（郑州市中医院 河南 郑州 450007）
【摘 要】目的：探讨苦参碱对慢性萎缩性胃炎大鼠（CAG）PCNA及Bcl-2、Bax的影响及机制。方法：将健康Wistar大鼠随机分为4组，即正常组、CAG组、苦参碱组、叶酸组，每组12只。正常组自由饮食，同时以模型组等量自来水灌胃。用40%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃联合自由饮用去氧胆酸钠法建立大鼠CAG模型。造模成功后开始给予药物干预，叶酸组给予叶酸40mg /（kg . d)灌胃，苦参碱组给予苦参碱180 mg / (kg.d)灌胃，正常组和模型组给予等量自来水灌胃，1次/d，共50 d。取材后ELISA法检测胃组织中PCNA的表达,免疫组化法检测胃粘膜中Bcl-2和Bax的表达变化。结果：与正常组比较，CAG组PCNA、Bcl-2表达显著升高（P<0.05)，胃粘膜Bax表达显著降低(P < 0. 01)；与CAG组比较，苦参碱组PCNA、Bcl-2表达下降，Bax表达升高(P<0.01或P<0.05)，叶酸组的无统计学差异(P > 0. 05)。结论：苦参碱可通过下调PCNA、Bcl-2表达或上调Bax表达缓解胃粘膜炎性细胞浸润程度，对CAG大鼠模型有较好的治疗作用。
【关键词】苦参碱；慢性萎缩性胃炎；PCNA；Bax；Bcl-2
【中图分类号】R289 【文献标识码】A 【文章编号】1003-5028（2015）5-0030-02
慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis，CAG) 是一种退行性胃粘膜病变，以胃固有腺体的萎缩，肠上皮化生及炎性反应以及伴有胃粘膜上皮不典型增生为典型表现，同时可伴随免疫功能及分泌激素失调等。其发病率、癌变率较高，目前已成为极受医学界重视的疑难杂症。苦参碱是从苦豆子中提取的一种生物碱，研究表明，苦参碱具有免疫调节功能，能够降低增殖细胞核抗原(PCNA) [1]、 Bcl-2[2]的表达，增高Bax的表达。另研究显示，在慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃组织中，PCNA，Bcl-2表达增高，Bax表达降低。本研究从分子表达和病理变化的角度探讨了苦参碱对CAG模型大鼠PCNA、Bax和Bcl-2表达的影响，旨在为临床治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 动 物
健康清洁级 Wistar 大鼠48只，雌雄各半，体重180-220g，河南中医学院动物实验中心提供。
1.2 实验药物
苦参碱（郑州市中医院药剂科，纯度98%），用蒸馏水稀释至180mg/kg。
1.3 试剂及仪器
试剂：乙醇（天津市百世化工有限公司）；水杨酸钠（天津市化学一厂）；叶酸（天津飞鹰制药有限公司）；Bax、Bcl-2（北京博奥森生物技术公司）；PCNA ELISA试剂盒（北京博奥森生物技术公司）；SP试剂盒（美国ZYMED公司）；DAB染色液（美国ZYMED公司）。
1.4 方 法
1.4.1 将48只健康Wistar大鼠随机分为4组，即正常组、CAG组、苦参碱组、叶酸组，每组12只。正常组自由饮食，同时以模型组等量自来水灌胃。除正常组外各组大鼠采用40%乙醇与2%水杨酸钠交替灌胃灌胃2个月，1次/d，灌胃前后1 h禁食禁水，并自由饮用去氧胆酸钠，2 d足量喂食，1 d停食；正常组给予1 mL/100 g体重生理盐水日1次灌胃，自由饮水进食，直至实验结束。造模过程中CAG组死亡2只，苦参碱组、叶酸组各死亡1只，正常组没有死亡。随机抽取2只大鼠做胃黏膜病理组织学检查，确认造模成功后进行药物干预实验，叶酸组给予叶酸40mg / （kg.d)灌胃，苦参碱组给予苦参碱180 mg /（kg.d)灌胃，正常组和模型组给予等量自来水灌胃，1次/d，共45 d。治疗期间模型组、叶酸组、正常组各CAG组予1 mL /100 g体重生理盐水1次/d灌胃。各组灌胃均50天后，处死所有大鼠。
1.4.2 ELISA法测定标本中PCNA含量：采用摘取眼球法取血，约5 mL/只，离心10 min，分离血浆、血清，-80℃保存，采用酶联免疫吸附法检测PCNA含量，具体操作方法详见试剂盒说明书。
1.4.3 免疫组织化学方法检测大鼠组织细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达：操作包括两部分：①剖胃取材后,用10％福尔马林固定，HE 染色做病理检查；按照常规脱水，石蜡包埋，4 um厚度连续切片；取切片拷至已用多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上，进行常规免疫组织化学染色（按SABC试剂盒说明书的步骤操作，每次实验以PBS代替一抗作阴性对照）。②在光镜下进行观察，每张切片至少观察5个视野，以细胞质或细胞核中出现均匀一致的棕褐色颗粒为阳性细胞。阴性表达：未见棕黄色染色的细胞；运用计算机图像分析仪定量分析大鼠胃粘膜Bax、Bcl-2蛋白表达的灰度值，在400倍光镜下，测定阳性细胞灰度。灰度值是反映透光密度的定量指标，其值越高，相应的蛋白表达量越少；反之则表示蛋白表达越多。计算出平均灰度值，即阳性部位灰度值与检测面积之比。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0软件包进行数据分析。数据均采用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。
