郭小参[1]2008年在《淮南猪IL-2基因的克隆及在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达》文中提出白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类细胞因子,在机体免疫应答中起重要作用。其最重要的功能是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期到S期)和分化,并且具有刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞分泌细胞因子等功能。本研究以猪IL-2为研究对象,首次克隆出了淮南猪IL-2全基因,然后分别亚克隆到原核与真核表达载体中,并对其生物学活性进行了初步研究。主要内容包括:1.参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列,设计1对引物,将淮南猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A (ConA)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,然后克隆到pGEM-T Easy载体上并测序。测序结果显示,克隆的淮南猪IL-2 cDNA全长为516个碱基,开放阅读框(ORF)包含465个碱基,编码154个氨基酸,分子量为17.4 KDa,等电点为5.47,疏水氨基酸34%,亲水氨基酸34%,碱性氨基酸11%,酸性氨基酸23%。此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%,与猫、牛、鸡、狗、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%,82.6%,28.2%,80.6 %,29.6%,83.4%,81.3%,82.0%,61.5%。2.为了在大肠杆菌中表达淮南猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码淮南猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-IL2,进而转化BL21感受态细胞中;经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE检测淮南猪IL-2基因的表达情况,运用Western-blot和MTT法对表达蛋白进行特异性检测和活性测定。结果表明,淮南猪IL-2基因在大肠杆菌中得到高效表达,其表达蛋白具有特异性和生物学活性。3.为了在杆状病毒表达载体中表达猪IL-2基因,并鉴定其生物学活性,设计1对引物,将编码猪IL-2的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,获得重组质粒pFBD-IL2,进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2。然后将重组质粒转染昆虫细胞,间接免疫荧光表明猪IL-2在Sf-9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到分子质量为20 KDa的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,表达产物经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,猪IL-2基因在昆虫细胞中得到正确表达,其表达蛋白具有生物学活性。综上所述,本研究成功克隆出了河南优良地方品种淮南猪IL-2全基因,并分别在大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒表达系统中进行了表达,对其表达产物进行了生物学活性测定,为进一步研究猪IL-2功能性蛋白作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作用及开发研制新型免疫增强剂定了基础。
周飞燕[2]2008年在《人源胸腺素α原和白介素2融合基因的真核表达及免疫保护效果初探》文中认为人源胸腺素α原(prothymosinα,proTα)是具有促进细胞增殖和显著的免疫刺激活性的酸性蛋白,主要用于治疗肿瘤、肝炎、免疫系统等疾病。白介素2(interleukin 2,IL-2)是一种糖蛋白,它能增强NK细胞的活性,对肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、直肠癌有明显疗效,但过量使用IL-2会带来不良反应。ProTα和IL-2存在紧密的免疫刺激协同作用,proTα通过调节IL-2诱导的NK敏感细胞和LAK细胞毒性,使IL-2的有效浓度降低一半。它们协同于自体瘤的效果明显强于单独使用IL-2的效果。ProTα和IL-2联合使用不但能提高抗肿瘤的效果,还可降低单独使用IL-2产生的毒副作用。本研究利用PCR技术从前期构建好的pcDNA3.1-PTI重组质粒中克隆出proTα-linker-IL-2融合基因,并对其进行改造,在5′端加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的信号肽序列。将改造好的proTα-linker-IL-2融合基因(PI)克隆至真核载体pVAX中构建成重组质粒pVAX-PI,再将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,通过菌落PCR和酶切筛选阳性单菌落,提取质粒进行测序鉴定。测序结果显示,改造后的融合基因序列与预期序列一致。提取无内毒素的重组质粒pVAX-PI并定量分析。