贵阳医学院第二附属医院感染科 孙鸿 邮编 556000
中图分类号: R512.62 文献标识码:A
【摘要】 目的：观察自体细胞因子诱导的杀伤（cytokine-induced killer, CIK）细胞治疗慢性乙型肝炎的疗效及安全性，探索慢性乙型肝炎治疗的新策略。方法：采集11例慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞，在体外经干扰素γ、白细胞介素-2、抗CD3 单克隆抗体等细胞因子诱导成CIK 细胞，分次自体回输，观察治疗前及治疗后第1、4、12 周肝功能、HBV血清标志物和HBV DNA 水平并进行比较分析，同时对不良反应和肾功能进行评估。结果：11 例CIK 细胞均诱导成功。在治疗过程中除回输时大部分患者出现一过性发热外，无其他明显不良反应，肾功能和血细胞无异常变化。治疗结束后随着观察时间的延长，ALT 和AST 水平等肝功能指标明显改善；治疗结束一周内HBV DNA 水平无明显变化，但随着观察时间的延长HBV DNA 水平有明显下降，第1、4、12 周以下降2 个log为观察指标，其同基线水平相比下降的比例分别为12.5%、31.2%、53.1%。讨论：本研究提示CIK 细胞治疗慢性乙型肝炎后在12 周观察期内是安全有效的。特别是治疗后随着观察时间的延长，HBV DNA 复制水平逐渐下降，提示CIK 细胞治疗后可能存在持续的免疫应答反应。
[关键词] 细胞因子诱导杀伤细胞；治疗；乙型肝炎；效果；观察
目前现有的抗病毒药物对慢性HBV感染的疗效不甚理想，在临床治疗中会出现耐药、病毒变异以及药物的毒副作用等因素影响了治疗效果，同时也增加了患者的经济负担。HBV感染的控制和病毒的清除有赖于机体的免疫系统，其感染慢性化与机体特异性免疫(尤其是细胞免疫)功能低下密切相关。树突状细胞(DCs)作为机体免疫反应的起动子，其摄取外源性抗原并通过MHC II类途径递呈给CD4+T细胞，也通过MHCI类途径递呈内化的外源性抗原，DCs能打破机体对多种抗原的免疫耐受，也在机体对某些抗原免疫耐受的建立过程中发挥重要的作用慢性乙型肝炎病毒感染中，DCs表达共刺激分子及MHC II类分子明显低于正常， 同时DCs刺激T淋巴细胞增生和细胞分泌的能力亦低于正常。因此，HBV感染的慢性化与DCs功能缺陷有关 ．由于DCs功能的缺陷进一步造成CTL功能不足， 因而形成HBV慢性持续性感染状态．通过增强或恢复机体HBV特异性免疫功能、以控制和清除HBV感染的免疫治疗是被人们寄予厚望的一种治疗策略，备受关注。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞1991年由美国斯坦福大学首次报道。CIK 细胞是以CD3+CD56+ T 淋巴细胞为主的异质细胞群，由于该类细胞具有非人类主要组织相容性复合体限制性、高增殖性、高细胞毒性以及细胞来源丰富等种种优点，目前国内部分大型医院已开始应用于治疗慢性乙型肝炎。我科于2012年9月开展此项技术，共收治乙肝表面抗原阳性患者11例，现报道如下。
1.一般资料
收集2013年9月1日—2O15年8月31日感染科门诊和住院的慢性乙型肝炎患者11例，其中男9例，女2例，年龄平均38.4岁。诊断符合2009年中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会所制定的标准．并排除HCV、HDV和HEV等病毒合并或重叠感染。以及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和其他肝脏疾病造成的肝损害。
2.方法
接受CIK细胞治疗的患者未采取保肝降酶治疗措施或联合其他抗病毒治疗。
2.1 CIK细胞的培养、制备和回输方法由贵阳医学院免疫实验中心用成分血分离机采集患者外周血单个核细胞。在符台良好操作规范(GMP)的实验室条件下．置于37℃，5%CO2条件下孵育2h， 收集非贴壁细胞，加入1 000U/ml 的IFN-γ 培养24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和500U/ml 的rhIL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；根据生长情况每2-3d 进行一次扩瓶传代培养；在第7d，收获CIK细胞， 其数量应达到1×109 个以上， 台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，用流式细胞仪检测细胞免疫表型，其中CD3+CD56+的细胞应达到20%以上。
