1.长沙市第八医院耳鼻喉科 湖南长沙 410100；2.长沙卫生职业学院 湖南长沙 410100；*
3.中南大学湘雅三医院耳鼻喉科 湖南长沙 410013
【摘 要】目的：探讨TXR1与CD44基因沉默后细胞对紫杉醇的敏感性，探究鼻咽癌紫杉醇耐药性逆转与TXR1、CD44基因沉默的关联；方法：通过脂质体介导转染方法，将TXR1-siRNA、CD44-siRNA转染至不同鼻咽癌紫杉醇耐药细胞株，利用实时荧光定量RT-PCR检测人鼻咽癌亲本细胞种的TXR1及CD44基因的相对表达量，用集落形成实验分别考察TXR1、CD44在基因沉默后不同耐药细胞株耐药性的变化；结果：TXR1-siRNA或CD44-siRNA干扰后，TXR1与CD44基因在耐药细胞中的表达表达均得到了有效的抑制，通过TXR1-siRNA或CD44-siRNA干扰紫杉醇耐药细胞后，紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）对紫杉醇的敏感性出现了增高。TXR1基因沉默后，紫杉醇耐药细胞的IC50值分别为：5.41±0.40、6.41±0.09和5.70±0.27 ng/mL（相应的空白组分别为11.2±0.5、12.2±0.2和10.2±0.30 ng/mL），CD44基因 siRNA干扰后，上述三种细胞的IC50值分别为：6.57±0.38、6.81±0.19和7.34±0.33 ng/mL（相应的空白组分别为11.0±0.6、12.4±0.2和10.5±0.8 ng/mL）；结论：在鼻咽癌细胞中TXR1 mRNA或CD44 mRNA的有效抑制均能使两种基因的表达下降，表明CD44基因与TXR1两者的表达具有潜在的交互作用，运用siRNA沉默TXR1与CD44基因后，紫杉醇耐药细胞的耐药性可得到有效的逆转，因此TXR1与CD44基因可成为鼻咽癌治疗的潜在靶分子。
【关键词】鼻咽癌；紫杉醇耐药性；TXR1；CD44基因；RNA干扰；
Studies on the Correlation Between the Expression of TXR1/CD44 Gene with the Taxol Resistant of Nasopharyngeal Carcinoma Cells
Ying Peng1 Hongwei Peng2 Guolin Tan*，3
（1.Department of Otoalryngology，Eighth Hospital of Changsha；，Changsha，Hunan 410100）
（2.ChangSha Health Vocational College，Changsha，Hunan 410100）
（3.Department of Otoalryngology–Head Neck Surgery，Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410013）
Abstract Objectives To investigate the correlation between the expression of TXR1 or CD44 gene with the paclitaxel-resistant of human nasopharygeal carcinoma（NPC）cells.To explore the correlation between the reverse of NPC paclitaxel-resistant and the silence of TXR1 and CD44 gene.Methods Lip2000 was used as carrier for transfect siRNA into different NPC cell lines.The expression of TXR1 and CD44 gene in different NPC cells was determined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RT-PCR）.The taxol resistance of NPC cells was investigate by Colony formation assay.Results The expression of both TXR1 and CD44 gene in taxol-resistant NPC cells was significantly decreased after the transfection of TXR1-siRNA or CD44-siRNA.Inhibition of both TXR1 and CD44 gene could lead to significant increment of taxol sensitivity of taxol-resistant NPC cells.After the transfection of TXR1-siRNA，the IC50 responses of HNE-2/Taxol，CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol to taxol were 5.41±0.40，6.41±0.09 and 5.70±0.27 ng/mL，respectively，while the corresponding values for the control cells were 11.2±0.5，12.2±0.2 and 10.2±0.30 ng/mL，respectively.And after the transfection of CD44-siRNA，the IC50 responses of HNE-2/Taxol，CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol to taxol were reduced to be 6.57±0.38，6.81±0.19 and 7.34±0.33 ng/mL，respectively，while the corresponding values for the control cells were 11.0±0.6，12.4±0.2 and 10.5±0.8 ng/mL，respectively.Conclusion Inhibitation of TXR1 mRNA or CD44 mRNAthe could reduce the expression of both TXR1 and CD44 gene.The reciprocal inhibition expression between CD44 gene and TXR1 indicated the implicative interreaction between these two genes.The taxol sensitivity of taxol-resistant NPC cells could be partly reversed by silencing the TXR1 or CD44 gene，revealling that both TXR1 and CD44 gene play important roles in taxol resistance of NPC cells and could be regarded as effective targets for NPC treatment.
