崔杰峰[1]2004年在《人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究》文中认为转移复发是影响HCC术后生存的最大障碍。转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖)、细胞外基质、机体免疫与肿瘤血管生成等许多因素有关。比较蛋白质组学作为多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段,可高通量,大规模地筛检在疾病发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子,运用该研究策略,可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物,新关键分子,极大地丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。本研究通过对转移潜能高、低的人肝癌细胞系(MHCC97H/MHCC97L)和不转移人肝癌细胞系(Hep3B)的全蛋白质组表达谱差异分析,筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白,同时采用反义核酸技术和与侵袭生物学特性有关的鉴定方法对差异蛋白annexin1和S100A4进行了功能分析和验证。第一部分人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学分析本部分工作的主要目的:(1)优化双向凝胶电泳(2-DE)相关技术,建立相对稳定、适合本实验室的标准技术平台。(2)运用优化后的2-DE结合液相色谱-电喷雾-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)技术,对转移潜能不同人肝癌细胞系中全蛋白质差异表达谱进行分析,筛查在转移过程中发挥重要作用的差异蛋白质分子。2-DE技术是比较蛋白质组学研究的重要支撑技术之一,在比较蛋白质组学分析中,它所起的作用主要是对复杂蛋白质样品进行分离并显示差异蛋白的数量和位置。保持2-DE技术的稳定标准是比较蛋白质组学成功的关键。我们针对影响2-DE蛋白质图谱质量较大的环节,如上样方式(杯上样、溶涨上样)、银染方法(双胺银染法和非双胺化学显色银染法,固定时间)、细胞裂解液组成(离液剂浓度)分别进行了优化比较分析。结果发现同一细胞系MHCC97L采用杯上样、双胺银染法获得的平均蛋白斑点数为1092+40个(n=3),明显多于溶涨上样、非双胺化学显色银染获得的平均蛋白斑点数784+14个(n=3)。非双胺化学显色银染的图谱背景明显深于双胺银染结果,杯上样的碱性区、酸性区蛋白质分离效果明显优于溶涨上样。由于采用双胺银染法获得的蛋白斑点数远多于非双胺化学显色银染,前者胶中表达弱的点在后者胶中有匹配,说明双胺银染法敏感性优于非双胺化学显色银染法。与溶涨上样相比,杯上样可显着提高碱性区、酸性区蛋白质分离效果。同一L02细胞系经含不同浓度离液剂的细胞裂解液处理,平均获得的蛋白斑点数差异较大,分别为925+11个(7M尿素+2M硫脲,n=3),1019.5+13.5个(9M
于雁灵[2]2004年在《比较蛋白质组定量分析及其在疾病研究中的应用》文中提出蛋白质组学技术是生命科学中的分析化学的主要内容,是当前的研究前沿,是化学生物学近年来的新研究方向。本论文工作是在建立蛋白质组研究实验室的过程中,建立和发展了蛋白质组、比较蛋白质组和定量蛋白质组研究的相关技术平台,并将其应用于人类重大疾病的研究。定量蛋白质组学是通过某种方法或技术,对生物样品(细胞、组织或体液等)在某些过程中蛋白质的含量进行比较分析。从蛋白质组水平上对基因表达进行准确的定量分析,是比较蛋白质组学的重要内容,是当前研究重大疾病致病机制以及药理控制机制的必要手段及研究前沿。本论文工作的主要贡献是,建立了一套稳定可靠的蛋白质顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台;建立了一种新的、基于肽段乙酰基化的稳定同位素标记定量蛋白质组分析技术,并在实际生物样品体系中进行了验证;将建立、优化的蛋白质组定量分析技术应用于动脉粥样硬化、冠心病以及肝癌的复发转移相关的多个实际生物样品的比较分析,并从分子水平上评价了几种药物的药效。本文还研究了对基于生物素-抗生物素蛋白特异性结合的亲和色谱分离体系,结果显示该体系有望实现与乙酰基化同位素标记技术的有效对接,建立新的定量分析技术。一、在优化和发展传统双向凝胶电泳蛋白质组、比较蛋白质组方法的基础上,建立了蛋白质组顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台,为蛋白质组学方法学研究和应用研究奠定了实验基础鉴于蛋白质组的高度复杂性,在进行双向凝胶电泳前对蛋白质进行预分组是十分必要的。顺序提取按蛋白质溶解能力的不同将复杂的蛋白质组预分组,是目前常用的比较有效的样品预分组的方法之一。如何根据实验需求合理选择不同溶解能力的顺序提取液,不同的蛋白质提取液可否直接进行双向凝胶电泳分离并得到良好的分离效果等问题,是影响蛋白质组分析的重要因素。本论文提出了一套完整的蛋白质叁步提取方案,可以确保几乎所有的蛋白质进入相应的溶液中。其中,T1体系 (1 mmol/L PMSF的水溶液) 由于不含任何的蛋白质去垢剂、变性剂等,背景溶液组成简单,可以很方便地采取各种色谱分离的手段进行分离,也可以在直接补加一定量的蛋白质去垢剂、变性剂后采用双向凝胶电泳进行分离;T2 (7 mol/L 尿素,2 mol/L硫脲,2% CHAPS,2% SB3-10,
代智[3]2006年在《正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理糖蛋白质组学是研究糖蛋白表达谱、糖链组成及其功能的一门有发展前景的新学科。糖蛋白在细胞识别、粘附、细胞间相互作用等细胞功能中发挥了关键作用。许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。至今仍没有一个完整数据库全面阐述正常生理状态下所有糖基化的蛋白质，也未见有系统的糖蛋白质组学手段筛查病理过程相关的异常糖基化蛋白质。由于α-1，6岩藻糖(又称核心岩藻糖)普遍存在于很多糖蛋白中，并且其糖基化程度异常与肝癌或慢性肝病的发生和诊断关系密切。本研究利用扁豆凝集素(LCA)对糖链内核心岩藻糖的高亲和性及适用于大样本的、高通量糖蛋白质组学共性技术平台，即凝集素亲和层析、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)分析，首次建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库。同时应用2-DE和凝集素印迹联合MALDI-TOF-MS／MS分析，对高低转移潜能不同人肝癌细胞系即高转移的MHCC97-H、低转移的MHCC97-L和基本不转移的Hep3B细胞进行研究，获得了它们的核心岩藻糖基化蛋白质修饰谱，发现膜联蛋白Ⅰ(AnnexinⅠ)、膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)和细胞角蛋白8(CK8)等异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达，分析了此种糖蛋白表达和糖链结构的改变与肝癌细胞系转移潜能的关系。