宋洁[1]2012年在《大豆胞囊线虫抑制性土壤及其抑制因子研究》文中指出大豆胞囊线虫病(Soybean cyst nematode,简称SCN),由于其传播途径多、危害程度大,严重影响着大豆的产量。其病原为大豆胞囊线虫(Heterodera glycines),是一类对寄主专一性较强的线虫。因此,在同一大豆田上连续种植大豆,会使土壤中的胞囊不断积累,导致危害加重。但是,近几年来研究发现当大豆连续种植5年以后,土壤中大豆胞囊线虫的种群数量有下降趋势,称为“大豆胞囊线虫的自然衰退现象”,具有此现象的土壤称为大豆胞囊线虫抑制性土壤。为了探讨抑制性土壤及抑制因子,以21年长期定位试验区为研究对象,分离了21年连作、3年连作和小麦-玉米-大豆轮作土壤中及大豆胞囊线虫各虫态的寄生真菌,并对分离频率较高的菌株进行真菌鉴定,同时利用Real-timePCR方法定量了土壤中的主要生防真菌。揭示抑制性土壤的衰退机制。为利用天敌生物防治大豆胞囊线虫病提供了一条新途径,并对大豆胞囊线虫生态学研究具有重要的学术价值和实际意义。该研究对于经过21年大豆连作后的研究结果显示,土和大豆根中胞囊、卵和二龄幼虫密度较3年连作明显降低(P≤0.05),每100g土中饱满胞囊数仅含有7个,且空胞囊比率可达到46%,土中的卵和二龄幼虫分别为192粒/100g土和26条/100g土,这种降低的程度和轮作相当(P≤0.05),说明21年连作已出现了大豆胞囊线虫自然衰退现象,证明该土壤为大豆胞囊线虫抑制性土壤。盆栽研究发现,21年连作土中接种大豆胞囊线虫二龄幼虫后,加入细菌抑制剂的大豆植株生长情显好于真菌被抑制的。调查盆栽土中和大豆根中大豆胞囊线虫种群密度发现,将土壤湿热灭菌后,土壤中线虫种量明显增加,推断该抑制性土壤的抑制因子很可能为生物因素。加入细菌抑制剂和CK大豆胞囊线虫数量明显低于湿热灭菌处理,而加入真菌抑制剂与湿热灭菌土比虽没有明显降低该线虫密度,但是也略低于湿热灭菌。说明该抑制性土壤中真菌很可能为主要生防因子,细菌次之。对大豆胞囊线虫各虫态上寄生真菌分离鉴定后,发现在21年连作区,除镰孢菌属(Fusarium spp.)外,轮枝菌属(Verticillium spp.)和拟青霉属(Paecilomyces spp.)分离频率也较高。对分离频率较高的菌株进行形态学鉴定,分别为尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、芬芳镰孢菌(F.redoles)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、厚垣轮枝菌(V.chlamydosporia)和淡紫拟青霉(P.lilacinus)。其中厚垣轮枝菌(V.chlamydosporia)的分离频率最高,该菌可能是该抑制性土壤中的主要抑制真菌。利用Real-time PCR的方法,定量分析了21年大豆连作、3年连作和轮作定位区田间土中的厚垣轮枝菌,发现在21年连作土中该菌总基因组DNA的含量为180pg/g明显高于其它两个处理(P≤0.05),进一步证明了厚垣轮枝菌(V.chlamydosporia)为重要的生防真菌。
屈佳玉[2]2008年在《大豆胞囊线虫生防菌的初步研究》文中指出从黑龙江省安达市大豆胞囊线虫病已发生自然衰退的大豆田中采集土样,采用淘洗过筛法,滤纸片保湿培养法,从大豆胞囊线虫胞囊上共分离到生防菌株78株,其中真菌54株,细菌24株。选取孢子形态不一致的25株真菌进一步研究。对这25株生防真菌进行胞囊寄生性测定,结果表明这25株菌对胞囊都有寄生性,其中对胞囊侵染率100%的菌株有2株,侵染率大于90%的菌株有7株,侵染率大于80%的菌株有16株。生防真菌对二龄幼虫(J2)致病性的测定结果表明,对J2有致病性的菌株有18株,其余7株对J2无致病性。选取对胞囊和J2寄生性均较强、但不侵染大豆的两株菌HDQ17、HDQ18进一步研究。根据生防菌株的形态特征、菌落特征、结合ITS序列,将菌株HDQ17鉴定为茄腐镰刀菌(Fusarium solani),HDQ18鉴定为厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporia)。对生防菌HDQ17、HDQ18生物学特性进行了研究。对菌丝生长特性的研究结果表明:葡萄糖是适合二者菌丝生长的最佳碳源;适合HDQ17和HDQ18菌丝生长的最佳氮源分别为硝酸铵和硝酸钾;最适生长温度都为25℃;适宜pH分别为6和7;促进二者菌丝生长的最佳金属离子分别是Zn2+和Cu2+。对生防菌HDQ17、HDQ18进行了产孢特性的研究结果表明:HDQ17和HDQ18在以葡萄糖为碳源时产孢效果最好;最适宜产孢的氮源分别是硝酸铵和磷酸氢二铵;最适产孢温度都为25℃;最适产孢pH值都为6;Fe2+存在时最有利于产孢。对生防菌HDQ17、HDQ18的孢子萌发特性的研究结果表明:HDQ17的孢子在黄豆浸液中萌发效果最好,HDQ18的孢子在半胱氨酸萌发液中萌发效果最好;两株菌的最适萌发温度为25℃;最适萌发pH值为6。