吴玉英 仲向东 王晓华 俞小卫 通讯作者 南京医科大学附属常州市第二人民医院呼吸科 江苏 常州 ２１３００３ 基金:常州市国际科技合作计划(cz２０１１００２１) 作者简介:吴玉英(１９８５年１０月),籍贯苏州,硕士,主治医师,研究方向:人体炎症反应与免疫调节机制.
【摘要】 目的 通过观察静注人免疫球蛋白(IntravenousImmunoglobulin,IVIg)对健康人单核细胞来源的树突状细胞(monocyte－deriveddendriticcells,mDCs)表面TLR２表达的影响,探讨免疫球蛋白对人体炎症反应的调节机制.方法 利用Ficoll分离法分离健康人外周血单个核细胞,经重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(rhGM－CSF)、重组人白细胞介素４(rhIL－４)诱导培养树突状细胞,将第７天的细胞分成三组,分别为IVIg刺激组、OVA 无关蛋白对照组和未刺激组,经流式细胞仪检测CD１１c＋ 细胞表面的表达水平.结果 健康人单核细胞来源的树突状细胞经过IVIg刺激９h后,CD１１c＋ 细胞表面TLR２的表达水平较未刺激组以及OVA 无关蛋白对照组明显下降(P＜０．０１).结论:静注人免疫球蛋白可以下调mDCs表面TLR２的表达,从而影响TLR２信号通路的传导,影响机体炎症反应. 【关键词】 树突状细胞; 静注人免疫球蛋白; Toll样受体２TheInfluenceofIntravenousImmunoglobulinontheExpressionofToll－likeReceptor２on Monocyte－derivedDendriticCells WU Yu－ying,ZHONG Xiang－dong, WANG Xiao－hua,YU Xiao－wei△ (DepartmentofRespiratory Medicine,ChangzhouSecondPeople’sHospitalwithNanjing MedicalUniversity,Changzhou , Jiangsu,２１３００３,China)【Abstract】 Objective:ToinvestigatetheexpressionofToll－likereceptor２(TLR２)onmonocyte－deriveddendriticcellsbyintravenousimmunoglobulin,tofurthere(xplorethemechanismofintravenousimmunoglobulinininflammation．Methods:WeincubatedandinducedDCsubsetsdifferentiatedfromperipheralbloodmononuclearcells PBMCs)byrhGM－CSFandrhIL－４．AlltheDCswereclassifiedintothreegroupsrandomly,theIVIginterventiongroup、theOVAgroupandthecontrolgroup．DetecttheexpressionofTLR２onCD１１c＋cellsofallgroupsbytheflowcytometry．Results:AftertheIVIgintervention,weobservethatonthe９hourtimepoint,theexpressionofTLR２significantlydecreasedonCD１１c＋cellsthantheOVAgroupandthecontrolgroup(P＜０．０１)．Conclusions:IVIgmaysuppresstheinnateimmuneresponsebydeＧcreasin【Kgetyhewoerxdpsr】essionofTLR２ondendriticcells,whichmayreducesinflammation． Dendriticcell(DC);IntravenousImmunoglobulin(IVIg);Toll－likereceptor２(TLR２) 【中图分类号】R９７７．８【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－０４４６－０２
前言人静注免疫球蛋白含有广谱抗病毒、细菌或其他病原体的IgG抗体,另外免疫球蛋白的独特性抗体能形成复杂的免疫网络,所以具有免疫替代和免疫调节的作用.目前人免疫球蛋白在重症感染中常联合抗生素一起使用,提高对病毒、细菌的抗感染作用.但具体的作用机制并不明确,目前对人免疫球蛋白使用的剂量、疗程都没有确切的指南.本实验尝试通过了解免疫球蛋白对mDCs表面TLR２表达的影响,探讨其作用机制,以指导临床治疗.
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 研究对象 ５名健康志愿者.