Keywords Nasopharyngeal carcinoma，taxol-resistance，TXR1，CD44 gene，RNA interference
鼻咽癌（NPC，Nasopharyngeal carcinoma）是一种常见的耳鼻咽喉头颈部位恶性肿瘤之一，从全球范围来看，其发病状况具有很强的地域性，主要集中在中国南部以及一些东南亚国家，年均发病率为百万分之十五至二十[1]。近年来，放疗与化疗的一些新手段、新方法使鼻咽癌的疗效得到了很大的提高，总体五年生存率从上个世纪八十年代的50%提高到了上个世纪末的70%[2]，但15～58%的患者都出现了的病情复发以及不得不重复治疗的现象[3，4]。紫杉醇是一类新型的鼻咽癌药物，且在临床上取得了较好的疗效[5]。然而临床研究发现，患者在长期使用紫杉醇药物后，由于肿瘤细胞的产生了耐药性，会导致治疗效果下降。因此，为了维持紫杉醇药物的长期治疗效果，就需阐明肿瘤细胞产生耐药性的机理以及寻求如何逆转其耐药性的方法。这也是了临床上两个亟待解决的重大问题。
紫杉醇耐药基因1（TXR1，taxol-resistance gene 1），是一种近年来发现的耐药基因[6]。为了进一步探求TXR1与肿瘤细胞耐药性间的关系，研究者做了更深入的研究并发现TXR1产生耐药性的原因与血小板反应蛋白（thrombospondin-1，TSP1）的表达密切相。TSP1在之前的研究中就表明具有抗血管生成以及在肿瘤形成过程中促使其凋亡的功能[7]。而TXR1的异常存在能降低TSP1的表达水平，从而导致了肿瘤细胞耐药性的产生。为了进一步证实TSP1在紫杉醇耐药性中的重要作用，研究者对TXR1的紫杉醇耐药性细胞进行TSP1给药，结果发现给药后，紫杉醇的药效又得到了很大程度提高[8]。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤控制与有效治疗（包括放疗与化疗）的重要阻碍因素[9，10]。已被广泛认为的鼻咽癌中CSCs的一个重要标志物为CD44[11]，CD44是一种I型跨膜糖蛋白，主要在间质与神经外胚层组织中的几种类型细胞内被表达。CD44是一种重要的功能粘性蛋白，也是透明质烷（HA，hyaluronan）最主要的的受体分子[12]。肿瘤的一系列生物学行为都涉及到CD44与HA的结合作用，包括肿瘤的恶化、转移与扩散[13]。进一步的研究表明，CD44在鼻咽癌病变过程中起的重要作用也为开发有效的鼻咽癌治疗方法提供了新的思路[14，15]。
基因耐药逆转是针对肿瘤耐药逆转一种新开发的技术，包括RNA干扰逆转、癌基因工程瘤苗、核酸酶逆转以及抗癌基因的倒入技术等。其中RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术在肿瘤的治疗与耐药逆转中已得到了大量的应用。RNAi是用RNA分子来抑制某种基因表达的一个生物学过程。常用同源性的、结构高度保守的双链RNA特异性地使靶体mRNA降解，达到沉默相应基因的目的。该技术具有遗传性、高效与高特异性、经济操作简便等特点，在基因疾病与肿瘤治疗方面得到了有效的应用。最近有大量的研究结果表明，RNAi技术在逆转肿瘤MDR耐药性方面也取得了显著的成效。
肿瘤细胞耐药性是阻碍化疗药物发挥功效的主要原因。其耐药性的及时监测与耐药性的逆转将会有效地提高癌症的治疗效果。本研究以人鼻咽癌亲本细胞（HNE-2、CNE-1和5-8F）以及人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）为研究对象，用RT-PCR方法检测TXR1与CD44基因。并揭示出其与肿瘤细胞耐药性的关系，为耐药性的监测提供有效参数依据。筛选利用siRNA来抑制TXR1与CD44基因，并检测RNA干扰后细胞的TXR1与CD44基因表达水平的变化，并进一步通过细胞毒性实验考察细胞对紫杉醇药物的敏感性。
1 材料和方法
1.1 材料
实验用到的三株鼻咽癌亲本细胞有三种HNE-2、CNE-1、5-8F，均由中南大学湘雅医学院提供，相应的三种细胞的紫杉醇耐药细胞系HNE-2／Taxol、CNE-1／Taxol、5-8F／Taxol由本实验室诱导得到。
RPMI-1640培基购自美国Hycolon公司，紫杉醇（Paclitaxol）注射剂购自北京四环医药科技股份有限公司，TXR1、β-actin引物购自生工生物工程（上海）有限公司，IP细胞裂解液购自中国碧云天生物技术研究院，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix与ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，Gene Amp PCR system 9700购自美国Applied Biosystems，Mastercyler gradient 型 PCR 扩增仪购自德国 Eppendof 公司。