HDQ17和HDQ18的代谢物对大豆胞囊线虫的胞囊孵化及二龄幼虫活性的影响研究结果表明,两株菌的代谢物原液对大豆胞囊线虫的胞囊孵化及二龄幼虫活性的影响效果最好。HDQ17的代谢物原液对胞囊孵化的相对抑制率为92.0%,HDQ18的代谢物原液对胞囊孵化的相对抑制率为83.3%;HDQ17的代谢物原液对二龄幼虫活性的相对死亡率为96.8%,HDQ18的代谢物原液对胞囊孵化的相对抑制率为93.7%。随着稀释倍数的增加,对胞囊和二龄幼虫的抑制率均降低。当把两株菌的代谢物稀释到50×时,对胞囊孵化及二龄幼虫活性的影响与对照(无菌水)相比相差不大。盆栽试验的结果表明,用HDQ17和HDQ18的代谢物比用孢子悬液制成的生防制剂效果更好。用HDQ17的代谢物原液处理后的黄豆植株,防治效果为92.12%;用HDQ17的孢子悬液制成的生防制剂处理后的黄豆植株,防治效果为83.29%。用HDQ18的代谢物原液处理后的黄豆植株,防治效果为89.70%;用HDQ18的孢子悬液制成的生防制剂处理后的黄豆植株,防治效果为79.57%。
孙玉秋, 许艳丽, 李春杰, 潘凤娟, 张原[3]2011年在《作物轮作系统对大豆胞囊线虫二龄幼虫寄生真菌的影响》文中研究说明采用蔗糖梯度离心法和传统真菌鉴定技术,研究定位试验条件下长期连作、麦豆迎茬、米豆迎茬和麦米豆轮作不同轮作方式下大豆胞囊线虫二龄幼虫虫口密度和寄生真菌情况。结果表明:连作大豆田土壤中大豆胞囊线虫二龄幼虫寄生真菌只有明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis),其它轮作方式中,寄生真菌有2种即洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)和明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)。连作15和16 a豆田大豆胞囊线虫二龄幼虫虫口密度低于迎茬和轮作田,二龄幼虫被毛孢真菌寄生率则均高于其它大豆茬口。
马锐[4]2000年在《大豆胞囊线虫二龄幼虫寄生菌的研究》文中研究说明大豆胞囊线虫二龄幼虫直接侵染大豆根部，其种群密度与对植物造成的危害直接相关，因此寻找线虫幼虫寄生菌是大豆胞囊线虫生物防治的一条重要途径。 用“Z”形法和五点法自全国11个省、市、区的61个县市的大豆田采集大豆根际土样146份。用诱集分离法和直接分离法从土样中分离大豆胞囊线虫幼虫寄生菌，在32份土样中检测出被毛孢（其中明尼苏达被毛孢30份；洛斯里被毛孢2份），短梗霉、顶孢霉、茎点霉、拟青霉、节从孢、木霉、毛壳菌和丛梗孢各在7份、4份、3份、3份、2份、1份、1份和1份土样中检出，并在38份土样中发现了巴氏杆菌。明尼苏达被毛孢、洛斯里被毛孢和巴氏杆菌的土样检出率分别为20.5％、1.4％、26.0％。 被毛孢主要分布于黑龙江省，土样检出率19.2％，陕西、河南和辽宁也有少量分布。巴氏杆菌主要分布于黄淮海地区，安徽、河南、江苏和山东的土样检出率分别为10.2％、6.8％、3.4％和2.7％，黑龙江、吉林、辽宁和北京地区也有少量分布。被毛孢和巴氏杆菌对大豆胞囊线虫二龄幼虫的寄生率大多数低于50％，但在个别土样中可高达100％。对直接分离法和诱集分离法的比较结果表明，巴氏杆菌诱集分离法的土样检出率（21.9％）明显高于直接分离法（11.6％），两种分离方法对被毛孢的土样检出率（16.4％）几乎一致。 对汤姆森被毛孢1个菌株和洛斯里被毛孢6个菌株的ITS1-ITS4区5.8s rDNA碱基序列的测定结果支持形态学的分类结果。来自不同寄主线虫的洛斯里被毛孢亲缘关系较同一寄主的洛斯里被毛孢远。 对影响巴氏杆菌和被毛孢寄生率因子的相关分析结果表明，大豆胞囊线虫的种群密度与寄生率呈正相关但不显著。被毛孢在砂壤、偏碱、有机质含量低的土壤中寄生率高；巴氏杆菌的寄生率与土壤因子的相关性不显著。 寄主范围测定结果表明，被毛孢的两个菌株--明尼苏达被毛孢136除根结线虫和一种昆虫病原线虫外，对大豆胞囊线虫、松材线虫、腐生线虫、昆虫病原线虫等多种线虫都有寄生性；洛斯里被毛孢ATCC46487对所有的供试线虫都有寄生性，且寄生率高于明尼苏达被毛孢136。巴氏杆菌只能附着于大豆胞囊线虫，且附着的孢子数很多，平均为6个/条线虫。
宋洁[5]2016年在《连作土壤寄生真菌多样性及对大豆胞囊线虫抑制作用》文中研究说明大豆胞囊线虫(Heterodera glycines,Ichinohe)病是大豆生产中的重要限制因子之一,其病原大豆胞囊线虫是一种典型定居型内寄生土传线虫,大豆连作会使土壤中大豆胞囊线虫不断积累,导致病害加重,因此大豆胞囊线虫也是引起大豆连作障碍的主要因素之一。然而,当大豆感病品种连续种植5年以上,会出现大豆胞囊线虫自然衰退现象,并将存在这种现象的土壤称为大豆胞囊线虫抑制性土壤。抑制性土壤中寄生微生物-大豆胞囊线虫-大豆三者之间形成一种特殊的环境抑制生态系统。大豆胞囊线虫寄生真菌作为抑制性土壤中的抑制因子之一,在该抑制生态系统中作用至关重要。