１．１．２ 主要试剂 重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(rhGM－CSF)以及重组人白细胞介素－４(rhIL－４)均购自美国PeproTech 公司.人静注免疫球蛋白购自华兰制药.CD１１c－别藻蓝蛋白(APC)、CD８６－藻红蛋白(PE)、HLADR－PercpCy５．５、IgG１a－异硫氰酸荧光素(FITC)、IgG１a－藻红蛋白(PE)均购自美国BD公司,鼠抗人TLR２－异硫氰酸荧光素(FITC)购自美国eBioscience公司.RPMI１６４０和胎牛血清购自美国Hyclon公司.卵清蛋白(OVA)购自美国Sigma公司.CCK８试剂盒购自碧云天生物.淋巴细胞分离液购自天津灏阳生物品科技有限公司.
１．２ 方法１．２．１ DC的体外诱导和培养 从健康志愿者获得肝素抗凝新鲜外周血,利用FicollHypaque密度梯度离心法(２０００r/min× ３０min)从中获得白膜层细胞,PBS洗涤２次(１５００r/min× １０min),即获得单个核细胞(PBMCs).用RPMI１６４０培养基调整细胞浓度至２×１０６/ml,加入６孔培养板内,置于３７℃、５％ CO２ 孵箱内培养３h.后弃去培养上清,加入新鲜RPMI１６４０培养基洗去培养板中非贴壁细胞,每孔各补充１０％ FBSRPMI１６４０２ml,其中含rhGM－CSF２０ng/ml、rhIL－４１０ng/ml,继续置于孵箱内培养,隔日半量换液.培养至第七天时收获细胞,应用流式细胞学的方法,检测细胞表面CD１１c、CD８０、CD８３、CD８６、HLADR的表达.
１．２．２ CCK８毒性试验 细胞培养至第７天,分别加入终浓度为１ug/ml的丙种球蛋白,均分别孵育３h、６h、９h、１２h、２４h.收集各组细胞行细胞计数,并重悬至细胞数５００００/ml.取一９６孔细胞培养板,每孔加入２００ul细胞悬液,再加入２０ulCCK－８溶液,在细胞培养箱中继续共孵育１h,并用１６４０培养基和CCK－８溶液(不含细胞)作为空白对照组,１h后用酶联免疫检测仪在４５０nm波长测定吸光度(A). 细胞毒性评价标准:通过计算细胞相对增殖率(relativegrowthrate,RGR)来评价细胞毒性,计算公式:RGR＝(实验组A值/培养基A值)×１００％,然后根据５级毒性评价标准分级(表１),对各组结果进行评价.
３ 讨论
DC是人体内功能最强大的抗原递呈细胞,DCs根据其来源不同可以分为髓样树突状细胞(mDCs)和类浆细胞样树突状细胞(pDCs),其功能受损将导致其无法将抗原递呈给T淋巴细胞,从而导致异常的体液免疫和细胞免疫.mDC表型特点为谱系标记(CD３、CD１４、CD１６、CD１９、CD２０、CD５６)－ 、HLA－DR＋ 、CD１１c＋ ,主要表达TLR２、TLR４,发挥抗原提呈的功能,并可产生大量肿瘤坏死因子和IL－１２,促进细胞免疫应答的作用[１].TLRs作为一组可识别入侵的PAMPs的模式识别受体,通过接头蛋白、蛋白激酶和转录因子等进行细胞信号传导,从而影响DCs的成熟活化以及促炎症因子的释放[２].关于多种微生物感染的研究结果表明[３],TLR２识别的PAMPs非常广泛,对病毒,细菌以及寄生虫等等均可识别.TLR２在受到刺激后发生构型改变并通过与MyD８８通路活化IRAK家族.IRAK参与多种TIR结构域下游的信号通路,活化NF－κB、MAP 激酶和IRF７等信号分子,从而影响细胞因子的分泌.国内的研究显示,老年性重症肺炎、病毒性社区肺炎、衣原体肺炎均与TLR２信号通路相关[４,５,６];并且通过将TLR２抑制抗体静注入小鼠体内,抗TLR２抗体可抑制小鼠金黄色葡萄球菌肺炎炎症介质的释放,减少炎症细胞浸润,从而减轻肺部炎症反应[７]. 