这种全身给药的治疗方法也同时抑制了受体的全身免疫系统,对供心以外的组织器官影响大,蛋白半衰期短,而且代价昂贵。若采用心肌特异性表达重组腺病毒的方法来抑制 HAR,有可能解决这一问题。鉴于上述情况,本课题通过动物实验局部注射 sCR1重组腺病毒转染部分心肌,使目的基因在心脏局部原位表达,考察此种方法能否对 HAR 有一定的抑制作用,为今后深入研究 sCR1提供初步的依据。目前尚无有关这方面的文献报导。 方法: 1.豚鼠至 SD 大鼠颈部异位心脏移植模型的建立 选健康雄性豚鼠和 SD 大鼠为研究对象,体重分别为 200±30g 和 250±30g,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,建立豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型。豚鼠及 SD 大鼠各80 只,随机配对后分 2 组进行实验:组 I(对照组,n=40)采用 Cuff 技术,组 II(实验组,n=40)采用改良 Cuff 技术。观察心脏移植后两组供心复跳情况,比较其供心存活时间。探索理想的小动物异位心脏移植模型。 2. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1 转染豚鼠心肌及其蛋白表达的检测 选健康雄性豚鼠为研究对象,体重 200±30g,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,左侧开胸显露心脏,在左室壁注射 SLRI、Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1。40 只豚鼠随机分为 4 组进行实验:检测组 I(对照组,n=10)注射 SLRI,检测组 II(实验组,n=10)注射 Ad.lacZ,检测组 III(实验组,n=10)注射 Ad. GFP,检测组 IV(实验组,n=10)注射 Ad.sCR1。各组以左室前、侧壁为注射点,分别注药 50 微升。注药后 0.5、7、14、21 及 28 天,取心脏标本制作切片,观察重组腺病毒蛋白表达情况。 3.观察 Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1蛋白表达高峰期 2<WP=7>第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业 转染后 0.5、7、14、21 及 28 天,在检测组 II、III、IV 中每组随机取一只转染动物,于注射点处行心肌组织切片镜检,每张切片随机取 10 个 200 倍视野进行阳性细胞计数,计算每张切片 10 个视野内转染的阳性心肌细胞平均数,每组共计数均为 50 个视野。比较各组蛋白表达的高峰期。 4. sCR1 对异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用 选雄性健康豚鼠和 SD 大鼠为研究对象,体重分别为 200±30g 和 250±30g。豚鼠及SD 大鼠各 90 只,随机配对后分 3 组用药:移植组 I(对照组,n=30)注射 SLRI,移植组 II(对照组,n=30)注射 Ad.GFP,移植组 III(实验组,n=30)注射 Ad.sCR1。心脏移植术前 10 天左侧开胸,每组以左室前、侧壁为注射点,分别注药 50 微升。10天后,0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 采用改良 Cuff 技术建立豚鼠至大鼠颈部心脏移植超急性排斥反应模型,比较各组供心存活时间,观察发生超急性排斥反应后供心病理学变化。 结果: 1. 成功建立豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型,实验组及对照组供心平均存活时间分别为 51.8 土 6.1 和 16.6 土 6.7min,实验组供心存活时间明显延长,与对照组比较统计学差异非常显著,P<0.01。 2. