1.湖南省人民医院 湖南长沙 410005；2.中南大学湘雅附二医院儿科医学中心
【摘 要】经临床证实，当前有90%以上的呼吸道疾病是由细菌以外的病原体引起的，以呼吸道疾病最为常见。常见的呼吸道病毒有人类偏肺病毒、流感病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒等。呼吸道疾病是临床中最为常见的疾病，通常具有传播速度快、发病急、潜伏期短的特性，并且当前出现了越来越多的致命性呼吸道病毒，如非典型性肺炎、禽流感等。一旦发生这类病毒，通常会引起大范围的危害，对于呼吸道病毒的检测成为医院工作中的重要事项。由于呼吸道病毒引起的临床感染症状具有相似性，所以仅靠常规检测方法很难快速的确定病原，需要一种高度灵敏的快速检测方法。本文针对于此，研究常见呼吸道病毒的高度灵敏快速检验的方法，探究快速确定病原的途径。全文介绍了常见呼吸道病毒、以及检验病毒的方法。
【关键词】常见呼吸道病毒；高度灵敏快速检验方法；临场研究
常见的呼吸道病毒有人类偏肺病毒、流感病毒、腺病毒等，这些病毒具有传播速度快、发病急等特性。这些病毒可以通过呼吸道引发感染，爆发疫情。高度灵敏的快速检验方法可以有效的为患者提供诊断依据，使医师可以及时的对症下药，并且对卫生监督和疫情的防控具有重要的意义。通常呼吸道疾病通过空气传播，很难有效的预防，单体就能辐射很大的区域。所以研究出有效的检验方法至关重要。
1 常见呼吸道病毒
呼吸道病毒专指以呼吸道为入侵门户，在呼吸道粘膜上皮细胞组织增生，引起呼吸道局部感染病变或呼吸道以外组织气管病变的病毒。主要通过呼吸道传播，能反复感染，可在人群中暴发流行。当前主要的呼吸道病毒有流感病毒、副流感病毒、呼吸道合并胞体病毒、腺病毒四种。
流感病毒就是流行性感冒病毒，属于正粘病毒科，造成人体的上下呼吸道感染。通过空气传播，能引起大范围的疫情。具有鼻塞、流涕、咽痛等临床症状，并造成肺炎、支气管炎等下呼吸道疾病。根据抗原性，流感病毒分为甲型、乙型和丙型三种。甲型病毒易发生异变，造成大规模的流行，异型会引起肌炎和胃肠反应，较小规模，致死率较低，丙型会造成人类的轻微上呼吸道感染，很少造成流行。流感病毒的发病率较高，但致死率很低，但容易造成疫情的流行；副流感病毒属于副黏病毒科，能够引起下呼吸道感染，在儿童中较为常见，病死率略高。可以形成反复感染的肺炎、支气管炎、下呼吸道疾病等。副流感病毒主要分为四种类型，为Ⅰ型到Ⅳ型病毒。前两种主要会引起哮喘、喉炎、气管严和支气管炎。Ⅲ型的流感病毒会造成肺炎和细支气管感染，也能引起哮喘。Ⅳ型病毒会造成上呼吸道感染，检测率很低，一般会引起上呼吸道感染，不会引起肺炎。副流感病毒任何季节都可暴发流行，但以局部区域性为主，在儿科病房、小学、幼儿园等场所多见，爆发通常以Ⅲ型为主；呼吸道合胞体病毒属于副黏病毒科，也是常见的病原体，可通亲密接触、空气飞沫传播。这一病毒可造成任年龄段的人群感染，引起发热、咽炎、支气管炎、中耳炎等呼吸道病症。引起的流行性喘憋性肺炎是造成婴儿死亡的主要疾病之一。根据抗原性，可分为A、B两种类型；腺病毒属于腺病毒科，会造成呼吸道、肠粘膜上皮细胞的溶解性感染，淋巴样和腺样细胞的潜伏感染和啮齿动物细胞的转化感染。能够引起3岁以下儿童的急性咽炎热和较大儿童的咽结膜炎热、病毒性肺炎、急性呼吸道感染等疾病。还会造成非呼吸道组织的病变，如阑尾炎、急性胃肠炎等。当前检测到的腺病毒有52种，分A、B、C、D、E、F六个亚群。
除以上几种病毒外，还有偏肺病毒、人冠状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、流行腮腺炎病毒等。呼吸道病毒虽然种类繁多，但引起的症状大同小异，引发的社会危害也不一样。所以，对于呼吸道病毒有效的甄别能够帮助我们有效的对疫情进行防治。
2 常见呼吸道病毒的高灵敏快速检测方法
