阿尔茨海默病是一种以神经细胞间出现大量以β淀粉蛋白为核心及神经元丢失为主要的病理特征，以进行性认知障碍为主要特征的精神系统的退行性病变[1]。随着人口老龄化问题逐渐加重，AD逐渐成为威胁老年人的头号杀手。虽然AD的病理特征已经明确，即以脑神经元外β淀粉蛋白的聚集体和胞内神经纤维缠结为主要特征，但Aβ聚集体继而引发的胞内异常级联代谢反应却是错综复杂的涉及多种信号通路，其中Rho/ROCK通路在AD的病理进程起着重要的作用，该通路的过渡活化引起的多种异常导致脑神经元的凋亡[2]。EGCG中含有茶多酚，有抗氧化、抗衰老等多种作用，对AD等很多退行性疾病有良好的效果，本实验采用D-半乳糖制作的模型大鼠对水迷宫的学习情况来探究EGCG对Rho/ ROCK通路的影响。
材料及方法
1.1动物及分组
选用成年健康雄性SD大鼠（哈尔滨医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号: SYXK2017-001）45只，体重（200±20）g。Morris水迷宫检测一次，淘汰先天愚型大鼠，其余大鼠随机分成四组，每组10只。即对照组、模型组、EGCG组和西药组。除对照组外，其余三组大鼠建立痴呆模型，皮下注射D -半乳糖( 350mg /kg) 每天 1 次连续注射 6 周[3]。
1.2实验试剂及仪器
EGCG，大连美仑生物科技有限公司，CAS 号：989-51-5。兔抗大鼠β淀粉蛋白抗体；兔抗大鼠ROCK抗体； Morris 水迷宫装置；透射式电子显微镜(FE1 Tecnai 12荷兰) ；超薄切片机(德国 Leica 公司) ；自动染色机( 德国 Leica 公司)；ChemiDoc XＲS + 凝胶成像分析仪( Bio-Ｒad，上海天能科技有限公司) 。
1.3治疗方法
EGCG组：EGCG用生理盐水溶解后20 mg /( kg·d)灌胃。西药组：盐酸多奈哌齐3.25 mg/( kg·d)）灌胃。模型组与对照组用相同体积的蒸馏水灌胃。每组治疗42天。
2检验方法
2.1Morris水迷宫检测
在整个装置中注入30cm的水，水温保持在25℃左右，在第二象限放置一个12cm12cm的深色平台，将其固定在没入水下1cm处。池壁四周悬挂遮光装置，是池内无光线照射进来。池壁四周各放一个入水口，分别将大鼠从各个入水口放入水池中，开始计时，当大鼠找到隐藏在水下的平台时，停止计时，即逃避潜伏期。如果大鼠在60s未能发现平台，则将大鼠引致平台适应10s，这个象限的逃避潜伏期记为60s。其他象限重复上述训练，最后将大鼠擦干放回鼠笼[4]。上述训练连续训练四天，记录每日的学习找到平台的时间。
2.2生化指标检测
经过水迷宫测验后，用针管抽取大鼠血液1.5ml至于离心管中，加入100 mmol/L的枸橼酸钠0.1ml做抗凝处理，2500 r/min离心15min，取上层血清用SOD、GSH-Px酶联免疫试剂盒检测。
2.3HE染色
取血后，立即用颈椎脱臼法处死大鼠，立即在冰上取出脑组织并分离海马区，在多聚甲醛中保存备用。全部取完后进行HE染色，观察海马区神经元形态变化。
2.4免疫组化检测β淀粉样蛋白和ROCK表达水平：
石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10 min，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min。5~10％正常山羊血清封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液， 4℃过夜。PBS 洗5 min×3 次。滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育1小时。PBS 冲洗，5 min×3 次。滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育10 分钟。PBS 冲洗5 min×3 次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。光学显微镜下观察、拍照。