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1转染后都有蛋白表达, SLRI 组未见有蛋白表达。 3. Ad.lacZ、Ad.GFP 及 Ad.sCR1转染后约 12 小时有蛋白表达,1-2 周为表达高峰期,4 周左右表达开始消失。 4. 建立了稳定的小动物异种心脏移植模型。注药后 10 天行心脏移植术,结果显示移植组 I(SLRI)、移植组 II(Ad.GFP)和移植组 III(Ad.sCR1)供心平均存活时间分别为 51.9±7.3、51.4±7.9 和 60.6±15.7 min,实验组病理检查显示轻度炎症反应,与对照组比较统计学差异显著(P<0.05),对照组间比较统计学差异不显著(P>0.05),三组 IgM沉着没有明显差别。 结论: 1. 应用改良 Cuff 技术建立的豚鼠至大鼠颈部异位心脏移植模型简便实用稳定,重复性高。供心存活时间明显延长,说明此模型可作为研究异种心脏移植超急性排斥反应的一个较好的平台。 2. sCR1重组腺病毒能有效转染心肌细胞,注药后 1-2 周为表达高峰期,转染后 10天是进行心脏移植的较好时期。 3<WP=8>第二军医大学硕士学位论文 中文摘要 胸心外科专业3. 改良 Cuff 技术建立的豚鼠至大鼠颈部心脏移植模型可以用于超急性排斥反应的实验研究。Ad.sCR1转染供体心肌后,能够在局部抑制炎症反应,供心存活时间有所延长。本实验证明,心脏局部范围注射重组腺病毒转染心肌,只是部分地延迟了 HAR 的发生,今后尚需进一步研究,探索构建携
倪斌, 沈振亚, 瞿冀琛, 叶文学, 何建明[7]2003年在《蛇毒因子、全身照射、胸腺修饰预处理受者对异种小动物心脏移植的作用》文中指出目的 利用眼镜蛇蛇毒因子 (CVF)、全身照射 (WBI)、异基因胸腺修饰等途径预处理受者 ,探讨这些处理对非协调性异种心脏移植物存活期及免疫排斥反应的影响。方法 供者为三色豚鼠 ,受者为SD大鼠 ,随机配对分成空白组 (O组 ) ;单用CVF的对照组 (A组 ) ;CVF +全身照射组 (B组 ) ;CVF +全身照射 +胸腺注射组 (C组 )。各组分别行大鼠腹腔内异位异种心脏移植术。观察各组供心存活时间及排斥后的光镜及电镜表现。结果 (1)存活时间 :B组、C组和A组均较O组明显延长 (P <0 .0 1) ;B组和C组又较A组明显延长 (P <0 .0 5 ) ;但C组与B组比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。 (2 )病理表现 :O组呈超急性排斥反应 ,另三组均呈延迟性异种排斥改变。结论 在本模型中 ,使用CVF可克服超急性排斥反应 ,联用全身照射可进一步延长供心存活时间 ;但在此基础上加用异基因胸腺修饰对延长供心存活时间无显著意义。
宋宁[8]2005年在《在异种移植中血红素氧化酶-1对内皮细胞的保护作用及其机制的研究》文中提出目的 目前,等待移植器官和组织的病人的量远远超过可得到的人类供体。因此,在过去的许多年里,跨物种间的移植,即异种移植再次引起人们的关注,异种移植被认为是解决日益严重的供体器官短缺的潜在方法,猪被认为是最合适的器官供者。猪器官移植至人是非协调性异种移植,这种移植首先遭遇的障碍是超急性排斥反应(HAR),目前已随着转基因猪的出现而被初步克服。延迟性异种排斥(DXR)代表着下一个重要的免疫学障碍。研究表明,异种移植物引起的延迟性异种排斥反应与内皮细胞活化有关。另外,多种炎症细胞如NK细胞对移植物的识别、浸润和损害也是DXR的重要特征。血红素氧化酶(HO-1)是一种细胞保护基因,在多种应激和同种移植模型中起重要的作用。我们设想诱导内皮细胞表达HO-1能否抵抗异种血清的激活和诱导凋亡的作用,能否保护内皮细胞抵抗异种NK细胞的杀伤作用,进而延迟或阻止排斥反应的发生,以期对将来临床异种移植提供实验依据。 方法 实验中首先采用20%人血清(HS)刺激培养猪主动脉血管内皮细胞(PAEC)的方式作为猪对人异种移植的体外模型。通过100μM钴原卟啉(CoPP)预处理12h诱导PAEC过度表达HO-1,分别以Western印迹法和胆红素生成法检测HO-1的蛋白表达和酶的活性。