采用脂质体转染试剂将重组质粒转染哺乳动物细胞COS-7中进行表达,分别收集质粒转染细胞后24h、48h、72h、96h的细胞上清,用ELISA法定量分析细胞上清中IL-2蛋白表达量,结果显示,24h、48h、72h、96h转染上清中的IL-2蛋白含量分别为5.4、7.8、6.1、5.7ug/L。采用CTLL-2依赖细胞株测得转染后24h、48h、72h、96h细胞上清中的IL-2活性分别为43、58、54、49IU/ml。将小鼠原代脾细胞与细胞转染上清一起培养48h后,MTT实验结果表明,转染上清能刺激小鼠脾细胞增殖,表达的融合蛋白具有proTα的活性。最后,通过ECL western blotting分析和鉴定了表达的融合蛋白的分子量约为31kDa。本次研究初步发现pVAX-PI对小鼠黑色素瘤有一定的抑制作用,并且对荷瘤鼠体内细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定的诱生作用。pVAX-PI质粒免疫组的小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量随时间的推移而逐渐上升。荷瘤小鼠接种pVAX-PI质粒后第5周,ELISA定量分析小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量,肌肉注射联合在体电脉冲刺激组分别为222pg/ml和157pg/ml,单纯肌肉注射组分别为129pg/ml和68pg/ml。以上结果说明,pVAX-PI质粒在荷瘤鼠的免疫体系中具有一定调节作用。
萨仁高娃[3]2003年在《鸡IL-2基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备》文中研究说明白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)主要是在促有丝分裂素或特异性抗原刺激下，由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一种淋巴因子，是机体主要的T细胞生长因子之一。由于IL-2具有的重要免疫调节功能，IL-2一直是细胞因子研究中的热点之一。但与人和哺乳动物比较，鸡IL-2的研究相对来说比较滞后，利用体外表达技术研制重组鸡IL-2蛋白以及抗鸡IL-2的多克隆和单克隆抗体并以此作为工具进行鸡IL-2蛋白的生物学特性、免疫调节作用及其在比较免疫学中作用的研究具有重要的意义。 我们根据Sundick等发表的鸡IL-2基因的cDNA序列，在其编码区两侧设计一对引物，利用RT-PCR技术从活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出长约600bp的鸡IL-2基因cDNA，并把它克隆到PUC18载体上。经酶切鉴定及DNA序列测定，该基因为鸡IL-2基因，其序列与Sundick等报道的完全一致。在此基础上，我们把鸡IL-2基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pPROEX~(TM)HT中，构建重组表达质粒并进行确证性序列测定，重组质粒测序结果表明将编码鸡IL-2成熟蛋白的基因正确地插入到原核表达载体pPROEX~(TM)HT的目的位点。重组质粒转化受体菌DH5α后用IPTG于37℃进行诱导培养，SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为18kDa，表达的融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6M盐酸胍裂解后，用镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与标准的鸡IL-2蛋白具有良好的反应性。这为今后进一步进行鸡IL-2的生物活性研究及其应用奠定了基础。
李建荣[4]2001年在《传染性法氏囊病病毒基因免疫的研究》文中认为传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官—法氏囊，导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法，但随着IBDV变异株与超强毒株的出现，免疫失败常有发生。本文对IBDV基因免疫进行研究，期望为IBD的防治提供新的途径。 从浙江省杭州、嵊州，宁波等地暴发疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料(编号分别为ZJ2000、ZJ991、ZJ992)，分离病毒，经琼脂免疫扩散试验、动物回归试验、鸡胚回归试验和电镜观察等证实所分离的3株野毒是传染性法氏囊病病毒。 分别以传染性法氏囊病病毒ZJ2000株(野毒株)和JD1株(弱毒株)基因组dsRNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了两株病毒的基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，两株病毒的基因组A节段全长共3259个核苷酸，包括5’、3’端的非编码区(NCR)和两个部分重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2)。两株病毒的5’-NCR和3’-NCR与所有参比毒株一样高度保守，二级结构预测表明存在一个倒置“π”型的茎环发夹结构；ORF2编码145个氨基酸的VP5，与其他毒株的同源性达98.6％-100％，与K310、Cu-1、P2、CEF94等毒株完全相同；ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)，与Cu-1、P2、CEF94等毒株高度同源，并具有253H、279N、284T、330G等弱毒株或能直接细胞适应的强毒株的特征性氨基酸。