第一部分正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立及生物信息学分析本部分研究旨在建立适用于大样本、相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，并以此为基础，建立正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库，为正常状态下，机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息，为蛋白质核心岩藻糖基化在体内功能研究提供理论依据。选择不同正常人的肝脏组织4例，提取总蛋白通过LCA亲和层析柱后，分成两个组份，柱不结合组分由非核心岩藻糖基化蛋白构成；柱结合组份由核心岩藻糖基化蛋白组成。两组份与总蛋白分别进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，发现通过亲和层析使得LCA结合的低丰度糖蛋白得到富集。应用非线性pH 3～10，长7 cm的固定pH梯度的IPG胶条对它们进行2-DE分离，并结合蛋白银染技术，获得正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱，ImageMaster软件探测到蛋白质点130±3个，分析图谱发现LCA结合型糖蛋白较偏碱性端，PI 7-10，MW 26-50 KD区域处有许多高丰度蛋白；同时从获得的总蛋白和非核心岩藻糖基化蛋白表达谱中，分别探测到蛋白质点650±20个和300±10个，它们分布情况相似，主要位于PI 3-10，MW 20～36 KDa和PI 7-10，MW 26～60 KDa区域处。切取正常人肝组织核心岩藻糖蛋白表达谱中90个蛋白点，应用MALDI-TOF-MS／MS进行鉴定，通过数据库搜索、分析比对及去冗余后，共鉴定53种蛋白。将实际鉴定的53种蛋白利用NetNGlyc 1.0和NetoGlyc软件进行糖基化位点预测，发现除6个蛋白仅具有O-连接糖基化位点外，其他蛋白均含有潜在N-连接糖基化位点，但个数不一。按照Gene Ontology叁种分类方式对它们分类，细胞定位分类中位于细胞器的占LCA结合型糖蛋白的28％，其中，线粒体和内质网为最多；分子功能分类中具有结合活性和催化活性的蛋白分别占37％和30％；生物学功能分类中参与体内代谢过程的蛋白占33％。第二部分人肝癌细胞系转移相关的核心岩藻糖基化蛋白质组学研究本部分研究旨在建立适用于小样本，高通量糖蛋白质组学共性技术平台。比较研究转移潜能不同人肝癌细胞系核心岩藻糖基化蛋白质表达谱，筛查与分析人肝癌细胞系转移潜能相关的异常糖基化蛋白质，为肝癌转移复发的预测及机制研究奠定理论基础，为疾病相关分子的糖蛋白质组学研究提供技术手段。选择转移和非转移人肝癌组织以及转移潜能不同人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H，提取总蛋白，进行SDS-PAGE和2-DE分离，结合LCA亲和印迹技术，建立LCA凝集素亲和印迹图谱，即核心岩藻糖基化蛋白表达图谱。发现组织和细胞内蛋白的核心岩藻糖基化程度随肝癌转移潜能的增加而增加，核心岩藻糖基转移酶基因的表达也相应增加。SDS-PAGE／LCA凝集素印迹图谱显示，MHCC97-H和MHCC97-L在35～45KDa和45～60KDa间出现了Hep3B未见的条带。Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的2-DE／LCA凝集素印迹图谱中，分别平均检测到54±7个蛋白点(n=3)，59±6个蛋白点(n=3)，62±4个蛋白点(n=3)。以各自2-DE-考兰染色图谱为参考胶，利用Image Master软件对各细胞的核心岩藻糖基化蛋白表达图谱和总蛋白2-DE图谱进行匹配分析，Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H分别与其匹配的平均匹配点数为25±3个(n=3)，29±4个(n=3)，26±3个(n=3)，切取所有匹配蛋白点，应用MALDI-TOF-MS／MS进行鉴定，通过数据库搜索共鉴定34种蛋白。比较糖蛋白质组学分析发现AnnexinⅠ、CK 8等7种差异分布蛋白质的异常核心岩藻糖基化状态可能与人肝癌细胞系转移潜能相关。并对AnnexinⅠ，AnnexinⅡ和CK8异常核心岩藻糖基化再验证，经LCA亲和沉淀提取的糖蛋白中，AnnexinⅠ在MHCC97-H中的表达水平较MHCC97-L高，而Hep3B中几乎不表达；AnnexinⅡ和CK8在MHCC97-L和MHCC97-H中的表达水平较Hep3B高。表明叁种蛋白在高低转移潜能不同人肝癌细胞中的核心岩藻糖基化程度不同，随肝癌细胞转移潜能的增加而增加。应用免疫荧光发现它们定位在胞浆、Western blot和实时荧光定量PCR分析蛋白和mRNA表达情况，在MHCC97-L和MHCC97-H中它们蛋白含量及mRNA水平相对较高；应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹对AnnexinⅠ和CK8糖链结构改变进行推断，AnnexinⅠ在MHCC97-H中对LCA和刀豆凝集素(Con A)的亲和力较强，在Hep3B中几乎无亲和力，同时蓖麻凝集素(RCA-1)对两种细胞中的AnnexinⅠ都无亲和力；CK8在MHCC97-H中对LCA和RCA-1的亲和力较Hep3B高，而Con A对两种细胞中CK8亲和力则无明显差异。结论1．建立了两种相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台：一种是凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析；另一种是2-DE和凝集素印迹联合MALDI-TOF-MS／MS分析。2．应用凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析，建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库，它共有53种蛋白质构成，主要参与体内代谢过程，发挥催化反应和结合反应的作用。3．应用2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS／MS分析建立了不同转移潜能人肝癌细胞核心岩藻糖基化蛋白表达图谱。AnnexinⅠ，AnnexinⅡ和CK8除异常核心岩藻糖基化外，其蛋白表达水平、RNA水平及糖链结构的其他改变也与肝癌细胞转移潜能相关。潜在应用价值1．凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS／MS分析和2-DE、凝集素印迹联合MALDI-TOF-MS／MS分析分别适用于大样本和小样本的疾病蛋白质组学中蛋白质糖基化修饰谱的研究，对发现与疾病发生、发展中相关的异常糖基化蛋白质有重要价值。