为了探讨抑制性土壤中大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌多样性及其作用,以大豆长期定位轮作体系为研究对象,采用大豆胞囊线虫寄生真菌传统分离方法,利用形态学和分子生物学鉴定,并结合Biolog微平板分析技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法,研究大豆长期连作(23年)、大豆2年连作(玉米-大豆-大豆,8个循环周期)和长期轮作(小麦-玉米-大豆,8个轮作周期)下大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群特征、优势寄生真菌种类多样性及对大豆胞囊线虫致病作用。通过解析大豆胞囊线虫抑制性土壤中大豆胞囊线虫寄生真菌种群结构特征和明确大豆胞囊线虫优势寄生真菌作用,进一步揭示了大豆胞囊线虫抑制性土壤衰退机制,对抑制性土壤抑制生态系统和线虫生态研究具有重要的价值和意义。通过对大豆长期定位轮作体系下大豆胞囊线虫种群密度和大豆生长情况调查,结果显示,大豆经过23年连作以后,大豆胞囊线虫种群密度下降,盛花期和鼓粒盛期表现尤为明显。在大豆盛花期和鼓粒盛期土壤中饱满胞囊密度每100g土中均仅含有7个,显著低于大豆2年连作(P<0.05),与轮作差异不显著。大豆23年连作下,土壤中大豆胞囊线虫空胞囊占总胞囊数量比率显著升高,在大豆盛花期和鼓粒盛期,空胞囊比率可达到70%,显著高于大豆2年连作。在大豆整个生育期进程中,大豆胞囊线虫种群密度变化特征存在差异。大豆2年连作和轮作下,在大豆生育期进程中大豆胞囊线虫种群密度呈现增加趋势,而大豆23年连作下,大豆胞囊线虫种群密度变化不明显,且在大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫种群密度有下降趋势。此外,大豆23年连作下,由于大豆胞囊线虫种群密度下降,大豆生长状况明显改善,大豆产量较大豆2年连作明显升高。说明大豆经过长期连作以后形成抑制性土壤,控制大豆胞囊线虫种群密度,改善由于连作障碍引起的大豆生长不良和产量降低现象,且在盛花期和鼓粒盛期对大豆胞囊线虫种群密度抑制作用尤为明显。采用Biolog微平板方法对大豆23年连作、大豆2年连作和轮作方式下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物功能多样性进行研究,结果显示,在大豆整个生育期进程中,大豆2年连作下,大豆胞囊线虫寄生微生物碳源利用能力有增加趋势,且对碳源的利用程度较为均匀。大豆23年连作除播前期外,在大豆整个生育期进程中与轮作结果相似,微生物活性和功能多样性均没有明显变化,但是大豆23年连作下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物对碳源的利用程度差异较大。冗余分析结果表明,3种轮作方式下,大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物主要利用的碳源类型存在差异。主成分分析结果发现,在大豆整个生育期进程中,大豆23年连作、轮作和大豆2年连作下大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物对碳源的利用能力明显分成3组,而主要引起这种差异的碳源类型为糖类、氨基酸类、羧酸类和多聚物类。说明大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物功能多样性与大豆胞囊线虫种群密度呈正相关,且大豆经过23年连作以后大豆胞囊线虫胞囊寄生微生物种群发生改变,有优势微生物存在。通过变性梯度凝胶电泳(dgge)方法对不同轮作体系下大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群多样性进行分析,结果表明,在大豆整个生育期进程中,大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构存在变化,不同轮作体系之间条带亮度和数量存在差异,大豆23年连作下存在特异性条带,在大豆整个生育期进程中,大豆23年连作和轮作下随着大豆生育期的推进,大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群多样性存在增加趋势,且胞囊寄生真菌多样性明显高于大豆2年连作。对dgge图谱中具有代表性20条特异性条带进行dna序列切胶测序,结果表明,这些大豆胞囊线虫寄生真菌种群主要分布于子囊菌门(ascomycota)和担子菌门(basidiomycota)。主成分分析结果表明,在大豆生育期进程中3种轮作方式下,大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群明显分开,大豆经过长期连作以后,大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构发生明显改变。