1.2 方法
1.2.1 人鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中TXR1与CD44基因 RNA干扰
siRNA oligo序列为，TXR1-22 正义链：5’GCGGCCACAUAAUUACCAATT3’；TXR1-22 反义链：5’UUGGUAAUUAUGUGGCCGCTT3’；CD44-3980正义链：5’GATCCCTTTTTGGAT 3’；CD44-3980反义链：5’AGCTATCCAAAAAGG 3’；Negative 正义链：5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3’；control 反义链：5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3’。转染的载体为阳离子脂质体（LipofectamineTM2000），核酸为靶向TXR1或CD44基因的siRNA，转染细胞为人鼻咽癌紫紫杉醇耐药细胞：HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol。用PBS溶液对六孔板进行洗涤（3次）后，除去洗涤液，小心甩干六孔板；再向六孔板孔中加入OPTI-MEM细胞培养液（800 μL），在培养箱中培育30 min；配置转染液前体溶液：（溶液A为4 μL siRNA（取自TXR1-22、CD44-3980、DEPC、Negative control中的一种）与100 μL OPTI-MEM细胞培养液混合得到，其中Negative control为阴性对照组；溶液B由Lip2000（8 uL）与OPTI-MEM细胞培养液（100 μL）混合得到）；将A液与B液混合、静置20 min后得到转染溶液，将转染溶液加入六孔板中，摇匀，在培养箱中进行培养（37 oC，5% CO2），培养6 h后倒掉培养基，换上RPMI-1640培养液；24 h后对细胞换液，用PBS溶液对六孔板进行洗涤（3次），并加入含血清培养液（1 mL），直到细胞长满，在24-48 h内根据细胞状态收取细胞；实验分组（空白对照组：4 μL的溶液A（DEPC水）+ 8μL的溶液B；NC照组：4 μL的溶液A（Negative control液）+ 8 μL的溶液B；siRNA转染组：4 μL的溶液A（TXR1-22或CD44-3980）+ 48μL的溶液B。）
1.2.2 PCR检测siRNA转染后细胞的TXR1与CD44基因表达
转然后用RNA抽提试剂盒（Total RNA Kit II）抽提细胞的总RNA，紫外分光光度仪定量。去3 μg总RNA进行逆转录反应，反应体系为20 μL。不同引物进行PCR反应，PCR引物序列设计为，TXR1：正义链：5’GCTTTCTTC ATTTTCTTCTG3’，反义链：5’GTTCC AATCCTGCCCA3’，PCR 扩增产物长度为280 bp；β-actin：正义链：5’GGACCTGACTGACTACCTC3’，反义链：5’TCATACTCCTGCTTGCTG3’，PCR 扩增产物长度为540 bp；CD44-T7：正义链：5’CAAGGTCGGGCAGGAAGAG3’，反义链：5’TAATACGACTCACTATAGGG3’，PCR 扩增产物长度为320 bp。扩增反应步骤为：将样品置于荧光定量PCR仪上，预变性1 min（95 oC）；变性 30 s（95 oC）；退火30 s（55 oC），延伸30 s（72 oC），进行40个循环；继续延伸10 min（72 oC）；退火15 s（60 oC）；变性 15 s（95 oC）。反应结束后，低温（4 oC）保存。以β-actin样品为内参比，根据扩增曲线得到相应样品的Ct值，ΔCt为待测基因与内参β-actin基因Ct的差值。待测细胞中的TXR1或CD44基因的mRNA相对表达量为2-ΔCt。
1.2.3 细胞集落形成实验
实验分为空白组、阴性对照组、siRNA干扰组，分别为，空白组：不经RNA处理的CNE1/Taxol耐药细胞；阴性对照组：用等浓度的阴性siRNA和Lip2000处理的CNE1/Taxol耐药细胞；siRNA干扰组：用等浓度CD44-3980siRNA或TXR1siRNA和Lip2000处理的CNE1/Taxol耐药细胞。