2．正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立，为机体正常状态下糖蛋白的全面阐述及核心岩藻糖基化功能作用探讨提供了基本的生物学信息。3．筛检出的异常核心岩藻糖基化的蛋白质，AnnexinⅠ，AnnexinⅡ和CK8有可能成为肝癌转移复发的诊断标志物及预后判断指标，以丰富肝癌诊疗指标的选择与组合。创新点1．建立了两种相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，为与疾病发生、发展中相关的糖蛋白质组学研究奠定了良好基础。2．本研究首次建立正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库，提出蛋白质的核心岩藻糖基化主要参与体内代谢过程，发挥催化反应和结合反应的作用。3．运用比较糖蛋白质组学技术手段从Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H中筛出的7种差异核心岩藻糖基化蛋白质中，AnnexinⅠ，AnnexinⅡ和CK8的异常核心岩藻糖基化，蛋白表达水平、RNA水平及糖链结构的其他改变与肝癌细胞转移潜能相关均为首次报道。
齐英姿[4]2016年在《肝细胞癌转移特性的定量蛋白质组学研究》文中研究表明肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是威胁我国人民健康的重大疾病。在世界范围内,肝细胞癌居于男性患者癌症发病率的第五位和死亡率的第二位,发展快,恶性程度高,预后差,素有癌症之王的称号。世界范围内,每年新增的肝细胞癌患者约为700,000例,主要集中在中国、东南亚地区以及撒哈拉以南的非洲国家,呈现显着的地域分布的特征。在肝癌的致病因素中,乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是最重要的诱发因素。病因统计显示54%的肝癌患者与HBV的感染相关,而我国又是HBV感染高发区。由HBV感染所诱发引起的肝细胞癌的发病率占到男性癌症发病率的7.5%和死亡率的5%。因此肝细胞癌的诊断与治疗是中国亟待解决的重大安全卫生问题。当前,肝癌的临床治疗包括根治性切除、移植、组织消融治疗等一系列治疗方法。虽然这些治疗方法为肝细胞癌的治疗带来了一些希望,但肝细胞癌其本身的异质性、复杂性仍旧给研究、治疗肝细胞癌也带来了巨大的困难。当前面临两个亟待解决的问题是早期正确、特异、高效诊断的困难和经肝癌的根治性切除后患者的高复发率的问题。早期的肝细胞癌患者具有更好治疗效果,能够显着提高肝癌患者的生存率并降低肝细胞癌复发和转移的概率,故早诊是应对肝细胞癌的重要途径之一。而目前常用的肝细胞癌的早期诊断的诊断标志物例如甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein,AFP)仍有部分假阳性或假阴性的问题,故肝细胞癌的早期诊断和精准分期急需寻找新的、基于信号通路的特异性好、灵敏度高的生物标志物或其组合。现代医学一般认为,癌症的发生是由于机体内的基本细胞调控机制出现缺陷而导致的疾病。这种调节机制的丧失会导致细胞分裂和增殖的失控、细胞赘生以及转移等癌症疾病表型的发生。蛋白质质量控制系统与肿瘤的这些行为的深层机制密切相关。在细胞内,泛素蛋白酶体途径通过对某些蛋白的降解的调控,在多种细胞进程中均起到至关重要的作用。癌症的发生发展是一个长时间、多进程的递进过程。而泛素蛋白酶体系统是一个多因子、多步骤的蛋白质降解调控体系,对这个体系中的不同因子的调控,是改变肿瘤发展进程的重要的措施。对肝细胞癌中泛素蛋白酶体途径的变化的研究也是肝细胞癌病理及治疗方法研究的热点之一。本研究利用了实验室成熟的高覆盖度、高灵敏度、高精度的定量蛋白质组学研究技术,对不同转移能力的肝细胞癌患者的组织样本以及不同转移潜能的肝癌细胞系样本进行研究,探索肝细胞癌侵袭与转移的机理,发现存在显着差异或失调的信号通路,以及在侵袭与转移过程中肝癌细胞中蛋白质质量控制系统的变化或失调,从而发现肝细胞癌在侵袭与转移过程中的细胞内各种进程发生的变化,为探索肝细胞癌发生发展的分子机制提供帮助。我们首先选取了根据肝癌tnm分型表征进行分期的不同病程阶段叁组明确的肝癌标本,应用itraq技术进行了系统的高覆盖定量蛋白质组学组研究。我们共鉴定4620个蛋白质,总定量蛋白数为3781。t1期癌组织与t1期癌旁组织相比,共筛选到差异表达蛋白330个,其中表达上调,而表达下调的蛋白有198个。t2期癌组织与t1期癌旁组织相比,共有356个差异表达蛋白,其中172个蛋白上调表达,193个蛋白下调表达。而t3期癌组织与t1期癌旁组织相比,共筛选到差异表达蛋白387个,其中185个蛋白表达上调,202个差异蛋白表达下调。这些差异蛋白分布在外源物质代谢、维生素代谢、细胞凋亡、肝脏脂肪性变、上皮细胞癌、肿瘤细胞增殖、氧化应激、细胞扩散与细胞粘附和肿瘤细胞转移等相关通路,提示这些变化可能与肝癌的发展高度相关。进一步研究发现,相比于癌旁组织,flnc蛋白的表达量在癌组织中显着上调,且随着肝细胞癌疾病病程的发展其表达量逐渐升高。这一结果还被westernblot和tcga数据库中50例肝癌的癌与癌旁样本数据证实,提示该蛋白可作为肝细胞癌病程发展过程中的一个新的潜在生物标志物。在上述实验基础上,我们选取了具有不同转移潜能的肝癌细胞系hep3b、mhcc-97l、mhcc-97h和hcc-lm6细胞系,利用实验室新近发展的基于人工杂种ubd的高效泛素化蛋白纯化技术,结合翻译后修饰鉴定的方法探索了肿瘤细胞内蛋白质质量控制系统尤其是泛素蛋白酶体途径的变化与失调情况。共鉴定潜在的泛素化蛋白2569个,以hep3b细胞系作为对照细胞系,97l、97h和lm6细胞与其进行比较,97l/hep3b组得到差异蛋白200个,其中上调蛋白109个,下调蛋白91个;97h/hep3b组得到差异蛋白215个,其中上调蛋白109个,下调蛋白106个;lm6/hep3b组得到差异蛋白97个,其中上调蛋白42个,下调蛋白55个。这些差异蛋白主要集中在细胞的侵袭转移相关的整合素信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路、上皮细胞紧密连接重塑、cdc42相关信号通路、桩蛋白信号通路、rhogdi信号通路、细胞内信号转导相关的pi3k/akt信号通路、eif2信号通路以及erk/mapk信号通路、等。这是首次从泛素化修饰水平探索肝癌转移机制的尝试。综上所述,本研究依托实验室成熟的高精度及高覆盖度的定量蛋白质组学技术平台、翻译后修饰鉴定技术平台,通过定量蛋白质组学中的itraq技术和翻译后修饰鉴定技术,以不同转移潜能的肝细胞癌患者的组织及细胞系样本作为模型,进行了深入系统的研究,揭示了肝癌转移过程中细胞分子水平及信号通路等的变化情况,建立了不同转移能力肝癌组织的蛋白质表达谱及不同转移潜能的肝癌细胞系的泛素化修饰表达谱。并发现FLNC蛋白的表达量在癌组织中显着上调,且随着肝细胞癌疾病病程的发展其表达量逐渐升高,提示该蛋白可能是肝细胞癌病程发展过程中的一个新的潜在生物标志物。本研究也为肝细胞癌的诊断与治疗提供了新的研究靶标与思路。