大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌acremoniumsclerotigenum、paraphomaradicina、mortierellaelongata、verticilliumchlamydosporium和galactomycescandidum为大豆23年连作下优势大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌,大豆2年连作下优势大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌包括:paraphomachrysanthemicola、cylindrocarponsp.、neonectriaramulariae、fusariumoxysporum和galactomycescandidum。说明大豆经过长期连作以后,土壤中大豆胞囊线虫胞囊寄生真菌种群结构发生明显改变,并形成特有的大豆胞囊线虫优势胞囊寄生真菌。采用传统形态学和分子生物学相结合的方法鉴定不同轮作体系下大豆胞囊线虫优势和特殊寄生真菌。结果表明,不同轮作体系下大豆胞囊线虫寄生真菌主要包括:尖孢镰孢菌(fusariumoxysporum)、厚垣轮枝菌(verticilliumchlamydosporium)、互隔交链孢霉(alternariaalternate)、根异茎点霉(paraphomaradicina)、neonectriaradicicola、链蠕孢属(dendryphionnanum)、轮状镰孢菌(fusariumverticillioides)、短梗蠕孢菌(trichocladiumopacum)、长被孢霉(mortierellaelongata)、淡紫拟青霉(paecilomyceslilacinus)、青霉(penicilliumpolonicum)、烟曲霉(aspergillusfumigatus)、花斑曲霉(aspergillusversicolor)和黑曲霉(aspergillusniger)。这些大豆胞囊线虫寄生真菌很可能是对大豆胞囊线虫具有潜力的生防真菌。利用传统大豆胞囊线虫寄生真菌分离方法,对不同轮作体系下大豆胞囊线虫优势寄生真菌分离,结果表明在大豆23年连作下,大豆整个生育期内,从大豆胞囊线虫不同虫态上均分离到了大豆胞囊线虫优势寄生真菌镰孢菌(fusariumspp.)、厚垣轮枝菌(verticilliumchlamydosporium)和淡紫拟青霉(paecilomyceslilacinus),且数量明显高于大豆2年连作和轮作。其中23年连作下,大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率为1.3%和2.6%,而大豆2年连作下盛花期未分离到大豆胞囊线虫卵寄生真菌,鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率仅为0.1%。轮作盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊线虫卵寄生真菌分离频率也仅为0.4%和0.8%。大豆23年连作下,在大豆盛花期和鼓粒盛期优势寄生真菌分离数量出现明显升高趋势。同时,大豆胞囊线虫优势寄生真菌与大豆胞囊线虫种群密度呈现一定负相关趋势,说明大豆胞囊线虫寄生真菌很可能与抑制性土壤中大豆胞囊线虫种群密度自然衰退有关。对抑制性土壤中大豆胞囊线虫优势寄生真菌镰孢菌(Fusarium spp.)、厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)不同菌株寄生不同虫态大豆胞囊线虫致病性测定研究结果显示,不同种寄生真菌和同种寄生真菌不同菌株之间对大豆胞囊线虫的抑制效果均存在差异。其中镰孢菌H-4-E-14、G-4-E-16和4-G-C-A菌株对大豆胞囊线虫抑制作用均达到90%以上,H-4-E-14菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化的抑制率最高可达97.1%,菌株G-4-E-16对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率较高为90.6%,4-G-C-A菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用最佳,可达到95.3%。厚垣轮枝菌菌株4-H-C-12对大豆胞囊线虫胞囊孵化抑制作用最好达到95.2%,而菌株4-G-C-6对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率最高为81.6%,4-H-C-12菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用也较好达到96%。淡紫拟青霉17-H-C-15菌株对大豆胞囊线虫胞囊孵化的抑制率最好达到96.8%,而菌株4-G-C-10对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制效果最好,该菌株对大豆胞囊线虫J2抑制作用也较强可达到92%。说明这些大豆胞囊线虫寄生真菌均可通过寄生作用抑制大豆胞囊线虫胞囊和卵孵化及J2活性。综上所述,大豆经长期连作形成大豆胞囊线虫抑制性土壤,控制了大豆胞囊线虫病发生,改善了大豆生长状况,在一定程度上可提高大豆产量,改变了大豆胞囊线虫寄生真菌种群结构,在大豆长期连作进程中积累大豆胞囊线虫寄生真菌,形成优势寄生真菌种类,从而控制大豆胞囊线虫种群密度。