取转染并培育24 h后的细胞进行消化分散处理；细胞计数：用计数板分别对不同组细胞进行计数，并通过加入培养基来调控细胞的浓度；细胞种板：将96孔板分成不同的部分，分别植入不同组群细胞，并使开始时细胞的数量保持一致，再将96孔板置于培养箱中过夜（37 oC，5% CO2）；加药：在上述96孔板不同组群中，分别加入不同浓度的紫杉醇（0，5，10，15，20 ng/L），置于培养箱中培养24 h（37 oC，5% CO2），然后用PBS液洗涤96孔板三次，再向各孔加入含血清的1640培养基（1 mL），最后放入培养箱培养；染色：待96孔板中出现可见细胞克隆时终止培养，除去旧培养液用D-Hank’S液洗涤两次，空气干燥后，加入甲醇固定30 min，除去甲醇，加入Giemsa染色液浸泡30 min，用流水洗掉染液，空气中干燥；计数：分别统计不同组群中细胞的集落数。
细胞集落抑制率的计算公式如下：
集落形成率 = 集落数目/接种细胞数×100%
集落抑制率 =（1-实验组集落形成率/对照组集落形成率）×100%
药物半数一致浓度IC50的计算：
以药物不同浓度对细胞集落抑制率作图，可得到剂量反应曲线，将得到的曲线进行线性拟合，根据线性回归方程便可求出药物的IC50值。
1.2.4 统计学分析
数据以（M±SD）表示，即平均数数±标准差。选择t检验的统计学方法，p<0.05认为两样本差异有统计学意义，p<0.05则认为差异有极显著的统计学意义
2 结果
2.1 TXR1-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后TXR1与CD44基因的表达
2.1.1 TXR1-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后TXR1基因的表达
将空白以及TXR1-siRNA、Negative control干扰的NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）培养24 h后，对细胞内的总RNA进行提取，然后逆转录合成cDNA，分别利用TXR1与CD44基因的引物进行PCR扩增。根据目标基因与参比基因的扩增结果与2-ΔCt方法处理便可得到TXR1基因在NPC细胞以及NPC紫杉醇耐药细胞中的表达差异情况（图1）。结果显示TXR1-siRNA干扰后，TXR1基因在细胞表达水平低于空白组与NC组，且差异均有统计学意义（p < 0.05）。TXR1-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）中TXR1基因的表达水平分别为相应未经siRNA处理的的0.368±0.026、0.373±0.027、0.355±0.08倍（见表1）。
图1 TXR1-siRNA对鼻咽癌耐药细胞中TXR1 mRNA表达的影响。耐药细胞株分别为HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol（结果进行了归一化处理，设定未转染的耐药细胞TXR1 mRNA的表达量为1）。
2.1.2 TXR1-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后CD44基因的表达
对上述TXR1-siRNA干扰后的细胞，提取总RNA、逆转录合成cDNA后，real time RT-PCR检测TXR1表达的同时，利用CD44基因的引物进行PCR扩增，检测CD44 mRNA表达水平。根据目标基因与参比基因的扩增结果与2-ΔCt方法处理便可得到CD44基因在NPC细胞以及NPC紫杉醇耐药细胞中的表达差异情况。结果显示TXR1-siRNA干扰后，CD44基因在细胞表达水平也低于空白组与NC组，且差异有统计学意义（p < 0.05）。TXR1-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）中CD44基因的表达水平分别为相应未经siRNA处理的0.434±0.053、0.650±0.047、0.649±0.014倍（见表2）。
2.2 CD44-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后TXR1与CD44基因的表达
2.2.1 CD44-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后TXR1基因的表达
将空白以及CD44-siRNA、Negative control干扰的NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）培养24 h后。提取总RNA、逆转录合成cDNA，利用TXR1基因的引物进行PCR扩增。根据目标基因与参比基因的扩增结果与2-ΔCt方法处理便可得到TXR1基因在NPC紫杉醇耐药细胞中的表达差异情况。结果显示CD44-siRNA干扰后，TXR1基因在细胞表达水平低于空白组与NC组，且差异均有统计学意义（p < 0.05）。CD44干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）中TXR1基因的表达水平分别为相应未经siRNA处理的0.541±0.040、0.550±0.010、0.553±0.026倍（见表3）。