柏斗胜[5]2008年在《肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关分子的定量蛋白质组学研究》文中研究表明原发性肝癌是居中国第二位的恶性肿瘤,每年全世界新发肝癌的一半以上发生在我国。肝癌病人的预后非常差,手术切除被认为是根治肝癌的最好手段,但很多肝癌患者多伴有严重的门脉高压和肝炎肝硬化,由于肝脏代偿功能丧失而失去了手术机会。原位异体肝移植术能在切除肿瘤的同时根治原发灶,已成为治疗原发性肝癌合并肝硬化患者的最佳选择。但是,肝癌肝移植术后复发和转移仍是引起患者死亡和影响肝移植预后的重要原因之一,肿瘤大小、血管侵犯AFP等目前常用的肿瘤的生物学特征指标难以准确预测肝癌肝移植术后转移复发,这将不利于更好地把握肝移植适应症和术后个体化治疗方案的制定。所以,鉴定肝癌肝移植术后转移复发相关的肿瘤分子标记仍然是目前研究的重点。近年来与肝癌发生相关的蛋白质组学研究日益增多,对深刻理解和认识肝癌起到了很大的推进作用,但是,肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的蛋白质组学研究尚缺乏。通过蛋白质组学可以使我们对肿瘤的发生、发展有了更详尽的理解,并能够通过发现特异的分子标志物宋预测患者预后和治疗效果。运用新的蛋白质组学技术鉴定肿瘤相关分子标记的研究在不断地发展之中。激光显微切割技术(laser capture microdissection LCM)联合同位素标记亲和标签(isotope-codeaffinity tag ICAT)二维液相色谱质谱是近年来出现的用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术,在定量及差异表达检测上有着巨大的优势。这一技术适用于LCM所获样本量相对较少的特点,与LCM技术结合可用于筛选肿瘤相关差异蛋白质,发现具有预测和潜在治疗潜能的关键差异分子。本研究通过对肝癌肝移植患者原发瘤标本进行蛋白质组表达谱差异分析,筛选出一些有潜在应用价值的差异蛋白质,并利用RNA干扰技术对其中的Capn4蛋白进行了体内外功能学验证,发现其可能与肝癌的侵袭转移相关。利用组织芯片技术对Capn4的临床验证发现,Capn4的表达与肝癌的侵袭性相关,Capn4阳性表达可能是肝癌肝移植预后不良的新指标和潜在的治疗新靶点。第一部分肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关分子的定量蛋白质组学分析本部分的目的就是筛查肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关的关键分子。样本取自我院肝癌肝移植标本库,所有样本均有完整的临床病理资料和随访数据资料,肝癌肝移植病人原发瘤标本具有相同的疾病背景,根据临床随访复发与否资料(随访时间两年),分为复发和未复发组,激光显微切割切取同质肝肿瘤细胞,提取蛋白,分别进行稳定同位素轻、重链标记,液相色谱联合串级质谱(LC-MS/MS)鉴定分析差异蛋白,然后,从样本库中另取一组相同标准的样本,应用real-time PCR、蛋白质免疫印迹、免疫组织化学等不同方法验证选取的上调两倍以上的差异蛋白thioredoxin like 1和calpain small subunit 1(Capn4)和下调两倍以上的差异蛋白plastin 3。结果发现:质谱鉴定出具有轻、重链标记定量信息的差异蛋白149个,经内参β-actin校正数据后,其中表达上调2倍以上蛋白29个,表达下调2倍以上蛋白共23个,按geneontology进行功能分类,发现它们主要参与酶活性(49%),结合活性(13%),细胞运动(11%),信号传导(6%),转录调控(5%),酶调节(5%),转运活性(3%),凋亡(3%),和其它(5%)等各方面生物学功能。另取一组与前标准相同的复发和未复发组病人(各20例),应用real-time PCR检测了上调差异蛋白thioredoxin-like 1和下调差异蛋白plastin 3的转录水平的表达,Western blot和免疫细胞组织化学检测了上调差异蛋白Capn4的蛋白水平表达,发现同质谱鉴定结果相一致,进一步证实了质谱鉴定结果的准确性。结果表明,LCM结合定量蛋白质组学,是可行的较新的蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关差异蛋白,可能作为潜在的移植后转移复发预测新指标和治疗新靶点。第二部分差异蛋白Capn4在不同转移潜能的人肝癌细胞系中的表达和体内外功能验证本部分解析差异蛋白Capn4的生物学功能,观察其是否和肝癌的侵袭性高低相关,是否在肝癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。首先选择Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6等4种侵袭转移潜能不同的人肝癌细胞系,应用免疫细胞荧光、real-time PCR、Western blot验证Capn4在不同转移潜能人肝癌细胞系中的表达;然后,应用RNA干扰技术,化学合成叁对Capn4的siRNA,以脂质体分别转染至高侵袭转移潜能人肝癌细胞系HCCLM6内,筛选出干扰效果明显的一对siRNA,通过细胞侵袭、运动实验、细胞划痕实验、细胞克隆形成实验、MTT实验、细胞生长周期和凋亡实验等检测,观察目的蛋白Capn4表达下调后对HCCLM6体外生物学行为的影响。此外,我们构建慢病毒RNAi表达载体,并将其转染至HCCLM6内,获得稳定转染细胞株,采用裸鼠皮下接种,在体内进一步验证Capn4表达下调对侵袭转移的影响。结果发现:应用免疫细胞荧光、real-time PCR和Western blot检测Capn4在4种侵袭转移潜能不同人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM6中存在表达差异,其mRNA及蛋白表达水平随细胞侵袭转移潜能增强而升高。在化学合成的叁对siRNA中,在细胞融合度为40～50%、siRNA浓度为150nM时,应用real-time PCR检测Capn4表达的抑制率分别为63.1%,66.6%和81.6%,与阴性对照siRNA相比,差异具有统计学意义(P＜0.01),我们选择干扰效果最好的第叁对siRNA进行下面的体外干扰实验。结果发现,Capn4-s3siRNA转染48h时,Capn4表达的mRNA抑制效果最佳,转染72h时,Capn4表达的蛋白水平抑制70%以上,该实验结果提示,干扰48小时后进行功能验证实验较好。细胞侵袭、运动实验发现,相比于阴性对照组(25.3±4.34和33.3±4.65)和空白组(28.3±5.56和34.8±5.91),Capn4干扰组(10.8±2.75和16.3±3.4)穿越的细胞显着减少(P＜0.05)。细胞划痕实验发现抑制细胞分裂48h后,相比于阴性对照组和空白组,在Capn4干扰组中细胞迁移速度显着降低。