JD1株在决定其抗原性的大小两个亲水区内高度保守，而ZJ2000株第二个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位L替代了M，这两个突变可能与ZJ2000株的抗原漂移和毒力变异有关。虽然JD1株和ZJ2000株序列高度同源，VP2内七肽区完全相同，但毒力表型完全不同，提示VP2七肽区并非是决定毒力的唯一因素。VP4蛋白酶活性位点附近540R的突变以及VP2-VP4剪切位点511R的突变，可能影响了多聚蛋白前体的剪切和加工使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000株和JD1株与Cu-1、P2、CEF94、Harbin等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。 将IBDV-ZJ2000株和JD1株的多聚蛋白(VP2／VP4／VP3)基因和主要宿主保护性抗原(VP2)基因分别克隆入两种不同的真核表达载体pCI和pcDNA3，构建成两个毒株的 浙江大学博士学位论文：传染性祛氏囊病病毒基因免疫的b）f3t 摘要 ZJ2000株的pCIN 经纯化后，Lipofectin介导下转染Vero细胞，分别提取细胞 总DNA和总pA，DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行 间接免疫荧光试验可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测多聚蛋白的表达动力学表明转 染后72h表达的蛋白活性最强。结果表明pCIVPZ／VP4／VP3不仅重组到Vero细胞中，而且 得到了转录表达，表达的蛋白具有兔疫反应性。 以免疫刺激复合物（ISCOM）为佐剂分别制备ZJ2000和们 株的PCI－VPZ／VP4／VP3、 pCDNA3－VPZ／VP4／VP3、pCI－VPZ、pCDNA3－VPZ等8种DNA疫苗，接种14日龄非免疫来 杭鸡，28日龄二兔，二免后14天，攻击标准强毒株BC6／85，进行免疫原性筛选。结果表明： 编码多聚蛋白的表达载体能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护；编码VPZ 基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体，几乎不能提供免疫保护；以pCI为表达载 体的免疫效果优于 pCDNA3：源于 ZJ2000株基因构建成的 DNA疫苗诱导的免疫反应优于 JD 株。肌肉、皮内、肌肉皮内联合、静脉、腹腔、口服和点眼等7种途径均能不同程度诱导免 疫效果，其中以肌肉皮内联合免疫法效果最好，肌肉、皮内免疫次之，而口服、点眼途径最 差。低剂量的＊＊A疫苗＊50阴）不能产生足够的免疫力，20o叱的剂量为＊＊A疫苗的最 佳免疫剂量。以上结果说明IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有良好的免疫原性，其最佳免疫方 案是：使用ZJ2000株的pCI－VPZ／VP4／VP3质粒，以ISCOM为佐剂制备DNA疫苗，最佳的 免疫剂量为 200pg／鸡，最佳的免疫途径为肌肉和皮下联合免疫法。 比较了DNA疫苗和两种常用的弱毒苗（B87、D78）的安全性和免疫效力。结果表明 DNA疫苗对雏鸡安全可靠，但弱毒苗对雏鸡有一定的毒力。虽然DNA疫苗产生中和抗体的 潜伏期相对较长、效价相对较低，但对强毒株BC6／85的攻击保护率与两种常用的弱毒苗 （B87、D78）相当，可能的原因是DNA疫苗同时诱导了鸡体的体液免疫和细胞免疫功能， 而且ISCOM增强了DNA疫苗免疫效果。DNA疫苗对BC6／85、ZJ2000、ZJ991等3株强毒 株具有良好的免疫保护效果，平均保护率达83．33％；弱毒苗B87虽对BC6／85株具有良好的 保护，但对ZJ991株、ZJ2000株的攻击不理想，平均保护率仅达60％。上述结果说明IBDV DNA疫苗不仅安全可靠，并且对不同强毒株具有良好的交叉保护效果。
许发芝[5]2004年在《鸡IL-2和NDV-F基因的克隆、表达及其融合基因重组质粒的构建》文中提出新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种具有高度传染性的病毒性传染病。NDV能感染鸡、火鸡、鸭、鸽子和野生鹦鹉等多种禽类。由于ND给养禽业造成巨大经济损失，被国际兽疫局定为A类传染病。研究证明，在NDV感染过程中，位于病毒囊膜上的融合蛋白（F蛋白）是病毒穿入细胞，使宿主细胞产生融合和溶血的重要因子；同时也是病毒的主要保护性抗原。正因为如此，F蛋白已经成为研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首选抗原。白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是由T细胞分泌的一种重要淋巴因子，它具有促进T细胞、B细胞的增殖和分化，增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性等免疫调节功能。IL-2的这种免疫调节功能，还表现在能够增强疫苗诱导的免疫反应。因此，近年来IL-2常被用来作为DNA疫苗的免疫佐剂，成为免疫学研究的热点。为了深入研究新城疫DNA疫苗，提高DNA疫苗的免疫应答效果，本研究运用分子克隆技术，分别获得了NDV的F基因和鸡的IL-2基因，并在真核细胞和原核细胞中进行了表达。首先，根据GenBank中登录的F48E9株F基因序列和鸡IL-2基因序列以及真核表达质粒pcDNA3的多克隆位点，自行设计了两对F基因序列引物，它们是PFA：5’-CCCAAGCTT-ATGGGCCCCAAATCTTCTACC-3’，PFBS：5’-CGGGATCC-TCAGA TTCTTGTAGTGGCCCTC-3’，PFBF：5’-CGGGATCC-GATTCTTGTAGTGGCCC TC- 3’；两对鸡IL-2基因序列引物：它们是PIAS：5’-CGGGATCC-CTGCCATG ATGTGCAAAGTAC-3’ ，PIAF：5’CGGGATCC-GGTGGCGGACTGCCATGATGTGCA AAG-3’，PIB：5’GCTCTAGA-CTTA TTTTTGCAGATATCTCAC-3’。