PAEC的活化以共聚焦显微镜观察NF-κB的核转位和ELISA法检查E-选择素的表达来评价,从而比较HO-1对PAEC活化的抑制情况。对人血清诱导的PAEC凋亡情况,我们分别以TUNEL法和Annexin V-FITC/PI双染色FCAS法来检查,并以Western印迹法检查两种抗凋亡基因(A20与Bcl-2)的表达,来揭示两种基因在HO-1抗凋亡中的作用。NK细胞对PAEC的细胞毒作用采用Cr~(51)释放法来判定,NK细胞的活性通过检查上清液中的IFN-?浓度来比较,以明确诱导PAEC表达HO-1对NK细胞杀伤作用的影响。我们进一步检查了HO-1在活体异种移植中抗排斥反应的作用。实验中采用豚鼠对大鼠异种肝移植模型,并进行了修改,与以往建立模型的方法在手术成功率及移植物再灌注方面进行了比较。我们采用注射眼镜蛇毒因子(CVF)的方法抑制HAR的发生,
朱晓星[9]2008年在《CVF抑制小鼠同种异体心脏移植急性排斥反应的实验研究》文中指出研究目的和背景:同种异体心脏移植已经成为治疗终末期心脏疾病的重要手段,但移植术后最常发生的急性排斥反应(acute rejection)仍然显著地制约着心脏移植的治疗效果。目前临床上对急性排斥反应的治疗方法主要是用免疫抑制剂(如环孢素A)和大剂量糖皮质激素(如甲基氢化泼尼松)冲击治疗,这种方法具有严重的毒副作用。如终身服用免疫抑制剂药物可造成机体肝肾功能受损、免疫功能低下、继发感染和肿瘤等疾病;并且目前这些主要针对T细胞免疫的治疗方法并不能完全抑制急性排斥反应,更不能诱导免疫耐受。因此,研发抑制急性排斥反应的新药物具有重要的意义。CVF(cobra venom factor,蛇毒因子)被认为是一种具有临床应用潜力的新型免疫抑制剂,其通过消耗补体抑制异种器官移植超急排斥反应(super acute rejection)的作用已经得到肯定;但是,对于CVF能否抑制以T细胞激活为主的急性排斥反应仍然不确定。我们课题组先期的实验研究发现,CVF可以使Wistar -SD大鼠同种异体供心术后平均存活时间从6.60±0.65天延长至13.44±2.08天。由于Wistar大鼠及SD大鼠均为封闭群大鼠,为了排除基因背景不纯产生的影响,我们将CVF运用于近交系BN-LEWIS大鼠同种异体心脏移植模型。结果同前类似,CVF使供心术后平均存活时间从6.65±0.34天延长至11.69±0.71天,移稙心脏排斥反应程度和T细胞浸润数量也明显下降。上述两次实验结果均表明CVF可以有效地抑制大鼠同种异体心脏移植的急性排斥反应,减少T细胞浸润,延长术后供心的存活时间。为了更深入地了解CVF上述作用的机理,我们拟建立BALB/c-C57近交系小鼠同种异体心脏移植模型。此模型动物品系纯合度高,可以方便运用源于小鼠的分子生物学试剂及单克隆抗体进行检测。在此模型基础上,我们验证CVF能否在体内抑制以T细胞激活为主的急性排斥反应,并初步探讨其机制。希望能为CVF作为一种新型免疫抑制药物早日应用于临床提供帮助。方法1.采用Heron袖套管(Cuff)技术将供体BALB/c小鼠的心脏移植至受体C57小鼠颈部,建立BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植动物模型。术后用心电图及心脏彩超检查供心存状况。正式实验拟建立了64例模型,随机分成对照组和实验组各32例。实验组受体C57小鼠在术前24小时经眶静脉窦注射CVF 50μg/kg和术后每三天经眶静脉窦注射CVF 20μg/kg下直至移植心停跳;对照组受体C57小鼠经同样方法注射等容量的生理盐水作为空白对照。2.对照组和实验组各随机抽出12例,分别于术后3天、5天、7天活杀4例取出供心行HE染色判定供心排斥反应的病理分级、免疫组化分析MHC-Ⅱ抗原、B7-1和B7-2共刺激分子的表达水平。剩余的对照组及实验组各20例观察其供心术后存活时间,并从每组中随机抽出8例分别在心脏移植术结束时,和术后1小时、6小时、12小时、2天、4天、6天、8天分别经眶静脉窦抽血,用50%溶血法(CH50)测补体活性。3.