马丽丽[6]2008年在《发光杆菌NJ菌株发酵条件及对大豆胞囊线虫的作用研究》文中研究说明发光杆菌NJ菌株是从异小杆属(Heterorhabditis)线虫体内分离得到的共生细菌,初步证实该菌具有较强的杀大豆胞囊线虫活性,为了进一步开发利用此菌,本论文对该菌株开展了分类鉴定、并对其发酵条件及其对大豆胞囊线虫的室内毒力和盆栽防效进行了研究,得出以下结果:1.室内毒力研究表明,NJ发酵滤液原液及5倍稀释液对大豆胞囊线虫卵的孵化具有较强的抑制作用。NJ发酵滤液对二龄幼虫的作用效果要高于对卵的抑制作用,各处理二龄幼虫的死亡率随着时间的延长不断增加,发酵滤液处理72h后,原液、5倍、10倍稀释液对幼虫的校正死亡率均为100%,而50倍液的校正死亡率也高达63.82%。2.测定了NJ菌株在摇瓶培养时的基本发酵参数,结果表明其活性物质的产生和菌体的生长基本同步,不同培养液对于菌的生长影响较大,NJ菌株在TSY和YSG培养液中生长最好,菌群密度最大,活性最高。pH值在6.0~8.4范围内对于菌的生长及抑制活性影响不大。种龄为24h的种子液接种的发酵滤液抑制活性最高,达到最高峰,随后抑制活性呈下降趋势。1%~10%的接菌量对于菌的生长及大豆胞囊线虫卵孵化无影响。3.通过分子生物学方法测定NJ菌株的16S rDNA序列,PCR扩增获得其部分序列长度466bp,利用DNAstar软件的Multiple Sequence Alignment进行多序列同源性分析,用邻接法(Neighbor Joining)构建系统发育树,发现菌株NJ在系统进化树上和发光杆菌(Photorhabdus temperata)种内的菌株形成一个聚类群。本研究认为菌株NJ应是P. temperata种内的一个菌株。4.利用盆栽试验研究NJ菌株发酵液对大豆植株生长的影响及其对大豆胞囊线虫的防治效果。结果表明:适当浓度的NJ菌株发酵液处理能够促进大豆种子发芽以及植株生长,并有效抑制大豆胞囊线虫的发生。发酵液对大豆胞囊线虫的防效与处理方式、接种量、接种时间以及浓度有关。
赵晓晖[7]2011年在《大豆胞囊线虫抑制性土壤中寄生真菌及其作用研究》文中指出大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode, SCN; Heterodera glycines Ichinohe)是一种土传的定居性内寄生线虫,而且是危害世界大豆生产的主要病害之一。在同一地块上连年种植大豆会使土壤中越冬的胞囊大量积累,因此病害随着大豆连作年限的增加而逐年加重。但是近年来有报道大豆长期连作后出现大豆胞囊线虫自然衰退的现象,表现为连续种植大豆感病品种5年以上,大豆胞囊线虫的种群密度会明显降低,原来严重的病害症状会大大减轻或消失。在中国科学院海伦农业生态试验站长期连作定位区中也发现了该现象,并明确了该定位区的土壤为大豆胞囊线虫抑制性土壤。为了探讨大豆胞囊线虫抑制性土壤中的抑制因子及其发生机制,在该定位区中大豆胞囊线虫的胞囊、卵和二龄幼虫(J2)上分离寄生真菌,并对优势寄生真菌进行鉴定,制备发酵液,研究其对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制和二龄幼虫活性的致死作用。抑制性土壤的研究对利用其自然衰退机制防治大豆胞囊线虫具有重要的学术价值和生产实践意义。2009年和2010年在中国科学院海伦农业生态试验站大豆连作19年和20年定位区中采集土样,通过大豆长期连作和轮作系统的胞囊线虫数量进行比较发现,大豆长期连作后,胞囊线虫的饱满胞囊即可育胞囊、卵及J2数量均明显少于大豆轮作系统,明确了该土壤为大豆胞囊线虫自然衰退土壤,即大豆胞囊线虫抑制性土壤。采用直接分离法,在大豆胞囊线虫抑制性土壤以及大豆胞囊线虫的胞囊、卵和J2上,共分离得到大豆胞囊线虫寄生真菌284株,其中在抑制性土壤中获得优势寄生真菌59株,胞囊优势寄生真菌49株,卵优势寄生真菌91株,J2优势寄生真菌4株。对其中的优势寄生真菌进行形态学鉴定,已鉴定出5个种和1个变种,分别为尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、尖孢镰孢芬芳变种(F. oxysporum var. redoles)、禾谷镰孢(F.graminearum)、锐顶镰孢(F. acuminatum)、厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporia)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。