2.2 观察项目治疗前后询问病史，进行系统的体格检查．并在治疗前及治疗结束后第1、4、12周分别检测血渣生化指标、HBV血清标志物及HBVDNA水平。
2.3 统计学处理用SPSS 1．2软件进行统计分析。采用X2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3.结果
3．1 CIK细胞培养过程中的质量控制每个患者CIK细胞培养过程中均进行过多枚真菌、细菌和支原体检测，结果均为阴性，确保了细胞培养和回输的安全。流式细胞仪检测CD3+CD56+细胞数占整个细胞培养数的比在20％以上．
3．2 CIK细胞回输后的不良反应在CIK细胞的回输过程中及回输后，10例中有2例存在不同程度的发热，一般在回输后l～2 h出现，持续时间为2 h。多数患者在不用解热镇痛药的情况下自行缓解，所有患者均未出现其他不良反应，包括血常规和肾功能的异常变化。
3．3肝功能的变化治疗后随着观察时间的延长，ALT和AST水平逐渐下降，且复常率逐步增高。取第1、4、12周3个观察点，ALT水平的复常率分别为18.2％(2／11)、45.5％(5／11)、72.7％(8／11)；AST水平的复常率分别为4／11 (36.3％)、7／11 (63.6％)和10／11(90.9％)。见表1。提示CIK细胞治疗后随着时间的延长肝功能有明显的改善。
l周HBV DNA水平无明显下降。但随着观察时间的延长，HBV DNA复制水平明显下降，提示CIK细胞治疗后可能存在持续的免疫应答反应。
4 讨论
HBV是引起肝硬化及肝癌的主要病因之一。目前虽然抗病毒药物研究不断进展，但疗效仍不令人满意。过去免疫治疗是抗病毒治疗的主要方法之一，既往曾用淋巴因子激活的杀伤细胞和肿瘤浸
润淋巴细胞治疗，由于很难同时获得既具有高活性又数量充足的效应细胞，应用受到限制。CIK细胞是经多种细胞因子诱导的一群异质性细胞，可分泌IL一2、IL一6、干扰素等多种细胞因子，通过多种途径激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能。CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常外周血中极为罕见，仅1％一5％。在体外经多种细胞因子培养，CD3+CD56+细胞迅速增多，可较培养前升高1000倍以上，CD3+CD8+细胞也可从培养前的20％上升到60％一80％。既往对CIK细胞治疗肿瘤研究较多，但对病毒性肝炎治疗的研究还刚刚起步。国内对CIK细胞治疗慢性乙型肝炎进行过较为系统的研究，包括安全性、疗效和作用机制等，不同地域存在不同的病毒基因型，所感染群体存在不同的遗传背景，所以同一治疗方法可能对不同地域和人群具有不同的疗效，因此有必要单独进行观察和研究。我们通过对10例的观察发现，治疗后肝功能有较明显的改善，并在治疗后随着观察时间的延长更为明显。无论是HBV DNA的平均水平下降幅度及达到不可检测水平的几率均明显提高，提示CIK细胞治疗后存在持续抗HBV的应答效应。因本科室开展此项技术时间短，观察病例数有限，并暂时仅能定位追踪观察时间点在12周，但本次病例观察已初步显示，在慢性乙型肝炎的治疗过程中HBV DNA的抑制表现出较明显的作用和乐观的前景。下一步随着病例数的增加和观察时间的延长，将对e抗原阴性的慢性乙型肝炎患者及服用核苷类药物对e抗原血清学转换的影响等方面进行系统观察，更加全面地评价CIK细胞治疗慢性乙型肝炎的疗效。
参考文献：
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3.黄丽惜;周启明;夏建川;;微创联合自体CIK细胞治疗原发性肝癌的安全性及有效性评价[J];广东医学;2007年09期
论文作者:孙鸿
论文发表刊物:《世界复合医学》（下）2015年第1卷总第8期
论文发表时间:2015/10/30
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