癫痫发作小鼠模型海马活化素βA的表达及重组人活化素A的保护作用

癫痫发作小鼠模型海马活化素βA的表达及重组人活化素A的保护作用

余巨明[1]2003年在《癫痫发作小鼠模型海马活化素βA的表达及重组人活化素A的保护作用》文中认为癫痫是神经系统常见病,临床表现以慢性、自发性和反复性发作为特征。其病因及发病机制复杂,至今尚无根治性治疗药物。动物实验已证实,一次长时或反复的癫痫发作可引起海马等易损区神经元坏死、反应性胶质细胞增生及苔藓纤维发芽等病理改变,并可能是癫痫发作得以长期维持的基础。已经证实,有些细胞因子和生长因子促进了以上病理变化的发生;有些则参与了对抗痫性脑损伤及癫痫发作。提示细胞因子和生长因子在癫痫后的病理机制中具有重要作用,并可能成为今后癫痫更有效治疗的切入点。活化素是转化生长因子β超家族成员之一。它有活化素A、活化素B和活化素AB叁种,分别由βA-βA、βB-βB及βA-βB两个β亚单位组成。近年发现,缺血缺氧、局部机械性海马损伤及海人藻酸毒性损伤模型的海马组织中活化素βA mRNA表达明显上调,而活化素βB mRNA表达无变化;外源性活化素A能保护体内外神经元免受损伤。最新研究还发现,碱性成纤维细胞生长因子的神经元保护作用是通过诱导活化素βA mRNA的表达增加起作用的。因此活化素A有可能是脑保护与修复的关键性因子。然而,活化素βA 及活化素受体mRNA在癫痫发作模型海马组织中表达变化的研究鲜见报道;癫痫发作后活化素βA mRNA的变化是否导致活化素A蛋白水平的相应改变尚不清楚;活化素A是否对癫痫发作及海马病理改变有影响亦未见研究。本研究以匹鲁卡品(pilocarpine,PC)诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE)小鼠模型。发作行为按Racine标准分为0-Ⅴ级,以出现Ⅱ级以上发作并持续1h为癫痫持续状态(status epilpticus,SE)成模标准,成模后即刻腹腔注射安定终止发作,并以成模时定为SE后1h;无明显抽搐或呈非持续状态(non- status epilepticus ,NSE)发作小鼠列为NSE组,亦在与SE组相当时间腹腔注射安定;对照组以生理盐水取代PC,其余处理与PC给药鼠相同。首先应用RT-PCR方法同时观察了成模鼠(SE)与非成模鼠(NSE)海马组织活化素βA mRNA表达的时程变化;应用原位杂交及焦油紫尼氏染色方法分别观察了SE小鼠海马组织活化素βA mRNA表达的分布与海马形态结构的病理变化;接着采用非还原型SDS-PAGE和Western blotting观察了SE与NSE小鼠海马组织活化素A与抑制素A蛋白表达的动态变化,并同时应用RT-PCR分析了活化素受体ⅡA mRNA的表达;最后通过发作程度评分、脑电图记录、焦油紫尼氏染色及组织原位凋亡检<WP=7>测等方法观察了预先脑室注射重组人活化素A对PC致痫作用与海马病理变化的影响。结果显示:1、SE开始前小鼠海马活化素βA mRNA呈一过性明显下调,SE后1h上升至对照水平,SE后3h表达显着增高,6h达高峰,24h开始下降,48h下降至稍高于正常水平。而NSE小鼠海马活化素βA mRNA表达无明显改变。2、海马活化素βA mRNA表达阳性细胞为神经元,最早于3h时出现在CA2及DG区,6h达高峰时CA3区出现强阳性表达,24h时开始下降,48h时仅CA2区与对照相比仍有统计学差异,但CA1区始终未出现明显阳性表达;焦油紫尼氏染色显示,海马CA2区神经细胞受损相对较轻,CA1、CA3区损害严重。3、PC诱导SE引起的活化素βA mRNA表达上调能引起活化素A蛋白水平的相应上调,但其表达略微滞后,于6h增高达显着水平,24h达高峰,48h仍维持在较高水平;抑制素A蛋白水平及活化素受体ⅡA mRNA表达与对照组相比无明显差异。4、预先1h脑室注射rhACT与注射PBS比,腹腔注射PC后,rhACT组(16只)小鼠无死亡、癫痫持续状态及全身强直-阵挛发作,仅见全身颤抖或前肢阵挛发作;而PBS组(20只)4只严重发作致死(20%),11只出现癫痫持续状态(55%),2只出现全身强直-阵挛发作(10%),仅3只表现全身震颤而无抽搐发作(15%)。两组比较,发作程度有非常显着的差异(P<0.001);rhACT组脑电图无明显改变,或痫样放电显着减少,波幅明显降低;而PBS组脑电图表现阵发或持续高幅棘波、棘慢波放电;rhACT组24h及48h后海马各区未见明显结构性改变与神经元凋亡。而PBS组24h及48h后海马存在明显病理改变与神经元凋亡,并以48h为重。结论:1、PC诱导的SE能明显上调海马活化素βA mRNA及活化素A蛋白的表达,但对活化素受体ⅡA mRNA及抑制素A蛋白表达无明显上调作用。2、海马病理损害的轻重可能与活化素βA mRNA表达早晚及持续时间长短有关。3、外源性活化素A可以抑制痫样放电,减轻癫痫发作程度及海马神经元的损伤。表明SE后内源性活化素A蛋白表达的增加很可能起对抗癫痫性脑损伤与癫痫发作的作用。