其中镰孢菌属菌株无论在抑制性土壤中还是胞囊上分离频率均最高,分别为67.12%和25%,为优势属；淡紫拟青霉在大豆胞囊线虫各个虫态上均分离得到。实验室条件下,对优势寄生真菌制备发酵液,研究其对大豆胞囊线虫卵孵化和J2活性的作用。镰孢菌属F-2和F-9两菌株发酵液对大豆胞囊线虫卵孵化的抑制率分别为95.7%和95.2%；木霉属T-2发酵液的抑制作用最强,在作用2周后孵化抑制率为97.2%,其次是T-1；而被测定的6株厚垣轮枝菌发酵液对卵孵化均无明显的抑制作用。对J2活性的作用测定,发现镰孢菌属F-9和木霉属T-发酵液在1h时抑制率分别为90%.和84.67%,在所有菌株中见效最快,即对J2的瞬间击倒率高。镰孢菌属F-2以及除了E-13以外的其他5株被测厚垣轮枝菌发酵液在72h时使全部J2致死。表明镰孢菌(Fusarium spp.) F-2和F-9,木霉菌(Trichoderma spp.)T-1和T-2,厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporia) E-7和E-8是大豆胞囊线虫自然衰退土壤中的抑制性因子之一。
田丰[8]2014年在《费氏中华根瘤菌Sneb183防控大豆胞囊线虫病机理研究》文中研究指明大豆起源于中国,与根瘤菌之间存在协同进化关系,而大豆胞囊线虫是大豆生产中首要的病原物,利用根瘤菌防控胞囊线虫对大豆的危害是本文重点内容。本文系统研究了费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii Sneb183抑制大豆胞囊线虫病的作用机理,并揭示了根瘤菌、大豆和胞囊线虫三者之间的互作关系。通过Sneb183发酵液处理二龄幼虫,研究该菌株对线虫活性、致死率、卵孵化率、呼吸作用等生命活力的影响,明确了根瘤菌Sneb183对大豆胞囊线虫的作用方式；采用裂根法明确菌株Sneb183可以诱导大豆产生对胞囊线虫的系统抗性,通过影响胞囊线虫在大豆根系内的发育,进一步抑制线虫对大豆根系的危害；从差异蛋白质组的角度揭示了根瘤菌诱导大豆根系在线虫侵染的胁迫条件下,产生的差异蛋白质组,从而明确了三者间的关系和根瘤菌Sneb183诱导大豆抗胞囊线虫的作用机理。主要研究结果如下：1.明确了根瘤菌Sneb183对大豆胞囊线虫二龄幼虫的作用方式。利用根瘤菌Sneb183发酵液处理大豆胞囊线虫二龄幼虫,发现二龄幼虫行动能力受到明显抑制,且发酵液对二龄幼虫具有触杀作用,72h的致死率达到84.3%。经发酵液处理的线虫卵的孵化率也明显降低,孵化抑制率达62.4%。同时根瘤菌的发酵液可抑制二龄幼虫呼吸,并造成体液渗漏,最终抑制线虫活性甚至死亡。2.验证了根瘤菌Sneb183对大豆胞囊线虫病的防治效果。在温室试验中,接种根瘤菌Sneb183的大豆根系对大豆胞囊线虫二龄幼虫和胞囊的抑制率分别达到40.13%和37.8%。在大田试验中,接种根瘤菌Sneb183后,大豆根系对胞囊的抑制率为46.2%,同时根瘤菌Sneb183也表现出对大豆苗期生长的促生作用。在大豆成熟期,根瘤菌Sneb183处理的大豆株系,单株荚数和单株豆粒数与对照相比均有显著提高,分别为对照的1.34和1.37倍。3.验证了根瘤菌Sneb183诱导大豆产生抑制胞囊线虫的系统抗性。通过裂根法证明接种根瘤菌Sneb183可以诱导大豆产生系统抗性,从而抑制线虫二龄幼虫的侵染,抑制率为38.8%;通过冰冻切片技术观察植物根系的组织变化,表明根瘤菌Sneb183可以诱导大豆根部表皮增厚,并使中柱鞘细胞加厚,结构更为致密,从而抵御线虫侵染并限制发育；通过测定大豆根系防御酶的酶活变化,表明菌株Sneb183可以激发大豆根系抗性相关酶活性增加,进一步确定根瘤菌Sneb183可以通过诱导大豆产生抗性从而抑制胞囊线虫病害。4.证明了根瘤菌Sneb183可以抑制线虫在大豆根系内的发育。接种根瘤菌Sneb183的大豆根系中,不同龄期线虫均表现出发育迟缓；接种根瘤菌Sneb183后的大豆根系分泌物对大豆胞囊线虫二龄幼虫具有一定的毒杀作用,说明根瘤菌Sneb183的接种使大豆的根系分泌物成分发生了改变,产生对J2有毒杀作用的成分,从而表现出对J2的致死作用；通过测定距根瘤不同距离的根系分泌物对J2的作用,以及二龄幼虫在根系不同部位的侵染数量,没有出现显著性差异,从而证明根瘤菌Sneb183接种的大豆根系产生对线虫的抑制作用是一种系统抗性。5.测定了在线虫侵染的胁迫条件下,接种根瘤菌Sneb183产生的差异蛋白质组。从蛋白质组学的角度揭示了根瘤菌Sneb183在诱导大豆抵御线虫中的作用。共鉴定出456个差异蛋白质点,其中上调的有244个蛋白,下调的有212个蛋白。这些蛋白充分参与了植物的生物过程、分子功能和细胞组分等。6.获得了差异蛋白质组参与的代谢通路。在鉴定出差异蛋白质组的基础上,利用BLAST2G0进行蛋白质的功能注释并分类,用KEGG来对鉴定到的蛋白质在生物通路(pathway)层面的信息进行注释,并得到生物通路图。鉴定出的差异蛋白共参与了118种代谢途径,其中钙信号途径、类黄酮合成途径、磷酸戊糖途径和谷胱甘肽代谢途径等与植物能量代谢和抗胁迫相关,从而诱导大豆抵御线虫侵染,提高植物抗性。