利用全自动图像分析系统(Image-Pro? Plus version 6.0),将病理检查结果转化为数据并运用SPSS 13.0软件进行分析,并初步探讨可能的作用机制。结果1.成功地建立了成功率高且可靠稳定的BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植模型。手术时间为60～70分钟,供心热缺血2～5分钟,冷缺血20～25分钟,手术成功率为96%。2.对照组与实验组的血清补体活性(%)有非常显著的差异(p<0.01)。对照组补体活性始终无明显变化,始终维持在高水平(85%~100%);实验组(CVF注射处理)在移植术后1小时血清补体活性下降了一半左右,术后6小时降至10%以下,术后2天几乎为0,术后4天维持在20%以下,术后6天维持在50%以下,术后8天几乎恢复正常水平。3.生存分析结果显示对照组供心术后平均生存时间为7.91±0.35天,而实验组供心术后平均生存时间为24.03±1.39天,是对照组的3倍,两者比较有非常显著差异(p<0.01)。4. HE染色结果显示对照组术后3天均发生Ⅱ级以上的急性排斥反应,术后5天均发生Ⅲ级以上的急性排斥反应,术后7天均发生Ⅳ级急性排斥反应;而实验组术后3天、5天均未发生急性排斥反应,仅有2例于术后7天发生Ⅰ级急性排斥反应。免疫组化结果显示MHC-Ⅱ抗原、B7-1和B7-2共刺激分子主要由抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC)表达,心肌纤维细胞本身不表达,但供心血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)可在发生急性排斥反应过程被诱导表达自身MHC-Ⅱ抗原。实验组上述抗原和共刺激分子的总体表达水平以及单个细胞表达水平均明显低于对照组,两组比较有非常显著差异(p<0.01)。上述抗原和共刺激分子的总体表达水平与急性排斥反应程度呈密切正相关。结论1.我们建立的BALB/c-C57近交系小鼠同种异体颈部异位心脏移植模型是心脏移植免疫学研究的理想动物模型;2. CVF可以有效地抑制心脏移植发生的急性排斥反应,延长移植心术后平均存活时间(p<0.01)。3. CVF可以显著减少移植心VEC和APC表达MHC-Ⅱ抗原(p<0.01),以及显著减少APC表达B7-1和B7-2共刺激分子(p<0.01),其机制有待进一步研究。
王建伟[10]2004年在《供体源性骨髓间充质干细胞调节非协调性异种肝脏移植免疫排斥反应的实验研究》文中研究表明第一部分 供体源性骨髓间充质干细胞诱导异种受体免疫状态变化的实验研究 前言 干细胞显著的生物学特性是既有自我更新的能力又具有多向分化的潜能，可分为胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞如造血干细胞(HSC)、骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞和视网膜干细胞等。骨髓中除造血干细胞以外，还含有另一类干细胞—间充质干细胞(MSC)。MSC具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能。在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化。许多研究表明，MSC能表达多种表面抗原，可表达间质细胞、内皮细胞、表皮细胞的表面标志。主要有：粘附分子类，生长因子和细胞因子受体，整合素家族成员，MHC—Ⅱ类分子及其共刺激分子B7—1，B7—2，5’末端核苷酸酶等。骨髓间充质干细胞还能分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、G-CSF、DSF、SCF等多种细胞因子。 MSC具有容易获得、容易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性，在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗中以及器官移植等方面的应用己得到广泛研究。