为了便于基因的克隆和表达，我们在引物的5’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，从接种NDV F48E9株的鸡胚尿囊液中扩增获得了大小约为1660bp的基因片段；从ConA诱导培养8h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为440bp的基因片段，分别与GenBank中登录的NDV F基因和鸡IL-2基因大小一致。经单酶切鉴定，这两个片段中均存在与NDV F基因和鸡IL-2基因相同的酶切位点。将其分别连接到pcDNA3质粒上，经质粒PCR和双酶切鉴定后，筛选获得阳性重组克隆pcDNA3-IL-2和pcDNA3-F。核苷酸序列测定分析表明，NDV F基因开放阅读框由1662个核苷酸组成，编码553个氨基酸，与已报道NDV F基因的同源性为99%；鸡IL-2基因开放阅读框由432个核苷酸组成，编码143个氨基酸，与已报道鸡IL-2基因的同源性为98%。这表明本实验已成功地克隆了<WP=4>NDV F基因和鸡IL-2基因。再通过连接臂将F基因和IL-2基因进行连接，插入到pcDNA3质粒的HindIII和XbaI多克隆位点之间，经质粒PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定，结果表明，已成功地构建了融合基因的重组质粒，并将其命名为pcDNA3-F-IL-2重组质粒。其次，为了检测NDV F基因疫苗的体外表达效果，我们将pcDNA3-F重组表达质粒和pcDNA3空质粒经由脂质体介导的方法分别转染到COS-7细胞和p815细胞内，通过免疫荧光染色法、RT-PCR法和Western blotting法检测目的基因的表达。转染的p815细胞用G418经2~3周的克隆筛选，获得了具有G418抗性并能够稳定表达F基因的p815-F细胞株。免疫荧光染色的结果显示，F基因在转染的COS-7细胞和p815细胞株中，分别获得了一过性表达和稳定表达。RT-PCR实验结果表明，F基因被成功地整合到P815细胞株的染色体中并能正确地转录出其mRNA。Western blotting结果则表明，转染重组质粒的p815细胞裂解物在分子量约为60 000的位置出现一条特异性的染色条带，而转染空质粒的p815细胞裂解物则没有任何条带出现。最后，应用DNA重组技术，将鸡IL-2基因亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，并转化大肠杆菌 BL21菌株。经IPTG 37℃诱导表达4 h后，SDS-PAGE 电泳结果显示，谷胱苷肽-S-转移酶（GST）与鸡IL-2的融合蛋白得到了表达，分子量约为42000，主要以包涵体形式存在。表达产物在十二烷基肌氨酸钠存在下经超声波处理，并用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱洗脱，获得了纯化的GST-IL-2蛋白，为进一步研究鸡IL-2的生物学活性奠定了基础。综上所述，本研究成功地构建了含新城疫F48E9株F基因和鸡IL-2基因cDNA的真核和原核表达重组质粒，并进一步将其导入真核细胞和原核细胞进行了表达。本研究还成功地构建了pcDNA3-F-IL-2融合基因重组质粒，这些将为进一步研究鸡IL-2和新城疫DNA疫苗提供了实验基础。
王海艳[6]2004年在《重组鸡γ-干扰素，鸡白细胞介素-18，-2活性及生物学作用的研究》文中研究指明近年来，随着细胞因子基因的克隆及基因工程技术的不断发展，细胞因子作为治疗剂在畜禽养殖业中的广泛应用变得更加可行。在本研究中，我们对重组鸡干扰素-γ（ChIFN-γ）、鸡白细胞介素-18(ChIL-18)和鸡白细胞介素-2(ChIL-2)进行了检测。首先，我们检测了原核表达系统(E.coli)表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2的活性，具体方法是：将ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2基因分别亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ、pMelBacB- ChIL-18、pMelBacB-ChIL-2，经限制性内切酶消化、特异引物PCR鉴定和确证性序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ、pMelBacB- ChIL-18、pMelBacB- ChIL-2质粒分别与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经三轮蓝斑筛选，获得了重组杆状病毒。提取病毒DNA经ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2特异引物及重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，分别命名为rBaculovirus-ChIFN-γ、rBaculovirus-ChIL-18和 rBaculovirus- ChIL-2。用这些重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE。结果表明ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量分别为19KDa、23KDa和16KDa。