向梅春[9]2006年在《明尼苏达被毛孢（Hirsutella minnesotensis）相关种分类及其分子生态学研究》文中研究指明植物寄生线虫是重要的植物病原物，给农业生产造成巨大的损失，生物防治是控制植物寄生线虫的有效途径之一。但是，植物寄生线虫生防菌剂的研发和应用受到了一定程度的限制，主要原因是缺乏高效的生防资源、对生防菌剂的生态学缺乏了解等。大豆胞囊线虫病是大豆生产上最重要的病害，造成的损失几乎等于其它病害损失之和，洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)和明尼苏达被毛孢(H.minnesotensis)是目前发现的两种重要的线虫内寄生菌，不仅在自然条件下对大豆胞囊线虫起着重要的控制作用，而且是具有广泛应用前景的生防资源。本研究对食线虫被毛孢及其相关种进行了分类研究；建立了明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR检测体系；将实时荧光定量PCR检测方法应用于田间土样明尼苏达被毛孢的检测；实时荧光定量PCR结合寄生率测定方法，研究土壤因子对明尼苏达被毛孢在土壤中的定殖和寄生活性。 线虫内寄生被毛孢及其相关种的分类。线虫内寄生被毛孢不同种及菌株间存在着形态、致病性和遗传多样性，明尼苏达被毛孢与寄生螨类的汤普森被毛孢(H.thompsonii)在形态上极为相似，针对这些问题进行了形态学和rDNA ITS和MAPK基因分析研究，发现寄生腐生线虫的被毛孢新种--线虫被毛孢(Hirsutella vermicola sp.nov.)。该新种与洛斯里被毛孢的区别主要是产孢细胞顶部呈螺旋状，对植物寄生线虫不寄生或寄生性很弱。同时证明汤普森被毛孢的三个变种划分不成立，修订了汤普森被毛孢种的特征，进一步证明明尼苏达被毛孢与汤普森被毛孢是完全不同的种。 明尼苏达被毛孢实时荧光定量PCR体系。明尼苏达被毛孢是我国大豆胞囊线虫幼虫最重要的寄生菌，可能是我国大豆胞囊线虫自然衰退的主要生防因子，通过对明尼苏达被毛孢rDNA ITS区分析，设计出特异性的上游引物5’-GGGAGGCCCGGTGGA-3’和下游引物5’-TGATCCGAGGTCAACTTCTGAA-3’以及TaqMan探针5’-CGTCCGCCGTAAAACGCCCAAC-3’，通过PCR反应体系优化、专化性和孢子灵敏度测定，建立了特异性的对土壤中明尼苏达被毛孢定量测定的实时荧光定量PCR体系，并且理论上能够检测到4个孢子／g土。 实时荧光定量PCR方法对田间土样的检测。利用建立的实时荧光定量PCR方法结合幼虫寄生率分析，对采自黑龙江省大豆田的20份土样进行了研究，在9份土样中分离到明尼苏达被毛孢，3份土样既没有幼虫寄生也没有检测到明尼苏达被毛孢的DNA，在有真菌寄生的17份土样中，6份土样能够检测到明尼苏达被毛孢，包括了所有幼虫寄生率大于10％的5份土样。这些结果证明实时荧光定量PCR能够定量检测自然土壤样品中的明尼苏达被毛孢，与寄生率分析存在
郑雅楠[10]2009年在《大豆胞囊线虫环境适应性的研究》文中研究表明大豆胞囊线虫病是一种为害大豆生产的重要病害，其病原物大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，Ichinohe，1952；Soybean Cyst Nematode SCN)是一类进化程度较高的植物寄生线虫，由于其生活史循环中具有“胞囊期”这个特殊的休眠阶段，使其对不良环境条件具有较高的抗性，特别能够适应冬季的低温。本文针对在大豆生产中SCN常遇的逆境因子，研究了不同胁迫条件对SCN的影响，以期从生理生化角度和分子角度揭示SCN抗逆境胁迫的机制，主要研究内容如下：1．通过测定大量和微量元素化合物在寄主体外对大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)存活、卵孵化的影响，明确了不同化合物对大豆胞囊线虫的抑制作用。其中KH_2PO_4、(NH_4)_2HPO_4和FeCl_3·6H_2O分别为大量元素化合物和微量元素化合物中对大豆胞囊线虫J2存活抑制作用较强的化合物。尤其是盆栽条件下，FeCl_3·6H_2O对大豆胞囊线虫繁殖有很强的抑制作用，(NH_4)_2HPO_4和FeCl_3·6H_2O对大豆根的生长有明显的促进作用。在对J2作用的LC50浓度下，绝大多数化合物对胞囊卵孵化具有很强的抑制作用。2．通过测定大豆田常用的8种除草剂对SCN在寄主体外存活和孵化的影响。得到了SCN敏感的除草剂为乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺，在田间喷施浓度下二者分别对SCNJ2的存活和卵孵化的抑制作用最强。进而测定了温室和田间乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对SCN在大豆上繁殖的影响，证实了这两种除草剂对SCN的繁殖具有较强的抑制作用。