当前，具有多种的呼吸道病毒检验技术，如聚合酶链反应技术、DNA探针技术、基因芯片技术以及其他分子生物学检验技术，但是均不能满足目前的需求，所以需要我们探索新型的常见呼吸道病毒检验技术。
2.1试验材料
准备的试验材料有病毒毒株，包括阳性毒株和阴性毒株；细胞培养液；主要的仪器有生物芯片便携式可视化扫描仪、超纯水仪、数显电热水浴箱、琼脂糖电泳仪、芯片杂交盒、精密微量移液器、自动化核酸提取系统等；试剂方面，有病毒基因组提取试剂盒、扩增试剂盒等，化学试剂包括氯化钠、磷酸氢化钠、甲酰胺等。针对常见病毒，提取六种特异性基因作为检测标靶。利用信息技术将Gene Bank数据库获取的呼吸道病毒毒株的核苷酸序列进行同源性分析，得到碱基对齐图和聚类分析结果。使用Primer5.0软件结合碱基对齐图查找相关特异性引物。根据引物设计原则、PCR扩增物片段对杂交动力学造成的影响，确定扩增物的长度在100~500bp之间。根据八种呼吸道病毒靶基因对比的结果，呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒在不同书的病毒之间具有较高的特异性，同属病毒之间的核酸序列进化相似。所以，探针的设计应可将待测毒株和其它近原属分开，探针的序列能代表本属内不同的毒株。探针的特性是帮助基因芯片确定假阳性和假阴性的关键，在设计好探针后利用在线Blast对探针进行特异性分析，确定探针和其它病毒和细菌无相似性后，截取最优长度作为备选探针。
然后合成引物和探针，运用标准亚林酰胺化学方法在自动合成仪上进行氨解、过滤、干燥等程序。可用可视化显色所用的下游引物5’端进行生物素标记。探针与氨基基团之间可用聚乙二醇磷酰化试连接。最后进行引物的纯化。用200μl纯水，溶解粗样，加入200mg的尿素，待充分溶解后，放入16%的聚丙烯酰胺变性凝胶中，用600V的电压电泳2h。然后将凝胶取出，放在有荧光背景下的硅胶板上，在紫外灯下取出有紫外吸收的条带。放到试管中捣碎，并用1M的NaCL溶液，用50°C的纯水水浴3h。水浴后用22ml纯水、1.5ml的20%乙腈溶液过滤，用1.5ml的离心管收集，并用冷冻干燥机抽干。将制造的引物用毛细管电泳检测，以紫外定量，冷冻保存。引物制做好后，制造基因芯片，用寡核苷酸探针以去离子水溶液稀释至100μM。取点样液和制好的寡核苷酸探针各10μL，混合，待用。进行病毒核酸的提取，以痰液标本13000rpm离心10min，灭菌处理。用4%的NaOH液化30min，漩涡震荡10min，4°C液化，再行13000rpm离心10min，弃上清，放至200μl的生理盐水保存。为了提高病毒核酸的提取质量，可用离心柱提取法、磁珠提取法、自动化提取法对比提取。为了保证试验的质量，可设人核糖核酸酶P基因编码中的Rnase gene作为靶基因，用4条引物和2条内标做对照探针。为了建立高灵敏度的快速检验方法，可以建立多重的RT-PCR扩增，将八种常见的呼吸道病毒中的6对特异性引物和2对内标引物分至2管，形成多重RT-PCR的组合。然后行芯片的杂交和检测。将芯片放置杂交盒中，在特定环境下杂交1h。量子电标记银染增强可视化显色，得到对比结果如下：
图1 常见呼吸道病毒部分基因序列片段对比
3 小结
通过本次实验得到常见呼吸道病毒的基因序列对比，通过特异性检验可有效的将检测结果准确率提高到96.32%。以往工作的难点在于快速的辨别各种常见的呼吸道病毒，针对性的采取治理措施，本文介绍的方法实现了快速的辨别，但在准确率和操作上存在一些不足。希望本文的探索能为卫生监督和防疫工作起到促进作用。
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论文作者:彭丹霞1,张星星2（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2015年14期
论文发表时间:2015/12/4
标签：病毒论文; 呼吸道论文; 探针论文; 引物论文; 常见论文; 流感论文; 快速论文; 《航空军医》2015年14期论文;