利用干细胞的多向分化性，选择合适的生物材料和靶向性目的基因，MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的应用建伟2004年浙江大学博扫开究生学位论文认叭NGJ一an一W亡1 Dissertation for M.D已得到深入研究。目前MSC的免疫调节作用更引起了新的重视。最近的研究结果已证实MSC具有复杂的调节T细胞和B细胞功能的作用。对于在异种受体内环境中引起的免疫状态变化尚无明确的阐述。本实验研究观察体外培养的豚鼠MSC输注大鼠诱导免疫状态的变化，有助于深入阐述MSC的免疫调节功能，丰富移植免疫耐受的诱导策略。 材料和方法 选用健康雄性豚鼠(150一1809)，纯系雄性Wister大鼠(180一2209)。l、MSC的分离、培养 以豚鼠为供体，胫骨离断，自骨髓腔内获取的骨髓标本，采用Percon密度梯度分离取得单个核细胞层，加入L一DMEM培养液，培养传代。 2、表面标志物的检测 取第3代的贴壁细胞悬液，加入荧光标记小鼠抗鼠单抗eD34一FITe/eD45一PE，CD44一FITC，CD29一pE和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgGI一FITC和lgGZa，流式细胞仪检测分析。3、定向诱导 MSC向脂肪细胞分化 取第3代的贴壁细胞制成单细胞悬液，加入脂肪细胞诱导液，14d后行油红O染色，光镜观察。4、供体MSC输注受体 取第5代的贴壁细胞悬液，台盼兰染色测定细胞活性>95%时，加入叮睫橙 (AO)染色液，荧光显微镜观察。 以24只雄性Wiste:大鼠为受体，环磷酞胺预处理后随机分为两组:A组为MSC输注组:自大鼠阴茎背静脉注射的MSC单细胞悬液+地塞米松;B组为对照组:自大鼠阴茎背静脉注射生理盐水+地塞米松;每3d一次，共三次。以首次输注前及输注后的12d、15d、18d、21d为时点自两组大鼠阴茎背静脉取血lml。5、受体的免疫球蛋白及补体的变化 自大鼠阴茎背静脉获得血清待测标本，按照Beckinan Coulter IMMAGE分析仪的使用SOP加样检测。6、统计学处理 使用sPsS 10.0统计分析软件，应用单因素方差分析(One一wayANOvA)，以尸<口.口J为差异有统计学意义。L_建伟2004年浙江大学博L研究生学位论文认叭NGJ一an一W已1 Dissertation for M.D 结果1·MSC的分离、培养 PBS洗涤后的骨髓细胞悬液Percoll分离工作液后，分为血小板层、白细胞层和红细胞层。自血小板层中取得单个核细胞培养得到成纤维细胞样外观的MSC，原代培养细胞生长增殖较慢，3一10代的细胞生长周期为4一sd，形态较均一，呈长梭形。10代以后细胞生长速度缓慢，形态扁平，可见核碎裂、核固缩现象，增殖速度明显减慢直至停止。2、流式细胞仪检测MSC表面标志物 培养至第3代的MSC膜表面CD34阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD29阳性。3、定向诱导向脂肪细胞分化 从第4一5天起，光镜下观察见淡黄色的脂滴沉着的细胞，形状变为圆形或椭圆形，细胞核可被脂滴挤偏于一侧。油红O染色见脂滴呈红染，胞核呈蓝染。对照组的细胞形态未见变化。4、供体MSC输注对受体的免疫球蛋白及补体的影响 台盼兰染色测定细胞活性>95%时，制成单细胞悬液叮陡橙染色后，荧光显微镜激发观察，在6O4nm波长处可见有活力的细胞胞膜和胞浆呈现红色的明亮荧光，胞核呈均匀的黄色或绿色荧光。 MSC单细胞悬液输注受体后各个时相的抗体IgG、lgM和补体C3较输注前和对照组有显著降低(尸<口.口J)，而IgA和补体C4与输注前相比无明显变化。输注后各个时相的抗体IgG、IgM和补体C3总体上呈回升趋势，但各个时相点之间的变化差异无显著性(尸夕0.口J)。 结论 1、体内环境下低丰度的MSC在体外培养实现数量扩增是可行的?
参考文献：
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