静脉滴注丙种球蛋白能有效提高免疫球蛋白尤其是IgG水平,对重症感染有较好的治疗作用,具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用.目前临床上,静注免疫球蛋白的应用常见于于儿科重症的手足口病、肺炎、川崎病等,还有重症肺炎、格林巴利综合征(AIDP)等.国内的研究显示,静注人免疫球蛋白治疗重型肺炎在有效率和平均住院日,治疗组明显优于对照组,并且治疗后细胞因子明显下降[８,９];大剂量IVIG静脉注入疗法广泛用于治疗KD,有研究显示IVIG１g/kg、IVIG２g/kg１次应用在住院时间、总热程、退热时间、黏膜充血、手足肿胀消退时间及预防CAL发生优于IVIG４００mg/(kg??d)连用５天[１０];在AIDP患者治疗中,IVIG治疗组Hughes评分、治愈情况等均明显优于对照组,研究者认为其作用机制可能与IVIG能够中断免疫反应、中和致病性作用、抑制细胞产生自身抗体,从而起到保护周围神经,防止和减少周围神经损害的作用有关[１１,１２].目前公认的免疫治疗机制大概如下:(１)通过静脉应用免疫球蛋白可封闭靶细胞的受体,阻断抗原刺激和自身免疫反应,从而阻止特异性抗体对宿主靶细胞的损伤, 抑制巨噬细胞对抗原的作用,可调节免疫反应,并抑制抗体依赖性细胞介导的细胞活性;(２)通过可变区结合抗原作用,中止自身抗体产生,或与免疫复合物中抗原结合,改变免疫复合物分子量的大小,增加其可溶性,使其更易被巨噬细胞吞噬;(３)影响淋巴细胞成熟及分化,抑制白细胞免疫反应,抑制炎性因子如IL－１、IL－６、TNF－２等产生,有助于使病情恶化.但目前对于免疫球蛋白具体的免疫调节机制还不明确.本实验即通过免疫球蛋白刺激mDCs,观察其表面TLR２ 的表达的影响,从而探讨其免疫调节机制. 我们通过CCK８毒性实验,了解到免疫球蛋白对mDCs没有毒性作用,并不会影响mDCs的分化及其增殖.然而,免疫球蛋白与mDCs共孵育９h后,流式细胞术检测其细胞表面TLR２的表达,结果显示免疫球蛋白组TLR２的表达率明显低于空白对照组及OVA 蛋白对照组.我们据此作出以下推测:(１)免疫球蛋白可以抑制TLR２的表达,从而影响信号通路的传导;(２)免疫球蛋白亦或通过封闭TLR２,从而影响信号通路的传导.当前的研究明确表明,重症感染常伴有过高的细胞因子水平,从而介导异常而广泛的免疫反应,即细胞因子风暴.细胞因子风暴的发生,是源自人体的免疫系统对于入侵者的反应过于激烈,从而合成了高水平的细胞因子,免疫细胞和相关液体在感染部位的累积会阻碍组织和器官的正常功能,例如肺,是引起急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭的重要原因.细胞因子风暴常见于一些病毒(如流感病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、SARS)及细菌(如土拉弗朗西斯菌)感染、某些药物治疗和造血系统疾病[１３,１４,１５,１６].不管是抑制其表达亦或封闭TLR２,免疫球蛋白都可通过对TLR信号通路的影响,削弱细胞因子风暴,从而减轻机体的免疫损害.在针对重症感染的治疗过程中,免疫球蛋白与抗生素连用,可以更好的提高抗生素的有效率,并且缓解炎症反应,减轻患者症状,从而提高治愈率. 我们将继续探讨,进一步明确免疫球蛋白对TLR２信号通路的调节机制,例如TLR２mRNA 水平的变化及其下游信号传导分子IRAK的变化.以及不同免疫球蛋白刺激浓度计刺激时间对细胞因子产生水平的影响以期找到最适宜的刺激浓度及刺激时间,以指导临床用药. 参考文献[１] Duan XZ,Zhuang H,Wang M,etal．DecreasednumbersandimpairedfunctionofcirculatingdendriticcellsubsetsinpatientswithchronichepatitisB[ infection(R２)．