应用在大肠杆菌原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ和 ChIL-2及豚鼠抗ChIL-18多克隆抗体进行Western blot分析，一方面，表明本研究真核系统表达了有活性的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2蛋白，另一方面，表明前期原核系统表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2蛋白是有活性的蛋白。为了研究ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2在体内的生物学作用,我们还用E.coli系统表达的重组ChIFN-γ、ChIL-18和ChIL-2免疫鸡，在增重试验中，与阴性对照相比，重组ChIFN-γ、ChIL-18能促进生长，增长率最高可达6.1%,并且在传染性支气管炎病毒感染后，重组ChIFN-γ、ChIL-18能减少鸡的体重下降率并迅速恢复体重；在传染性支气管炎病毒感染后，重组ChIFN-γ、ChIL-18能使鸡血清中抗体滴度提高，抗体滴度最高可达1094.9，能够快速清除气管中病毒,还能减轻传染性支气管炎病毒对组织的病理损伤。在本试验中，重组ChIL-2的生物学活性表现得不明显。
刘媛[7]2015年在《IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果的影响研究》文中研究表明羊口疮病毒(Orf virus,Orf V)属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行,是严重威胁养羊业、具有重要经济意义的病毒病。疫苗接种是防控病毒性疫病可靠且有效的手段,Orf常用疫苗有弱毒、灭活疫苗,但在生产实践中羊口疮弱毒苗存在散毒危险、毒力返强等缺陷,灭活苗存在灭活不彻底、产生抗体水平较低等缺陷。因此,运用基因工程技术开发Orf新型疫苗具有重要意义。Orf V诱导机体以细胞免疫为主,而IL-2是Th1型细胞因子,可作为细胞因子免疫佐剂,与核酸疫苗联用能增强其免疫效果。本研究构建了山羊IL-2基因、Orf V B2L基因和F1L基因三种真核表达质粒,将山羊IL-2基因真核表达质粒作为细胞因子佐剂与Orf V真核表达质粒联合免疫小鼠,探讨山羊IL-2细胞因子佐剂对Orf V核酸疫苗免疫效果的影响研究。主要研究内容如下:1.山羊IL-2基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:采集健康贵州黑山羊外周血,分离培养淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR扩增、序列测定获得山羊IL-2基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建山羊IL-2基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和ELISA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因完整编码阅读框长468 bp,编码155个氨基酸,与Gen Bank中羊源IL-2基因序列相比,核苷酸序列一致性为95.9%-100%,氨基酸序列一致性为91.1%-100%;将羊IL-2基因序列提交Gen Bank,获得登录号KT934548;生物信息学预测,该蛋白α-螺旋与β-折叠较多,有信号肽,无跨膜结构和特定功能结构域,整条肽链表现为亲水性;经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了真核表达质粒p VAX1-IL-2;p VAX1-IL-2转染MDBK细胞48 h后的上清,RT-PCR检测到IL-2基因的m RNA转录,ELISA方法检测到MDBK细胞上清IL-2蛋白浓度约为112 pg/m L。2.羊口疮病毒B2L、F1L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达:根据Gen Bank收录的Orf V基因序列(No.AY386264),分别设计针对Orf V B2L、F1L基因引物,通过PCR扩增、序列测定获得B2L、F1L基因序列,并对其进行生物信息学分析;以p VAX1为真核表达载体,构建B2L、F1L基因真核表达质粒,采用质粒PCR、双酶切和测序鉴定;将重组质粒转染MDBK细胞,采用RT-PCR和IFA方法对其转录、瞬时表达进行鉴定。结果表明,Orf V-GZ株B2L基因全长1137 bp,与Gen Bank中B2L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为97.3%-98.8%,氨基酸序列一致性为97.1%-99.7%;F1L基因全长1029 bp,,与Gen Bank中F1L基因序列相比,其核苷酸序列一致性为96.0%-99.6%,氨基酸序列一致性为95.5%-99.7%;分别将Orf V-GZ株B2L、F1L基因提交Gen Bank,获得登录号KP994595、KP057582;生物信息学分析,B2L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,无跨膜结构和信号肽,含2个磷脂酶D超家族保守结构域,同时还有相应的特异性结合位点;F1L基因编码蛋白α-螺旋和β-折叠较多,整条肽链表现为疏水性,含2个跨膜结构,无信号肽。经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建真核表达质粒p VAX1-B2L、p VAX1-F1L;RT-PCR方法检测转染细胞中有B2L、F1L基因m RNA转录,IFA方法检测到B2L、F1L基因在MDBK细胞中表达。