2.2.2 CD44-siRNA干扰NPC紫杉醇耐药细胞后CD44基因的表达
述CD44-siRNA干扰后的总RNA被逆转录合成cDNA，检测Txr1表达的同时，检测了CD44 mRNA表达水平。根据目标基因与参比基因的扩增结果与2-ΔCt方法处理便可得到CD44基因在NPC细胞以及NPC紫杉醇耐药细胞中的表达差异情况。结果显示CD44-siRNA干扰后，CD44基因在细胞表达水平低于空白组与NC组，且差异均有统计学意义（p < 0.05）。CD44干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）中CD44基因的表达水平分别为相应未经siRNA处理的的0.406±0.041、0.319±0.018、0.393±0.014倍（见表4）。
2.3 TXR1及CD44基因表达抑制前后NPC紫杉醇耐药细胞对紫杉醇耐药性的变化
2.3.1 TXR1-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞对紫杉醇耐药性的变化
集落形成实验检测TXR1-siRNA转染前、后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）对紫杉醇的敏感性的变化（如图3-9所示）。集落抑制率 =（1-实验组集落形成率/对照组集落形成率）×100%，并通过拟合剂量反应曲线求出IC50值。空白组、脂质体组、阴性对照组及TXR1-siRNA干扰组分别用紫杉醇进行处理24 h后，换培基后，继续培养7-10天，观察集落形成。结果显示TXR1-siRNA转染HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol细胞后，对紫杉醇的敏感性显著增强（p<0.001）。其IC50值分别为5.41±0.40、6.41±0.09和5.70±0.27 ng/mL；而空白组的IC50值分别为11.2±0.5、12.2±0.2和10.2±0.30 ng/mL；脂质体组IC50值分别为10.9±0.3、11.2±0.4和11.8±0.8 ng/mL。表明TXR1的表达降低，部分逆转了NPC对紫杉醇的耐药性。结果如图2与表所示。
图2 TXR1-siRNA转染前后不同紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol（A图）；CNE-1/Taxol（B图）和5-8F/Taxol（C图））对紫杉醇的相应变化。a：干扰组b：阴性对照组 c：脂质体组
2.3.2 CD44-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞对紫杉醇耐药性的变化
应用集落形成实验检测CD44-siRNA转染HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol细胞前后，细胞对紫杉醇的敏感性的变化。结果显示CD44-siRNA转染HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol、5-8F/Taxol后，细胞对紫杉醇的敏感性有所增高，其IC50值分别为6.57±0.38、6.81±0.19和7.34±0.33 ng/mL；而空白组的IC50值分别为11.0±0.6、12.4±0.2和10.5±0.8；脂质体组IC50值分别为10.3±0.6、11.5±0.2和11.5±0.7。结果如图3与6所示所示。
图3 CD44-siRNA转染前后不同紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol（A图）；CNE-1/Taxol（B图）和5-8F/Taxol（C图））对紫杉醇的相应变化。a：干扰组b：阴性对照组 c：脂质体组
3 讨论