JGastroenterolHepatol２００５;２０(２):２３４–２４２． ２] KawaiT,AkiraS．Theroleofpattern－recognitionreceptorsininnateimmuＧnity:updateonToll－likereceptors[J]．Natureimmunology,２０１０,１１(５):[ ３７３－３８４． ３] Sa[ndorF,BucM．Toll－likereceptors．I．Structure,functionandtheirligands [ J]．FoliaBiol(Praha),２００５,５１(５):１４８－１５７． ４] 唐伦先,白建文.老年重症肺炎患者外周血单核细胞TLR２/４表达变化及临床意义[J].中华临床医师杂志(电子版)２０１３年３月第７卷第５期.[５] 周洲,吴移谋.肺炎嗜衣原体热休克蛋白１０经TLR２及TLR４调控THP－１分泌TNF－a[J].中华微生物学和免疫学杂志２０１２年１１月第３２卷第１１期.[６] 孙亚娇,陈复辉.成人病毒性社区获得性肺炎患者外周血TLR２/３/９的表达及临床意义[J].哈尔滨医科大学学报,２０１４年１２月第４８卷第６期.[７] 温顺航,吴沪军.抗TLR２抗体抑制小鼠金黄色葡萄球菌肺炎炎症反应[J].中国免疫学杂志,２０１４年第３０卷.[８] 梁水明.丙种球蛋白静脉滴注治疗小儿重症肺炎４０例[J].新乡医学院学报,２００５,９(５):５１１－５１２.[９] 王庆丰,梁全全.丙种球蛋白佐治对重症肺炎支原体肺炎患儿血清细胞因子的影响[J].中国药业,２０１３年３月２０日第２２卷第６期:[１０] 王开元,杜东红,刘雄诚.３种剂量丙种球蛋白治疗川崎病疗效观察[J]. 现代医药卫生２００８年２４卷第６期:８４４． [１１] 袁魁珍,童守义,何慧君,等．大剂量丙种球蛋白治疗格林－巴利综合征临床疗效分析[J].中国社区医师:医学专业,２０１０,１１(１７):２４． [１２] 丁峰.丙种球蛋白治疗AIDP临床疗效观察[J].现代医药卫生,２０１２年１０月１５日第２８卷第１９期.[１３] 吴克复,马晓彤,郑国光等．造血系统的人类疱疹病毒潜伏感染[J]．中国实验血液学杂志,２００８,１６(０６),１２５１－１２５６． [１４] UsD．Cytokinestorminavianinfluenza．Mikrobiyolojibülteni,２００８,４２(２):[ ３６５－３８０． １５] MaresCA,OjedaSS,MorrisEG,etal．InitialdelayintheimmuneresponsetoFrancisellatularensisisfollowedbyhypercytokinemiacharacteristicofseveresepsisandcorrelatingwithupregulationandreleaseofdamage－associＧ[ atedmolecularpatterns．InfectImmun,２００８,７６(７):３００１－３０１０．１６] DeCastroIF,Guzmán－FulgencioM,García－álvarezM,etal．FirsteviＧdenceofapro－inflammatoryresponsetosevereinfectionwithinfluenzavirusH１N１．CritCareMed,２０１０,１４(１):１１５－１２１．
论文作者:吴玉英 仲向东 王晓华 俞小卫
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/25
标签：细胞论文; 免疫球蛋白论文; 免疫论文; 细胞因子论文; 肺炎论文; 抗体论文; 树突论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;