3.IL-2基因佐剂对羊口疮病毒核酸疫苗免疫效果影响研究:以p VAX1-IL-2作为细胞因子佐剂,分别与p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L联合免疫小鼠,采用ELISA方法对小鼠血清中Orf V特异性抗体与Th1型(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)细胞因子进行测定;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;FACS法检测小鼠脾淋巴细胞亚群变化。结果表明,p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L三组质粒均具有良好免疫原性,各真核质粒免疫组1周后均能诱导小鼠产生Orf V特异性抗体,第6周时抗体水平最高,第7周时抗体水平开始下降,其中以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组抗体变化趋势明显;MTT法检测结果表明三组质粒诱导的淋巴细胞增殖反应均高于p VAX1和PBS组,差异极显著(P<0.01),加入p VAX1-IL-2佐剂组与未加入佐剂组相比,差异极显著(P<0.01),表明p VAX1-IL-2对三组质粒诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖具有促进作用,在1~4周能够持续增殖;FACS结果表明p VAX1-B2L、p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L、p VAX1-B2L+p VAX1-IL-2、p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组的CD3+CD4+T淋巴细胞含量较PBS组与p VAX1组高,以p VAX1-B2L+p VAX1-F1L+p VAX1-IL-2免疫组最高,且加p VAX1-IL-2细胞因子佐剂组高于未加佐剂组,CD4+T细胞含量高于CD8+T细胞含量,CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞比值介于1.71~2.94之间,表明各真核质粒免疫组均能诱导淋巴细胞亚类增殖,辅助性T细胞高于抑制性T细胞,重组质粒不会引起小鼠不良反应;细胞因子检测结果表明,Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)含量高于Th2型(IL-4、IL6、IL-10),且加入p VAX1-IL-2佐剂组高于未加佐剂组,表明细胞免疫以Th1型为主。结论:本试验成功克隆了贵州黑山羊IL-2基因,Orf V-GZ株B2L基因和F1L基因,生物信息学分析表明三个基因具有良好抗原性。本实验构建了三种真核表达质粒p VAX1-IL-2、p VAX1-B2L和p VAX1-F1L。p VAX1-IL-2对p VAX1-B2L、p VAX1-F1L和p VAX1-B2L+p VAX1-F1L在小鼠体内诱导的Orf V特异性体液免疫和细胞免疫具一定的促进作用,细胞免疫应答以Th1型为主。
严琳[8]2005年在《猪白细胞介素2（pIL-2）与猪白细胞介素6（pIL-6）的基因表达及作为疫苗佐剂的研究》文中研究表明由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展,同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此,对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。疫苗免疫是当前预防和控制传染性疾病的主要措施,但目前使用的常规疫苗并不理想,存在免疫效率低与安全性差的两大难题。因此,如何在安全剂量疫苗接种下提高动物机体的免疫力,成为当今世界疫苗开发研究的热点之一。 细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的,具有多种生物学活性的细胞调节蛋白。它在免疫应答的产生和调节中具有重要作用,可作为新一代免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。二十多年来,各国学者致力于细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研究,取得了许多振奋人心的结果:多种细胞因子重组蛋白包括IL、IFN、TNF、GM-CSF等,均能在不同程度上增加常规疫苗,包括灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等的免疫效应。近年来,将细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂,由于其简便性与有效性,亦受到了人们愈来愈多的关注与重视。 鉴于此,本研究以猪白细胞介素2(pIL-2)与猪白细胞介素6(pIL-6)为研究对象,开展了这两种细胞因子以及他们的融合蛋白(pIL6-IL2)以重组蛋白的形式对常规疫苗PRV灭活疫苗的佐剂效应研究,及以基因形式对PRRSV ORF5核酸疫苗的佐剂效应研究。主要研究内容包括: 1.pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2的原核表达及纯化 构建pIL-2、plL-6及pIL6-IL2原核表达载体,均在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达。其中rpIL-2包含信号肽序列,rpIL-6不含信号肽序列,rpIL6-IL2由一段亲水性、低电荷效应的Linker连接均不含信号肽的pIL-6与pIL-2分子组成。