2 结果
2.1 各组病理学检查结果比较
各组病理学检查结果比较肉眼观察到各组胃粘膜均有充血，组间比较无明显差异。显微镜下可见正常组胃粘膜上皮完整，腺体排列规则，细胞大小形态均一，腺体丰富与胃小凹分界清晰，粘膜固有层、胃体及胃窦部未见炎性细胞或偶见少量淋巴细胞。模型组胃粘膜变薄，腺体萎缩甚至消失，粘膜腺体减少，排列紊乱，粘膜肌层增厚。粘膜固有层内可见较多炎性细胞浸润，严重者浸润可深达至粘膜肌层，部分可见大量淋巴细胞聚集，部分模型可见肠上皮化生、不典型增生等。苦参碱组胃粘膜受浸润的炎细胞主要为嗜酸性粒细胞，且受浸润的炎细胞数量显著低于模型组和叶酸组。光镜下大鼠胃粘膜切片见图1。
2.2 胃粘膜Bax和Bcl-2蛋白表达及血清PCNA的变化 结果见表2。
注: a与正常组比较，P﹤0.05；b与CAG组比较，P﹤0.05；c与CAG组比较，P﹤0.01
Bax、PCNA在CAG组、叶酸组、苦参碱组及正常组各组中的表达灰度值呈逐渐递减趋势，苦参碱组较CAG组胃粘膜Bax表达灰度值明显降低，PCNA的含量明显减低（P<0.01，P<0.01）；与正常组比较，叶酸组胃粘膜Bax表达灰度值及PCNA的含量降低（P>0.05，P>0.05）。见表2。
Bcl-2在CAG组、叶酸组、苦参碱组及正常组各组中的表达灰度值呈逐渐递增趋势，苦参碱组较CAG组胃粘膜Bcl-2表达灰度值明显升高（P<0.01）；与正常组比较，叶酸组胃粘膜Bcl-2表达灰度值降低（P<0.05）。见表2。
3 讨论
CAG是最常见的癌前病变之一，其病理过程漫长，病因及发病机制仍未完全明了，主要与幽门螺杆菌(Hp)感染、十二指肠胆汁反流、胃粘膜损伤因子(如乙醇、高盐)、自身免疫机制、细菌或病毒感染、环境、相关基因蛋白表达异常及宿主遗传性等有关。由于长期慢性炎症，导致腺体破坏而减少，胃黏膜上皮和腺体萎缩、黏膜变薄、黏膜肌层增厚，在内窥镜下表现为胃豁膜血管显露。本研究模拟人的发病因素，采用综合造模法成功复制了CAG的动物模型。
Bax是Bcl-2R的同源基因，其由P53直接激活，可提高凋亡敏感性，促进P53介导的细胞凋亡，所以又叫“促凋亡基因”。 Bcl-2 作为一种凋亡抑制基因，主要是通过抑制线粒体依赖性凋亡通路被激活的功能达到抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的作用[3]。当细胞受到凋亡诱导因子刺激后，Bcl-2／Bax的比率决定细胞的凋亡程度[4]。研究显示[5]，由浅表性胃炎向CAG、肠化生、非典型增生、胃癌演变过程中，Bcl-2表达阳性率逐渐增加，而Bax则相反，提示Bcl-2表达增强或Bax表达减弱可能抑制了正常的细胞凋亡，细胞积聚速度明显增加，异常增生细胞因凋亡机制得不到正常启动不能被机体清除，并在体内大量聚集，最终导致肿瘤形成[6]。本实验结果示：与正常组比较,CAG组Bcl-2灰度值明显降低，而Bax灰度值明显升高。与以往文献[7]报道一致。经苦参碱和叶酸治疗后, Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白水平增高，苦参碱疗效优于叶酸。推测苦参碱可能通过下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，积极促进正常的细胞凋亡，从而阻止CAG向胃癌进展。
PCNA又称为周期蛋白，是一种核内蛋白质。为DNA聚合酶的辅助蛋白，是细胞DNA合成及细胞分裂不可缺少的因子。在正常不分裂的细胞组织中没有或很少，处于增殖状态的细胞，PCNA含量明显增高[8]。研究显示，由浅表性胃炎向CAG、肠化生、非典型增生、胃癌演变过程中，PCNA蛋白表达阳性率逐渐增加[9]。本实验结果示：经苦参碱治疗后，PCNA的表达明显下降。推测苦参碱可能通过降低PCNA的表达控制CAG引起的反射性细胞增殖程度，从而防止基因调节失控致其向胃癌进展。
综合分析，苦参碱的作用机制可能是通过降低PCNA的表达,上调Bax表达，下调Bcl-2表达，促进正常的细胞凋亡，起到治疗CAG的效果。
参考文献：
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附图1：HE（400×）
论文作者:乔虹,娄华*
论文发表刊物:《河南中医》2015年5月供稿
论文发表时间:2015/10/10
标签：叶酸论文; 苦参碱论文; 细胞论文; 灰度论文; 大鼠论文; 胃粘膜论文; 蛋白论文; 《河南中医》2015年5月供稿论文;