2.5观察指标
Morris 水迷宫检测中，记录鼠在第二象限内的游泳的距离与在整个装置内游泳的距离即逃避潜伏期。HE染色观察海马神经元形态变化。表达水平的对比。血清中SOD、GSH-Px水平的测定。
2.6统计学方法
收集得到的数据进行分析时使用SPSS18.0软件，用t检测（x±s）表示计量统计，若P值< 0.05表明有统计学上的差异，数据可信。
4.结果
4.1三组大鼠平均逃避潜伏期的对比
Morris水迷宫测试中，模型组大鼠的平均逃避潜伏期显著高于EGCG组和西药组（P＜0.05）见表1。
4.3三组大鼠β淀粉样蛋白和ROCK表达水平的对比
对照组、EGCG组和西药组大鼠的β淀粉样蛋白显著低于模型组大鼠（P＜0.05）；对照组、EGCG组和西药组大鼠的ROCK蛋白的表达显著高于模型组大鼠（P＜0.05）见表2。
5.讨论
AD 是一种不可逆的慢性神经退行性疾病，表现为学习记忆障碍及记忆减退，尤其是近事遗忘突出，性格和行为改变，执行能力下降等痴呆特征[5]。随着年龄的上升，阿尔茨海默病的发病率逐渐上升，轻者表现为认知能力下降、行为障碍、生活能力下降。逐渐演变为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害及人格行为改变，严重者并发焦虑、抑郁、感染等。对于本实验来说，发病的程度主要表现在对于水迷宫的学习能力。对比模型组和实验组，大鼠的认知度下降，学习时间延长。经过治疗后，学习能力与模型组基本相同。说明EGCG对痴呆行大鼠的行为认知有一定的改善作用。
研究表明，学习记忆功能减退与海马的质量减轻、神经元数目减少及神经元突触的可塑性改变有关。AD 患者海马的病变往往早于大脑皮质的改变，且随着病程的延长，病变有加重趋势[6]。本实验结果显示，对照组海马中细胞轮廓清晰，细胞形态正常，核仁明显，细胞间排列紧密，细胞与间质有明显的界限。实验组中神经元细胞数目减少，细胞萎缩，排列无规律。EGCG组和实验组对比，细胞数量明显增加，细胞轮廓清晰，说明EGCE对受到损伤的海马神经元细胞具有保护作用。
根据本次实验结果来看，EGCG 对阿尔茨海默大鼠脑组织的保护作用，同时增加SOD、GSH-Px水平，EGCG可能是抑制Aβ的产生，激活了ROCK的产生，抑制氧化应激减少神经毒性作用，发挥神经保护作用。
参考文献：
[1]高彦斌，第五永长，唐学成，等.洗心汤对 APP /PS1 双转基因小鼠突触功能相关蛋白及受体表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志 2018，38(4): 694-699.
[2]姚维范， 刘明妍， 钟 欣，等.EGCG 改善 D-gal 诱导阿尔茨海默病模型大鼠认知障碍机制研究[J].临床军医杂志，2016，44(6):574-579.
[3]杨海玉，刘勇，胡建新，等. 绿茶提取物EGCG对乙醇诱导原代海马神经元损伤的保护作用及其机制[J]. 临床与病理杂志，2018，38(4): 694-699.
[4]隋璐 ，陈铎，金戈. EGCG 对阿尔茨海默病小鼠神经保护作用及机制[J]. 中国公共卫生，2014，30(10)：1282-1284.
[5]刘忠锦，张海燕，孙丽慧，等.EGCG对 APP /PS1 双转基因小鼠神经突触损伤的保护作用[J].重庆医科大学学报，2019，44（4）：430-433.
[6]王海龙, 上官丽娟, 侯苗苗, 等. 加味不忘散对 AD 模型大鼠学习记忆及在体海马长时程增强的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2018，(24): 3623-3625.
论文作者:牛崧霖,陈永庆 刘瑞雪,甄珍,通讯作者：张海燕
论文发表刊物:《世界复合医学》2019年9期
论文发表时间:2020/1/16
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