应用MTT实验检测Capn4干扰后对HCCLM6细胞增殖力的影响,与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组细胞生长明显受抑(P＜0.05)。细胞克隆形成实验发现,与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组细胞克隆明显减少(P＜0.05)。但是,流式细胞仪检测细胞生长周期和凋亡的影响,发现与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组虽有差异,但无统计学意义(P＞0.05)。另外,我们构建慢病毒载体,分别将转染后空白组、阴性对照组(Lenti.Capn4-neg)、Capn4干扰组(Lenti.Capn4-s3)的叁组HCCLM6细胞(5×10~6/只)裸鼠皮下接种,6周后观察裸鼠的成瘤和肺转移。结果显示Capn4干扰组组裸鼠成瘤率(33.3%)明显低于空白组(100%)和阴性对照组(100%),且肿瘤体积较小,其中,Capn4干扰组为381±202.6mm~3,而阴性对照组为3889.6±2407.6 mm~3,空白组为4543.8±1351.8 mm~3(P＜0.001)。肺组织切片检测发现空白组、阴性对照组、Capn4干扰组叁组肺转移率分别为100%、83.3%和16.7%,单个肺转移灶的数目分别为13±1.4个、11.5±3.4个和1.3±1.6个,差异有显着性(P＜0.01);此外,Capn4干扰组肺转移灶都以Ⅰ期为主,空白组和阴性对照组还可见到第Ⅳ期转移灶。结果表明:Capn4的表达随肝癌细胞侵袭转移潜能增强而增高;在体外,抑制Capn4的表达可降低HCCLM6细胞的侵袭、运动、迁移能力和增殖能力,而对HCCLM6细胞周期和凋亡没有显着性影响。在体内实验中,Capn4表达下调后,抑制裸鼠皮下成瘤和肺转移。第叁部分下调Capn4抑制肝癌侵袭运动能力机制的初步研究为阐明下调Capn4的表达能明显抑制肝癌细胞的体内外侵袭运动能力的可能机制。我们应用明胶酶谱实验检测空白组,阴性对照组、Capn4干扰组中HCCLM6细胞MMP分泌的情况,结果发现与空白和阴性对照组相比,Capn4干扰组HCCLM6细胞MMP-2的分泌明显受抑(P＜0.001);扫描电镜检测细胞伪足的形成,发现干扰组细胞的伪足形成明显受到抑制,而且数量明显减少;应用免疫共沉淀技术发现,Capn4可能与黏着斑中的FAK和Talin相互作用,Capn4干扰后,与空白和阴性对照组相比,细胞内活化的p-FAK降低,而Talin的表达增加,说明Capn4可能介导了FAK的磷酸化和Talin的降解,从而影响黏着斑的分解和细胞迁移运动,提示黏着斑在Capn4影响肝癌细胞的迁移过程中具有重要的作用。结果表明:Capn4的下调,一方面减少细胞分泌MMP-2;另一方面影响细胞伪足的形成,减少Talin的降解,抑制FAK的磷酸化,影响黏着斑的分解和细胞迁移运动,从而抑制了肝癌细胞的体内外的侵袭和转移能力。第四部分Capn4在肝癌肝移植患者原发瘤组织中的表达及临床意义的研究本部分利用组织芯片和免疫组化技术检测192例肝癌原发瘤组织中Capn4的表达情况,比较分析Capn4的表达与临床病理特征以及生存率的关系,以受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC curve)比较肝癌原发瘤组织Capn4表达与术后肿瘤转移复发的相关性,评价Capn4作为肝癌肝移植术后预后判断指标的意义。结果发现:Capn4在原发瘤与癌旁组织之间存在差异表达(P＜0.05),Capn4表达升高与肿瘤多发、单个肿瘤最大直径＞5cm、肿瘤无完整包膜、肿瘤侵犯血管、以及肿瘤了NM分期晚等临床病理因素相关(P＜0.05),Capn4阴性组和阳性组间无瘤生存率之间存在显着性差异,而两者总体生存率之间无显着性差异;ROC曲线提示肿瘤组织中Capn4的表达越高,肝癌的转移复发可能性越高。结果表明:Capn4蛋白表达水平与肝癌肝移植的转移复发相关,可能成为预测肝癌肝移植术后转移复发的新指标。结论1.LCM结合定量蛋白质组学,是可行的较新的蛋白质组学研究策略之一,本研究筛查出一系列肝癌肝移植术后转移复发相关差异蛋白,可能作为潜在的移植术后肿瘤转移复发预测新指标和治疗新靶点。2.人肝癌细胞系中Capn4表达量的高低与细胞侵袭转移潜能强弱相关。抑制高侵袭转移潜能细胞中Capn4的表达可以降低其运动侵袭能力,提示差异蛋白Capn4通过增强肝癌细胞的运动侵袭能力来参与肝癌细胞的侵袭转移过程。3.Capn4的下调,减少了细胞分泌MMP-2;并且减少了Talin的降解,抑制FAK的磷酸化,从而抑制了肝癌细胞的体内外的侵袭和运动能力。4.Capn4在预测肝癌的侵袭力中具有一定的临床意义,Capn4阳性表达是肝癌预后不佳的信号。联合分析Capn4与其他临床病理指标,对于判断肝癌肝移植患者术后肿瘤是否有转移复发的可能,有一定的参考价值。潜在应用价值1.Capn4可作为肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的预测指标和潜在治疗靶点。2.Capn4的上游和下游调控的进一步研究,有助于揭示肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的分子机制。创新点1.利用LCM和最新蛋白质组学技术,克服了以往传统技术上的一些弱点,并且首次采用肝癌肝移植标本研究肝癌转移复发,排除了多中心发生对预后资料的影响,筛查出一系列关键差异蛋白分子。2.首次证实差异蛋白Capn4在肝癌肝移植术后肿瘤转移复发中发挥关键作用,有助于对肝癌肝移植术后肿瘤转移复发机制的理解,有助于寻找新的治疗靶点。3.Capn4可能成为预测肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的新指标。
宋海燕[6]2005年在《肝癌相关分子的蛋白质组学研究及HSP27的功能验证》文中进行了进一步梳理肝癌是诊治困难、预后极差的一种恶性肿瘤,全球肝癌发病率、病死率均位居各肿瘤前列,转移复发是影响肝细胞性肝癌(human hepatocellular carcinoma,HCC)术后生存的最大障碍。肝癌的发生发展以及转移复发均是多因素参与的多环节的病理过程,传统的单基因研究模式限制了肝癌相关因素的研究发展。近年来迅速发展的蛋白质组学研究,能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化,对于探讨疾病机理、寻找疾病诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标来说,是一种有效的高通量的研究模式,可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物、新关键分子,极大地丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。运用该研究策略,本研究通过对转移和非转移人肝细胞性肝癌组织、肝癌与癌旁组织的全蛋白质组表达谱差异分析,筛选出一些有潜在应用价值的差异蛋白质,并对其中的差异分子HSP27在肝癌组织和肝癌细胞系中进行验证,同时采用RNA干扰技术以及与癌发生、侵袭等生物学特性有关的鉴定方法对HSP27进行了功能分析。 