刘楠[2]2004年在《百草枯对PC12细胞的活化素和受体ⅡA表达的影响及活化素A对其的保护》文中进行了进一步梳理帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是黑质纹状体多巴胺能神经元损害为主的神经变性病,其病因目前尚不清楚,可能是涉及了环境和遗传等多因素的影响。线粒体呼吸链抑制剂MPP+和其化学结构类似物百草枯均可以引起多巴胺能神经元的损害。大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株具有多巴胺能神经元的特点,因此,被用于MPP+和百草枯的毒性研究。保护多巴胺能神经元是PD治疗中的一大难题。单胺氧化酶B的抑制剂L-Deprenyl在体外实验中显示出具有良好的神经保护作用。一些神经营养因子也可以保护变性疾病中的易损神经元,维持其正常功能的发挥。在动物实验中已证实碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)具有保护多巴胺能神经元的作用,其对神经元的保护作用是可以通过诱导活化素βA(activin βA , Act βA)的表达来实现的。胶质源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是目前认为最有效的可保护黑质纹状体系统多巴胺能神经元的营养因子,其神经营养作用程度与活化素A(activin A, Act A)是相同的。Act A是转化生长因子β(Transforming growth factor beta ,TGF-β)超家族的成员之一,由βA-βA两个β亚单位组成。活化素家族还包括活化素B(activin B, Act B)和活化素AB(activin AB, Act AB),分别由βB-βB及βA-βB两个β亚单位组成。近年研究发现,在缺血、创伤、兴奋性毒性物质损害后,海马和齿状回处的Act βA mRNA的表达水平上调,Act βB mRNA表达未发生变化,活化素受体IIA(activin receptor IIA, Act RIIA)的mRNA表达水平下调。外源性应用Act A可以保护这些部位的神经元,提示Act A可能是一种神经保护因子。但是,百草枯和MPP+损害后,多巴胺能神经元上Act的不同亚单位和其受体如何变化,目前没有相关报道;外源性应用Act A是否可以保护多巴胺能神经元免受百草枯和MPP+损害的研究鲜见报道;Act A保护作用的机制如何,目前无相关报道。因此,探讨Act A在多巴胺能神经元保护方面的作用,对PD发病机制的认识及寻找新的治疗途径具有重要的意义。本研究首先利用了逆转录-多聚酶链反应(reverse transcriptase –polymerase chain reaction, RT-PCR)方法来观察百草枯和MPP+损害后,PC12细胞的Act βA mRNA、Act βB mRNA、Act RIIA mRNA及抑制素(inhibin) α mRNA表达的时程变化,并用台盼蓝染色法观察损害后细胞活力的变化。<WP=7>然后预先24h给予PC12细胞重组人活化素A(recombinant human activin A, rhAct A)和L-Deprenyl,利用MTT法观察损害后细胞活力的变化;免疫细胞化学法测定细胞的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH) 蛋白和Bcl-2蛋白水平的变化;RT-PCR法测定TH mRNA和Bcl-2 mRNA表达水平的变化;脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)来评价细胞凋亡的变化。通过比较Act A组、L-Deprenyl组与损害组之间的差异,探讨Act A对百草枯和MPP+损害的保护作用及其可能的作用机制。结果1、百草枯组和MPP+组在损害后3h、6h、12h和24h时,PC12细胞Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平随损害时间的延长呈现逐渐下降的趋势,在损害后3h开始降低,于损害后24h降至最低。相比之下,对照组的Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平在上述各时间点无明显变化。inhibin α mRNA在上述的各个不同时间点与对照组相比,无明显变化。百草枯组和MPP+组在损害后的3h和6h,PC12细胞活力无明显改变;损害后12h和24h,细胞活力出现明显的降低,与对照组相比有显着差异。2、百草枯组和MPP+组在损害后12h和24h,PC12细胞的TH mRNA和Bcl-2 mRNA的表达、TH蛋白和Bcl-2蛋白水平均下调,并且细胞活力下降,凋亡细胞明显增多。Act A组和L-Deprenyl组在损害后12h和24h时,PC12细胞的TH mRNA和Bcl-2 mRNA表达、TH蛋白和Bcl-2蛋白水平增加;细胞活力增加,凋亡细胞明显减少。两组分别与百草枯组和MPP+组相比,有显着差异。但比较活化素A组和L-Deprenyl组的保护作用,两组间无明显差异。结论:1、百草枯和MPP+的损害,可以下调PC12细胞Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平,降低细胞活力。所以,PC12细胞的损害可能与Act及其受体的表达水平下调有关。2、外源性应用rhAct A可以提高PC12细胞活力,减少凋亡,其作用机制可能是通过预防百草枯和MPP+损害后Bcl-2表达水平的下调来实现的。

参考文献:

[1]. 癫痫发作小鼠模型海马活化素βA的表达及重组人活化素A的保护作用[D]. 余巨明. 复旦大学. 2003

[2]. 百草枯对PC12细胞的活化素和受体ⅡA表达的影响及活化素A对其的保护[D]. 刘楠. 复旦大学. 2004

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