1998年，Andrew Fire等人在nature正刊上报道了一项有效且特异性较强的双链RNA干扰方法[16]，即后来被成为RNAi（Rna interference，RNA干扰）。其主要表现为dsRNA（double stranded RNA，双链RNA）介导特异性降解同源mRNA，使得信使RNA的量减少，导致转录后出现基因沉默的现象（PTGS，post transcriptional gene silencing）[17]。RNA干扰的现象几乎存于包括人类的所有真核生物的体内，如真菌、植物、昆虫、鱼类、蛙类、哺乳动物等[18]。RNAi技术是指外源dsRNA被系列RNAIII核酸酶切割成片段小分子干扰RNA（siRNA，small interfering）。新生成的siRNA能进一步与细胞内的内切酶结合形成诱导沉默复合物（RISC，RNA-induced silencing complex）。RISC会与同源mRNA结合，并对目标mRNA进行特异性的降解，从而沉默目标基因[19，20]。与其它相关基因相比，RNA干扰技术具有鲜明的特点与显著的优势，其操作简便、特异性与稳定性好。RNA干扰技术在肿瘤化疗与放疗耐药逆转中的研究也得到了广泛的开展，通过siRNA抑制肿瘤中MDR基因的表达，发现肿瘤细胞的耐药性出现了显著降低。研究者们希望通过RNAi技术实现肿瘤以及肿瘤耐药细胞相关基因的沉默，可以提高相关药物对肿瘤的治疗效果[21，22]。
本课题主要以TXR1与CD44基因为考察对象，通过脂质体转染，将siRNA TXR1-22及CD44-3980转染至NPC紫杉醇耐药细胞系中，并对转染后细胞中TXR1与CD44基因表达量的变化进行了测定。结果显示siRNA对基因的表达有明显的抑制效果。TXR1-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）中TXR1基因的表达水平显著降低，同时这些耐药细胞的CD44基因的表达水平也显著降低。进一步使用CD44-siRNA干扰这些细胞系后，在CD44表达下降的同时，TXR1表达也显著降低。这一结果表明，在鼻咽癌细胞中CD44与TXR1具有明显的功能上相互作用，它们很可能处于同一信号通路上，由于CD44为跨膜蛋白，我们可以假定CD44-TXR1/Tsp1信号通路可能与鼻咽癌紫杉醇耐药密切相关。
为了进一步考察siRNA干扰与NPC细胞耐药性的关系，以及NPC紫杉醇耐药细胞的耐药性能否被逆转，我们通过细胞集落形成实验检测了siRNA转染前、后NPC紫杉醇耐药细胞系对紫杉醇的响应性的变化。结果显示siRNA转染后的细胞耐药性较为转染细胞的耐药性有明显地降低。TXR1-siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）的IC50值分别为：5.41±0.40、6.41±0.09和5.70±0.27 ng/mL；相应的空白组与脂质体组的分别为：（11.2±0.5、12.2±0.2和10.2±0.30 ng/mL）与（10.9±0.3、11.2±0.4和11.8±0.8 ng/mL）。CD44基因 siRNA干扰后NPC紫杉醇耐药细胞（HNE-2/Taxol、CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol）的IC50值分别为：6.57±0.38、6.81±0.19和7.34±0.33 ng/mL；相应的空白组与脂质体组的分别为：（11.2±0.5、12.2±0.2和10.2±0.30 ng/mL）与（10.9±0.3、11.2±0.4和11.8±0.8 ng/mL）。上述数据证明TXR1与CD44基因的过量表达与细胞的耐药性有密切的关联。通过RNA干扰沉默抑制TXR1或CD44基因的表达均能有效逆转NPC紫杉醇耐药细胞的耐药性，这为后面TXR1以及CD44基因对NPC细胞紫杉醇耐药机理的深入研究奠定了一定的基础。
4 结论
本研究通过TXR1-siRNA转染能有效抑制NPC紫杉醇耐药细胞中TXR1与CD44基因的表达，且CD44-siRNA转染也能有效抑制NPC紫杉醇耐药细胞中TXR1与CD44基因的表达。表明CD44与Txr1的表达具有潜在的交互作用，这种交互作用可能对鼻咽癌细胞紫杉醇耐药具有调节作用。通过TXR1-siRNA及CD44-siRNA干扰鼻咽癌耐药细胞，其紫杉醇耐药性可得到部分逆转，故TXR1与CD44基因可能成为鼻咽癌耐药逆转的潜在靶点。
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作者简介：
彭颖，女，1989年5月出生，中南大学湘雅三医院耳鼻喉科学硕士研究生毕业，长沙市第八医院眼耳鼻喉科医师、高校教师；研究方向：耳鼻喉科疾病诊断治疗、公共卫生服务、医学教育等，参与科研项目、教学改革研究并获奖7项，发表论文10余篇。
基金项目：国家自然科学基金（No.30772403）
作者单位：
1.长沙市第八医院耳鼻喉科，湖南长沙 410100
2.长沙卫生职业学院，湖南长沙 410100）
3.中南大学湘雅三医院耳鼻喉科，湖南长沙 410013）
论文作者:彭颖1,彭宏伟2,谭国林3（通讯作者）
论文发表刊物:《中国蒙医药》2016年4月第4期
论文发表时间:2016/9/23
标签：紫杉醇论文; 细胞论文; 基因论文; 耐药性论文; 转染论文; 干扰论文; 鼻咽癌论文; 《中国蒙医药》2016年4月第4期论文;