第一部分 人肝细胞性肝癌组织转移相关的蛋白质组学研究 本部分的研究目的是应用双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)结合基质辅助的激光解吸离子化—飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)等蛋白质组学技术,对临床和病理上均发现有转移的HCC组织和未发生转移的HCC组织的全蛋白质差异表达谱进行分析,筛查在转移过程中发挥重要作用的差异蛋白分子。 选择在临床和病理上提示有转移和未发生转移的肝细胞癌组织各6例,提取肝癌组织总蛋白,应用非线性pH3～10,长24cm的固定pH梯度的IPG胶条和12.5%的SDS-PAG进行双向凝胶电泳分离总蛋白,每一例样本均分别进行2次双向电泳以保证重复性,用Image Master软件对两组的全蛋白质组表达谱进行差异分析。结果在相同条件下,转移组(M组)平均检测到1102±56(n=12)个
于妍妍[7]2010年在《人肝癌转移相关的比较蛋白质组学和系统生物学研究》文中研究说明本论文研究工作的内容涉及化学学科的分析化学、化学生物学和临床医学学科的肿瘤学,是属于交叉学科的研究。研究的手段主要是通过比较蛋白质组学和系统生物学的分析技术和手段,揭示肝癌细胞侵袭转移的分子机制。本论文工作的主要贡献是(1)发现炎症通路和抗凋亡通路在肝癌细胞转移过程中起了非常重要的作用；(2)在肝癌细胞系中共鉴定出7,034种非冗余的蛋白质,系统生物学研究中与转录组数据进行了初步对接,揭示TPAE值的高低与蛋白质的亚细胞定位有紧密联系(TPAE,转录本到蛋白质的放大效率)；(3)分泌蛋白质组检测出低丰度的SDC4和ANGPTL4,发现转移相关的重要膜蛋白MET也可以通过水解作用分泌到细胞外,并发现HSPA5在高低转移细胞系中发生了显着的亚细胞定位变化；(4)对转移性肝癌细胞的O型糖基化修饰和降解作用进行了初步研究,发现部分溶酶体和细胞膜的蛋白质通过降解作用获得活性；(5)在方法学方面,证明2DE、DIGE、iTRAQ、ID SDS-PAGE-RPLC-LTQ Obitrap等技术在肝癌机制研究中的独特作用；在分泌蛋白质组研究中发展了新方法,有效抵消了细胞碎片等对结果的干扰；发展了磁性材料富集色氨酸肽段的新技术。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国和亚非地区常见恶性肿瘤,其发病率和死亡率在恶性肿瘤中排第叁位。而肝癌的转移和复发是影响其远期疗效的重要因素。因此,阐明肝癌转移复发的分子机制,寻求特异性早期诊断标志物分子,对提高HCC患者生存率、改善生活质量均具有重要意义。本研究课题以遗传背景相似而转移潜能不同的人肝癌细胞系为模型,利用多种蛋白质组学技术和生物信息学工具,在蛋白质差异表达、系统生物学、亚细胞定位和翻译后修饰作用等方面对肝癌的转移机制进行了研究。论文分六个部分进行论述：第一部分：前言。这一章重点概述了蛋白质组学领域的技术发展情况,并针对其在肝癌转移机制和靶标蛋白质的研究进展方面进行了综述。比较了现在蛋白质组学常用的定量方法,并对其各自的优势和局限性进行了讨论。同时,本章论述了亚细胞蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学、系统生物学和生物信息学等在技术发展和生物应用等方面的进展。此外,对本论文研究中的转移性肝癌细胞模型的建模过程和转移能力也进行了简述。第二部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的比较蛋白质组学研究。本部分中首次对四个不同转移潜能的人肝癌细胞系进行系统的研究,代替传统的单基因生物解读方法,利用生物信息学技术在生物通路和蛋白质相互作用网络的水平上进行研究,发现与炎症和抗凋亡相关的NFκB通路被激活,并发现与肝癌转移能力正相关表达的HDGF、hsp27、HPGD矛(?)STMN1等分子,利用RNAi技术敲低HPGD的表达,发现肝癌细胞发生凋亡。此外,2DE和DIGE结果中均发现“多点一蛋白”现象,提示翻译后修饰作用在蛋白质中广泛存在。第叁部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的系统生物学研究。利用1DSDS-PAGE-RPLC-LTQ Obitrap技术平台在四个不同转移潜能的肝癌细胞系和Hep3B肝癌细胞系中,一共鉴定到7,034种非冗余的蛋白质。以HLPP数据库中正常人肝组织的蛋白质组学数据为对照,发现增殖能力的增强与肝癌的发生相关,而抗凋亡能力的增强促进肝癌细胞的转移。与转录组芯片数据的对接发现,转录组与蛋白质组的表达量水平没有相关性,但有意义的发现是TAPE值与蛋白质的亚细胞定位存在密切的联系,TAPE值偏低的蛋白质聚集于细胞核和细胞外分泌蛋白质,而TAPE值偏高的蛋白质主要聚集于细胞浆中。第四部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的分泌蛋白组学研究。本部分研究中结合iTRAQ定量标记技术发展了一种新方法,有效地抵消了细胞破碎等污染对分泌蛋白质研究的干扰。分泌蛋白质组检测出低丰度的SDC4和ANGPTL4,其表达量与肝癌转移正相关,并发现促肝癌转移的膜蛋白MET也可以通过水解等作用分泌到细胞外,本研究中还发现HSPA5在高低转移细胞系中发生了显着的亚细胞定位变化,这些发现与癌症转移的关系还有待进一步的研究。第五部分：不同转移潜能的人肝癌细胞系的蛋白质翻译后修饰作用研究。结合酶切等生物化学方法和DIGE技术对O型糖基化修饰做了初步研究,发现其是造成弱碱性条件下出现蛋白质串点的主要原因。利用PROTOMAP软件和第叁部分的实验结果研究了蛋白质降解谱,发现部分溶酶体和细胞膜的蛋白质通过降解作用获得活性,如HEXB、ASAH1和MET等,这些蛋白质的功能集中于水解作用和细胞粘附。在MEROPS蛋白酶数据库中找到作用于这些蛋白质的MMPs和caspase等在肝癌转移过程中发挥重要作用的蛋白酶。第六部分：磁性材料富集血清中低丰度蛋白的应用研究。本部分研究建立了酰肼基团修饰的磁珠材料富集色氨酸肽段的方法,并首次对血清中的色氨酸肽段进行了富集,样本中的色氨酸肽段含量从富集前的19.4%提高到80.2%。本方法有效地降低了血清样品的复杂度,在富集后的血清样品中新鉴定到113个色氨酸肽段和37个含有色氨酸的蛋白质。