三种原核表达产物均以包涵体形式产生,因此通过提取包涵体—SKL变性—透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。另将提纯了的原核表达产物rpIL-2、rpIL-6免疫家兔制备多克隆抗体。 2.19IL-2、pIL-6及pIL6-IL2的酵母表达及纯化 构建pIL-2、pIL-6及pIL6-IL2酵母表达载体,在P.pastoris GS115菌株获得分泌型表达。对3种酵母表达产物分别进行了Western blot检测,验证为目的蛋白。通过N端糖基化分析,发现酵母表达产物rpIL-2带有约5kDa的N端糖链,rpIL-6无N端糖基化修饰,rpIL6-IL2则以有糖链、无糖链两种分子状态存在,之间相差约2kDa;采用硫酸铵沉淀—PBS盐析—PEG20000浓缩的纯化办法,除去培养基中的毒性成分。对3种重组酵母菌进行了分泌外源蛋白最佳诱导时间及菌株持续稳定表达情况分析,验证诱导培养第4、5天外源蛋白分泌量最高;只需保持一定的酵母生长浓度,重组酵母菌可持续培养,稳定表达外源蛋白。提纯的酵母表达产物冻干活
鱼兵[9]2002年在《HSV-tk、重组人IL-2、TNF-α基因共表达载体的构建及HSV-tk/GCV系统对喉癌细胞作用的体外研究》文中指出目的：构建含有HSV-tk、IL-2、TNF-α基因不同组合的共表达逆转录病毒载体；研究HSV-tk／GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤作用。 方法：(1)分别以PCR方法扩增各目的基因，扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy，挑取阳性克隆经鉴定后测序，将测序正确的各目的基因通过引入内部核糖体进入位点依次定向克隆正向插入至pLXSN表达载体的多克隆位点间，以构建含不同基因的共表达载体。(2)利用重组DNA技术，将HSV-tk基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中，重组质粒pL(tk)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人喉癌细胞Hep-2，G418筛选出抗性克隆，命名为Hep／tk，以PCR、RT-PCR对HSV-tk基因修饰的Hep-2细胞进行鉴定。通过观察基因修饰细胞生长状况、MTT法及流式细胞仪观察GCV对Hep/tk细胞的杀伤效应。 结果：(1)经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定，各插入基因序列、大小、位置、方向均正确无误，成功构建三基因不同组合共表达载体 第四军医大学硕士学位论文PL（TI）SN和灿（TT）SN。（2）构建了出基因表达载体“（tk）SN；获得高自度产毒细胞株 C26；酒度为 1石X106／nil，PCR及 RTPCR分析证明 HSV业基因已整合至 Hep／th细胞基因组中，并在 InRNA水平上表达；Hep／tk细胞与未转基固的 H印0、HepZ比较，三者的生长速度无明显差别；Hep／th细胞对 GCV高度敏感，即低浓度 GCVN－lin叭）处理 Hep／tk细胞 7天，可将其大部分杀死，高浓度GCV卜lin叭）不能显著增强其对Hep／th细胞的杀伤作用。 结论：三基困不同组合共表达载体的成功构建为喉癌的联合基因治疗提供部分实验驹。人喉癌细胞＊Cp2对＊S（W＊＊V系统高度敏感；可望为喉癌基困治疗提供有效途径。
王金勇[10]2006年在《鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究》文中研究指明基于鸡白细胞介素2(chIL-2)全基因序列设计引物探针，以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板，用长距离聚合酶链式反应(LD-PCR)扩增鸭白细胞介素2(duIL-2)全基因片段，得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因结构、启动子结构和预测的成熟蛋白进行系统分析，在此基础上对推测的duIL-2蛋白的三维结构分子模型进行了构建。结果表明：duIL-2基因具有典型的4外显子3内含子结构，与已知的鸡和哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性；鸭和鸡及其它哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性，都具有AP-1，NF-AT，CD28RE，OCT，TATA box转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点；推测的duIL-2基因的阅读框长420bp，编码一条由140个氨基酸组成的多肽；duIL-2基因推测的成熟蛋白进化分析表明，鸭和鹅的亲缘关系最近，和哺乳动物的亲缘关系比较远，显示出明显的种属差异；三维结构预测表明，duIL-2蛋白具有典型的四alpha螺旋捆绑结构。以RT-PCR方法克隆的鸭白介素2的cDNA为模板，PCR扩增鸭IL-2成熟蛋白的编码序列。将此序列插入pBAD／HisB和pET28a原核表达载体多克隆位点，构建pBAD／HisB-duIL-2和pET28a-duIL-2重组子，分别转化大肠杆菌LMG194和BL21(DE3)宿主菌，经阿拉糖和IPTG诱导，实现了鸭白介素2蛋白(rduIL-2)体外重组表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约分别为18.7KDa和14.6KDa。Western Blot分析表明，表达的重组蛋白能分别被anti-Xpress和anti-His单克隆抗体识别。