且乙草胺和2,4-滴丁酯+异丙草胺对大豆生长均无不良影响。3．通过测定不同pH值条件下SCN J2的死亡率，明确了SCN J2对酸性和碱性环境均有很强的适应性。测定了温度、pH值、光照和土壤含水量对休眠SCN的影响，结果证明pH 9．0 KOH、pH 5．0H_2SO_4和pH 6．0 H_2MoO_4均能促进SCN卵的孵化。此外，SCN J2对低温和高温逆境均有一定程度的抗性，尤其是对低温有较强的适应能力，并且低温和高温锻炼能够显著地增强SCN J2对低温和高温胁迫的抗性。通过分析海藻糖与SCN耐低温、高温的关系，得出SCN体内海藻糖含量与其对低温的适应性显著相关，而与其耐热性无显著关系。在一定的范围内，温度的升高有助于SCN休眠的解除，且能够提高非休眠卵的孵化率；增加光照时间有助于SCN卵的孵化和打破休眠；在寄主体外，15％的土壤含水量最适合SCN卵孵化。4．首次对不同方法提取大豆胞囊线虫不同虫态基因组DNA进行了比较，结果表明，不同虫态的样品中以白色雌成虫制备的DNA质量较好，而以不同方法和不同虫态提取的DNA为模板进行扩增，其质量均不影响已知片段的扩增结果。采用基因组步移技术，从SCN全基因组中得到了SCN热激蛋白70(Hsp70)基因的DNA序列，长度为2841bp；再通过RT-PCR得到了长度为1950bp的SCN Hsp70基因(Hg-Hsp-70)编码区，其GeneBank登录号为FJ816100。根据已知序列设计引物，克隆到SCN热激蛋白90(Hsp90)的DNA序列，长3003bp；通过RT-PCR得到了长度为2163bp的SCN Hsp90基因(Hg-Hsp-90)全长编码区，二者的GeneBank登录号分别为FJ985783和FJ985784。5．利用pEASY-E1成功构建了SCN Hsp70和Hsp90的原核表达载体Hg70pEASY-E1和Hg90pEASY-E1并在大肠杆菌Transetta(DE3)中成功地进行了表达。以pET-30为载体，实现了SCN Hsp70的非融合表达；经Western blot检测，验证了原核表达获得的Hg-Hsp-70和Hg-Hsp-90蛋白确实属于Hsp蛋白家族(Hsps)。6．以actin基因作为内参照基因，采用半定量RT-PCR技术，对温度和化学胁迫前后，SCN体内Hsp70和Hsp90基因表达的差异进行了检测。结果表明，SCN Hsp70基因的过表达确为SCN耐胁迫的重要机制之一。SCN受到温度和化学胁迫后，体内的Hg-Hsp-70和Hg-Hsp-90基因的表达量均有不同程度的增加，但经高温胁迫后基因表达量的上升幅度高于低温胁迫后表达量的上升幅度；在绝大部分胁迫处理中，SCNHg-Hsp-90基因表达量的增幅都低于Hg-Hsp-7D基因。利用显微镜对虫体进行观察发现，SCN受到化学胁迫后，体壁发生不同程度的缢缩现象，有的胁迫处理后虫体头部口针明显突出体外。酶标仪对海藻糖和海藻糖酶测定的结果显示，化学胁迫使SCN体内海藻糖含量上升，且随着胁迫时间的增加，海藻糖含量呈先上升后下降的趋势；海藻糖酶活性随着胁迫时间的增加而升高。说明在化学胁迫下，SCN自身通过海藻糖的合成和分解对机体进行调控，以适应或抵抗逆境胁迫。7．通过测定不同休眠阶段SCN体内生理生化物质的含量，明确了休眠期SCN体内物质变化的动态规律。即SCN休眠期间的糖醇积累型属海藻糖积累型，同时总糖、糖原和可溶性蛋白也参与休眠SCN体内物质代谢，为SCN休眠期消耗提供了能量，甘油与SCN休眠及抗寒能力密切相关。证实了SCN休眠程度越深，体内氨基酸总含量越多，休眠程度浅或处于活动状态时，氨基酸含量较少。游离亮氨酸、组氨酸和异亮氨酸与休眠过程中的生命活动有一定的关系，且水解苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸在SCN休眠过程中与氨基酸的代谢有关。SDS-PAGE电泳结果显示，在各个休眠阶段SCN全蛋白种类无明显变化。海藻糖酶、糖原磷酸化酶(Gpase)、山梨醇脱氢酶(NAD-SDH)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和果糖1-6-二磷酸羧醛酶(FBP)均与SCN休眠密切相关，进入休眠SCN体内海藻糖酶活性迅速升高，Gpase活性也显著升高，有利于海藻糖所需的碳源的供给，而PFK、PK、FBP和NAD-SDH四种酶活性均显著降低，休眠解除后活性回升。
参考文献：
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[7]. 大豆胞囊线虫抑制性土壤中寄生真菌及其作用研究[D]. 赵晓晖. 东北林业大学. 2011
[8]. 费氏中华根瘤菌Sneb183防控大豆胞囊线虫病机理研究[D]. 田丰. 沈阳农业大学. 2014
[9]. 明尼苏达被毛孢（Hirsutella minnesotensis）相关种分类及其分子生态学研究[D]. 向梅春. 湖南农业大学. 2006
[10]. 大豆胞囊线虫环境适应性的研究[D]. 郑雅楠. 沈阳农业大学. 2009