黄尧[8]2016年在《基于蛋白质组学的肝细胞癌亚型的分子标志物筛选与临床验证》文中研究指明目的分析不同临床病理特征的HCC亚型的分子表型的特征,初步探讨其不同生物学特征的分子机制,筛选潜在的分子标志物并验证。1.探讨影响HCC根治性切除术后不同时期复发/转移的临床病理因素;2.比较不同肿瘤数目的HCC亚型的蛋白质组学的特征,初步了解不同肿瘤数目的HCC亚型生物学行为差异的分子基础,寻找潜在的分子标志物并验证;3.比较不同肿瘤大小的HCC亚型的蛋白质组学的特征,初步了解不同肿瘤大小的HCC亚型生物学行为差异的分子基础,寻找潜在的分子标志物并验证;4.探讨HK2表达情况与HCC根治性切除术后复发/转移的关系。方法1.回顾性分析HCC患者根治性切除术后的复发/转移情况,以12项相关的临床病理因素为变量,进行单因素和多因素logistic回归分析,按不同复发/转移时期分析其影响因素。2.iTRAQ标记的定量蛋白质组学的方法,比较单发性和多发性HCC的全体蛋白质组的特征,筛选差异表达蛋白,并应用生物信息学技术分析其分子功能、信号通路等;筛选出不同肿瘤数目的HCC亚型潜在的分子标志物并在m RNA和蛋白水平进行验证。3.iTRAQ标记的定量蛋白质组学的方法,比较微小肝癌、小肝癌、大肝癌、巨大肝癌的全体蛋白质组的特征,筛选差异表达蛋白,并应用生物信息学技术分析其分子功能、信号通路等;筛选不同肿瘤大小的HCC亚型的潜在的分子标志物并在m RNA和蛋白水平进行验证。并对差异蛋白MT1G在HCC中的作用进行初步的分子机制的研究。4.采用Western Blot检测差异表达蛋白HK2在HCC癌组织样本中的表达情况,并与HCC复发/转移的相关临床病理因素进行比较研究。回顾性分析HCC患者根治性切除术后的复发/转移情况,以临床病理因素和HK2表达情况为变量,进行单因素和多因素logistic回归分析,分析其影响因素。结果1.HCC根治性切除术后12个月内复发/转移的独立危险因素为发现方式、术前血清AFP值、肿瘤大小和癌细胞分化程度;术后12~24个月复发/转移的独立危险因素为术前血清AFP值和肿瘤数目;术后>24个月复发/转移的独立危险因素为术前血清AFP值、肿瘤大小、肿瘤包膜完整性、癌细胞分化程度。2.在多发性HCC(MC组)和单发性HCC(SC组)的癌组织中,与相应的癌旁组织(MN组和SN组)比较,分别鉴定出107种和330种差异蛋白。在MC组,差异蛋白主要集中在UBC信号通路和NFκB信号通路;而在SC组,差异蛋白主要集中于ERK信号通路和NFκB信号通路。HSD17B13只在MC组下调,而HK2只在SC组上调。3.将癌组织和相应的癌旁组织相比较,在微小肝癌、小肝癌、大肝癌、巨大肝癌分别鉴定出88种、69种、118种和215种差异蛋白。在各个不同肿瘤大小的HCC亚型中,ERK1/2和AKT信号通路的变化在肿瘤发生、发展中均发挥了重要作用。在微小肝癌和巨大肝癌,发现了特有的信号通路的变化。确认了一组与HCC的肿瘤大小显着相关的差异蛋白。MT1G在HCC癌组织中表达降低,与肿瘤大小呈负相关,其过表达可以抑制HCC细胞增殖,促进细胞凋亡。4.HK2表达情况与HCC的发现方式、镜下脉管癌栓、肿瘤大小、肿瘤数目相关。HK2高表达组术后累积生存率显着低于低表达组。HK2为HCC根治性切除术后复发/转移的独立危险因素。结论1.HCC根治性切除术后不同时期复发/转移的影响因素不同。肿瘤数目和肿瘤大小是影响HCC术后不同时期复发/转移的独立危险因素。2.不同肿瘤数目的HCC亚型有着不同的分子学特征和信号通路。筛选并鉴定出HSD17B13和HK2两种差异蛋白,可做为不同肿瘤数目的HCC亚型的潜在的分子标志物。3.不同肿瘤大小的HCC亚型具有不同的分子学特征和信号通路。发现了与HCC的肿瘤大小密切相关的一组差异蛋白,可做为不同肿瘤大小HCC亚型的潜在的分子标志物。差异蛋白MT1G可能通过调节AKT信号通路抑制HCC的增殖。4.HK2表达水平与HCC根治性切除术后的预后密切相关,可作为判断HCC复发/转移和预后的一个有效的分子标志物。
陈滨[9]2006年在《人HCC侵袭、复发相关分子的蛋白质组学研究及S100A9蛋白的表达验证》文中研究说明目的：应用比较蛋白质组学策略，对有侵袭、复发的人HCC组织标本的蛋白质表达谱中差异蛋白质点进行比较分析，筛查与HCC侵袭、复发相关的蛋白质分子，初步探讨其临床应用价值。 材料和方法：选择经临床和病理证实有侵袭和复发的人HCC组织标本(以无侵袭、复发的HCC为相应对照)各5例，提取肝癌组织总蛋白，应用IPG胶条(pH3～10NL，13cm)的和12.5％的SDS-PAGE进行双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)分离蛋白，用Image Master扫描及分析软件对相应比较组的全蛋白质表达谱进行差异点分析，胶内酶解差异点所得的肽段应用基质辅助的激光解吸离子化—飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption／ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，数据送入NCBI非冗余数据库，通过MASCOT搜索引擎检索、鉴定出相应蛋白质。并应用免疫组织化学、Western blot分析、RT-PCR等技术对分别筛选出的S100A9蛋白在组织学水平、蛋白质水平和mRNA水平进行了表达验证。扩展免疫组化检测S100A9在正常肝组织、乙肝后肝硬化组织和不同表型肝癌组织标本中的表达，联系临床病理资料，初步探讨其临床应用价值。 结果：在相同条件下，侵袭组(Ⅰ组)平均检测到1079±56(n=3)个蛋白点，非侵袭组(NI组)为1058±73(n=3)个。以其中2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶，进行2组间的匹配分析，筛选出差异2倍及以上且出现频率大于等于50％的蛋白点31个。其中1235号点在NI、Ⅰ组织中的表达存在显着差异，胶内校正后的灰度平均值比较Ⅰ是NI的13.3倍。结果鉴定出S100A9、S100A8、HSP27、Prx2、Annexin Ⅳ等22
曹晶[10]2009年在《肝癌细胞分泌蛋白和糖蛋白的蛋白质组学研究》文中研究指明本博士论文工作的主要贡献为:针对分泌蛋白质组研究的难点问题,开展了一系列的研究。发展了一种快速、简单、高效和普适性的富集方法来浓缩纯化大体积高盐体系中的分泌蛋白质,并且在肝癌细胞的分泌蛋白质组研究中得到了很好的应用;通过特别设计的实验来富集大体积溶液中的低分子量蛋白质,富集到的蛋白质分子量最小只有4 KDa;建立了具有高转移潜能的人肝癌细胞分泌蛋白质组表达谱数据库,这一数据库对肝癌转移相关研究具有很高的价值。应用糖蛋白质组学的方法,对分泌蛋白质的糖基化位点进行了高通量研究,鉴定到了172个新位点,包括CD44和laminin等与肝癌转移密切相关的蛋白质的新位点信息。利用这种方法,获得了高纯度的分泌蛋白(高达96.4%),解决了分泌蛋白质研究中的污染难题。应用生物信息学分析方法对肝癌细胞分泌蛋白质组数据进行了分子功能、信号通路和蛋白质相互作用等深入的数据分析和挖掘;针对糖基化位点鉴定的可靠性问题,对基于~(16)O/~(18)O标记的糖基化位点进行分析比较,发现经两种标记鉴定到的糖基化位点一致性很好,首次用实验数据回答了糖基化位点研究中常见的一个问题。分泌蛋白质被认为包含了疾病早期检测和诊断的标志物,正吸引着越来越多的科研工作者的目光,近年来,分泌蛋白质组研究也取得了长足的进步。除了比较正常的和疾病的,或者不同生理状态的分泌蛋白质的表达差异的研究外,分泌蛋白质的数据库的建立也备受关注。然而,分泌蛋白质组研究存在下面四个亟待解决的问题:1)分泌蛋白容易被胞内蛋白污染,难鉴定到纯的分泌蛋白;2)鉴定低丰度和低分子量的分泌蛋白质还具有很大的挑战;3)有关分泌蛋白质的翻译后修饰研究开展得很少;4)对鉴定到的重要分泌蛋白质的功能研究开展得很少。