以pET28a系统表达的rduIL-2蛋白为原材料，尝试了两种复性策略制备复性rduIL-2蛋白结构单体：一种是借助梯度稀释对变性纯化的rduIL-2单体进行复性；一种是借助FPLC对非变性纯化的rduIL-2单体进行简易氧化复性。前者的复性产物中含有rduIL-2多聚体和单体两种形式，且产率很低。后者可以获得高产量的复性单体。PF-2D分析表明复性单体等电点为3.4，反相二维色谱没有分离到潜在的异构体。非变性条件制备的rduIL-2复性单体4℃存放一周没有形成沉淀，而变性复性策略获得复性产物则形成可见絮状沉淀。以纯化的rduIL-2免疫BALB／c小鼠，将其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，成功获得5株能分泌抗鸭IL-2蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞系：1H4、283、4G12、5F6和5H6。除mAb 5H6为IgG2a亚类外，其余4株mAb类型均为lgG1亚类，5株mAb的轻链都为κ链。Western-blot分析表明，所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性，其中5H6对鸡IL-2具有交叉反应性。细胞免疫化学分析表明，单克隆抗体283、4G12、1A4以及多抗均能够识别真核细胞瞬时表达系统表达的鸭重组IL-2。体外阻断实验证明，mAb 2B3能够明显抑制duIL-2对鸭脾细胞的增殖效应。以rduIL-2复性单体为活性标准品，进行了鸭白介素2体内外生物学活性研究：用MTT法测定了rduIL-2的体外淋巴细胞增殖活性；以鸡为模型，静脉注射rduIL-2，观察其体内生物学效应；研究了rduIL-2蛋白对重组禽流感灭活疫苗免疫效力的影响。结果表明：rduIL-2复性单体能刺激T淋巴细胞增殖，且呈剂量依赖性；高剂量连续注射rduIL-2引起鸭发热、多脏器炎症等毒副作用；鸡静脉注射低rduIL-2(0.1-25μg)后，其CD4~+T细胞上调，且上调水平与注射剂量没有直接相关性，而CD8~+T细胞含量变化不明显。低剂量的鸭IL-2能够明显提高重组禽流感灭活疫苗HI效价，而剂量过高则会抑制重组禽流感灭活疫苗免疫效力。根据鸡白介素2受体alpha链(ChlL-2Rα)cDNA序列设计多对引物探针，结合RACE技术克隆了duIL-2受体alpha cDNA(命名为DuCD25或者duIL-2Rα)。克隆的cDNA序列长886bp，其cDNA编码一条由226个氨基酸组成的前体蛋白，该前体蛋白含有由20aa残基构成的信号肽序列；预测的duIL-2Rα成熟蛋白与鸡IL-2Rα同源性61％，与哺乳类同系物同源性在15-25％之间。对10个物种IL-2Rα氨基酸序列分析发现，禽类和哺乳类有23个aa对应位点完全保守。duIL-2Rα的8个半胱氨酸残基中，有7个对应位点与鸡和哺乳类完全保守；我们也发现，哺乳类IL-2Rα的P24-P25、N90-A91、P111-K112、1185-R186位点之间和胞内羧基末端，在进化过程中分别出现了1、3、1、26-29和9-16个氨基酸插入现象，然而在进化过程中，哺乳类IL-2Rα并没有发生任何aa残基缺失的现象。二级结构分析表明，duIL-2Rα成熟蛋白羧基末端含有25个氨基酸残基(182-206)构成的跨膜区。将duIL-2Rα胞外链PCR产物亚克隆入原核表达载体pET32a，构建重组表达载体pET32a-duIL2Rα，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导实现了duIL2Rα蛋白在大肠杆菌的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达蛋白的分子量约为40KDa，可以被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明，经pET32a系统表达的duIL-2Rα主要以包涵体的形式存在。表达的重组蛋白经Ni~(2+)层析柱变性纯化产率极低，采用制备包涵体的方法，每升培养液中可获得32mg rduIL2Rα蛋白粗制品。用纯化的rduIL-2Rα包涵体蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞筛选，有限稀释法克隆，最终获得15株持续、稳定分泌抗rduIL-2Rα原核表达产物的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为1A4，3B6，7C8，1C5，3D1，1E4，2E1，6E1，6E9，2F4，6F2，4G10，3H11，4H3，6H7(抗体类型均为IgG1，κ)。对15株单抗Western blot鉴定结果表明，与rduIL-2Rα均具有反应性。细胞免疫化学分析表明，仅有5株(1A4，3H11，4G10，3D1，6F2)能够特异识别经Vero细胞瞬时表达的duIL-2Rα蛋白。进一步利用Con A诱导的内源性duIL-2Rα作为抗原，筛选到两株能够识别duIL-2Rα天然表位的抗体(3H11，6F2)。利用H9N2亚型禽流感病毒感染模型，以rduIL-2 Rα单克隆抗体6F2为检测抗体，借助流式细胞术，研究了鸭DuCD25~+细胞在病毒感染免疫应答中的表达动态。结果表明，健康鸭脾细胞仅有少量DuCD25~+细胞(＜4％)，而感染鸭脾细胞中的DuCD25~+细胞比率以固定斜率直线式迅速上调，到48h达到峰值，随后逐渐下降，至感染后144h降至正常水平，说明DuCD25~+细胞在机体抗病毒感染的免疫应答过程中扮演着重要角色。
参考文献：
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[10]. 鸭白细胞介素2配体与受体alpha的研究[D]. 王金勇. 浙江大学. 2006
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