本论文针对上述难题,开展了一系列的研究,获得了满意的结果。由于蛋白质糖基化在许多重要的生理和病理过程中起着重要的作用,近年来,蛋白质糖基化修饰研究也备受关注。由于糖蛋白/糖肽富集技术和生物质谱技术等的发展,大规模的糖蛋白质组学研究得以实现,尤其对N-型糖蛋白的糖基化位点的鉴定已经积累了不少研究成果。N-型糖蛋白具有和经典的分泌蛋白一样的基于内质网-高尔基体的生物合成转运路径,经典的分泌蛋白几乎都是N-型糖蛋白。基于此,本论文对肝癌细胞分泌蛋白质的糖基化位点进行了大规模的鉴定,对其糖型进行了初步分析。肿瘤相关的研究尽管备受重视,也取得了相当多的成绩,但是肿瘤如何蔓延并破坏它们的宿主器官仍然是一个谜。因实体瘤(包括肝癌)而死亡的人数的90%是由于肿瘤转移造成的,因此,肿瘤转移的问题越来越受到重视。肝癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国,肝癌是癌症中的第二大杀手。为了更好的研究肝癌转移的机制,复旦大学中山医院肝癌研究所建立了人肝细胞癌转移裸鼠模型和具有不同转移潜能的细胞模型。本论文的研究以其中具有高转移潜能的HCCLM3和转移潜能相对低的MHCC97L为材料。研究主要是将蛋白质组学和糖蛋白质组学方法应用于肝癌细胞分泌蛋白的研究,在肝癌及其转移的基础研究中获得了非常丰富的蛋白质组信息。本论文由七部分组成。第一章绪论首先概述了分泌蛋白质组研究的七个方面,及其研究进展和研究瓶颈;综述了蛋白质糖基化修饰研究现状,尤其对糖蛋白/糖肽的分离富集研究进展做了很好的综述;概述了肝癌及其转移的蛋白质组学研究进展,说明了本论文选题目的和意义。第二章所述工作对肝癌细胞分泌蛋白进行了初步研究。在第一节,对常用的叁种浓缩纯化分泌蛋白质的方法(超滤法,透析法,沉淀法)进行了比较研究,实现了研究的基本目的:探索肝癌细胞系LM3在条件培养基中的最佳培养方法;比较不同的浓缩纯化分泌蛋白质的方法;初步了解转移潜能高的肝癌细胞分泌蛋白质组;找到目前分泌蛋白质组研究的瓶颈;为后续分泌蛋白质组研究打下基础。第叁章所述工作发展了一种快速、简单、高效的和普适性的富集方法来浓缩纯化分泌蛋白质。首次采用纳米LTL沸石材料富集大体积培养基中的分泌蛋白,使用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE(小分子电泳胶)进行一维电泳分离,切取蛋白条带进行胶内酶解,再进行在线的HPLC-ESI-MS液质联用分析。共鉴定到1474个非冗余蛋白,其中有97个蛋白质的分子量小于15 KDa,这些分子在分泌蛋白质组研究的相关文献中鲜有报道。鉴定到的蛋白质很多是与肝癌的发生发展和侵袭转移密切相关的,如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是被广泛应用的肝癌的生物标志物,骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)能够促进肝癌细胞的侵袭,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是肝癌细胞破坏基底膜,进行侵袭转移的重要分子。结果表明,分泌蛋白质组研究是寻找疾病生物标志物的有效方法,纳米沸石LTL富集分泌蛋白,接1D SDS-PAGE-LC-ESI-MS/MS分离鉴定,是研究分泌蛋白质组的有效的方法。尤其较传统的浓缩纯化方法,纳米沸石富集法是更灵活的方法,它可以特别地、有效地富集低分子量蛋白质,富集鉴定到的蛋白质中,分子量最小的只有4 KDa。第四章所述工作对肝癌细胞分泌蛋白质的糖基化修饰进行了研究。在第一节,研究了肝癌细胞分泌蛋白质的糖基化位点。首先采用亲水法和肼化学法这两种互补的方法富集糖肽,结合nanoLC-ESI-MS/MS分离分析,对分泌蛋白质的糖基化位点进行了高通量研究,鉴定到了194个糖蛋白的300个糖基化位点,其中172个是新位点,包括CD44和laminin等肝癌转移相关重要蛋白的新位点信息。利用这种方法,获得了高纯度的分泌蛋白(高达96.4%),解答了分泌蛋白研究中的污染问题。首次通过实验直接比较这两种方法。就对糖肽的选择性而言,肼化学法优于亲水法,选择率分别是92.9%和51.3%,然而,就富集鉴定到的糖基化位点而言,亲水法优于肼化学法,分别鉴定到265个和159个糖基化位点。这些发现为今后糖蛋白质组学研究的方法选择提供了很好的参考。在第二节,使用多种凝集素印迹,对肝癌细胞分泌蛋白质的糖型进行了初步的分析,初步比较了具有不同转移潜能的人肝癌细胞(HCCLM3和MHCC97L)分泌蛋白的糖基化差异,为后续研究打下了基础。第五章工作主要是整合了第二、第叁和第四章肝癌细胞分泌蛋白质组数据,利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)等软件对整合数据进行了深入的数据挖掘。了解了其可能的亚网络构成和相互作用,其介导肝癌细胞间,胞外与胞内相互作用,及肝癌细胞分泌蛋白参与的重要的信号通路。了解了其重要的节点分子及其与相互作用分子的联络,以便指导进一步研究的开展。第六章工作主要是针对糖基化位点鉴定的可靠性问题,对基于~(16)O/~(18)O标记的糖基化位点进行分析比较。发现经两种标记鉴定到的糖基化位点一致性很好,证明在富集糖肽后进行位点标记,基于~(16)O标记的结果是可信的。基于~(16)O标记的糖基化位点鉴定结果是否可靠和基于~(18)O标记是否具有很大的优势是常见的问题,无疑,本章工作首次基于实验数据很好地回答了这一问题。第七章是全文总结和展望。总结了主要的研究结论,提出了进一步的研究设想。
参考文献：
[1]. 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究[D]. 崔杰峰. 复旦大学. 2004
[2]. 比较蛋白质组定量分析及其在疾病研究中的应用[D]. 于雁灵. 复旦大学. 2004
[3]. 正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究[D]. 代智. 复旦大学. 2006
[4]. 肝细胞癌转移特性的定量蛋白质组学研究[D]. 齐英姿. 中国人民解放军军事医学科学院. 2016
[5]. 肝癌肝移植术后肿瘤转移复发相关分子的定量蛋白质组学研究[D]. 柏斗胜. 复旦大学. 2008
[6]. 肝癌相关分子的蛋白质组学研究及HSP27的功能验证[D]. 宋海燕. 复旦大学. 2005
[7]. 人肝癌转移相关的比较蛋白质组学和系统生物学研究[D]. 于妍妍. 复旦大学. 2010
[8]. 基于蛋白质组学的肝细胞癌亚型的分子标志物筛选与临床验证[D]. 黄尧. 福建医科大学. 2016
[9]. 人HCC侵袭、复发相关分子的蛋白质组学研究及S100A9蛋白的表达验证[D]. 陈滨. 广西医科大学. 2006
[10]. 肝癌细胞分泌蛋白和糖蛋白的蛋白质组学研究[D]. 曹晶. 复旦大学. 2009
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