（皖南医学院弋矶山医院病理科 芜湖 241001）
【摘要】目的:探讨原位杂交变性温度的改变对EBER阳性表达的影响。方法：采用不同变性温度对多例EBER阳性表达的标本进行原位杂交检测。结果：A组50℃：整体几乎阴性，几张微弱阳性，B组55℃：阳性较A组多，强度不稳，整体不均一，C组60℃：基本阳性，强度较强，有几例强度偏弱，D组70℃：全部阳性，强度强，稳定，均一。E组75℃：全部阳性，强度强，背景增强，假阳性率高，特异性降低。结论：原位杂交检测EBER阳性表达在一定范围里随变性温度升高信号稳定性增强，70℃为最佳变性温度。
【关键词】 原位杂交；EBER；温度
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）35-0375-02
Study on the stability of EBER in situ hybridization and the temperature of the modified LI jiajia,XU Guoxiang, HE Lei, MEI Jingjing, ZHANG Wei-uan, CHENG Jiao(Department of pathology, Yijishan Hospital, Wannan Medical College, Wuhu,China, 241001)
【Abstract】Objective: To investigate the effect of the change of the temperature of the in situ hybridization on EBER expression. Method: In situ hybridization detection was performed by using different temperature to detect the positive expression of EBER. Result: A group of 50 ℃: almost the whole negative, a weakly positive, B group 55 ℃: compared with the positive group a multi, intensity is unstable, as a whole is not uniform, and group C 60 ℃: was basically and strong intensity, a few cases of strength weak, group D 70℃: all positive, strength, strong, stable, uniform. The E group was 75℃, all positive, strong intensity, background enhancement, high false positive rate, specificity decreased. Conclusion: In situ hybridization detection of EBER positive expression in a certain range, with the increase of the temperature of the modified signal stability enhancement, 70℃ for the optimum temperature of denaturation.
【Key words】In situ hybridization; EBER; temperature
Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)非常密切的关系。各家检测EBV DNA的方法均不完全相同，灵敏度也存在差异。原位杂交是比较传统的方法，但用EBV-DNA 片段作探针原位杂交的检测灵敏度并不高，而且检测步骤相对繁琐。我们用EBER(Epstein-Barr virus encoded RNAs)-1作探针原位检测鼻咽癌组织中的EB病毒，获得了满意的效果。
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1标本
鼻咽部活检组织石蜡包埋切片标本由安徽省皖南医学院附属弋矶山医院病理科提供，共25例，均为近1年内存档检测过阳性标本，按常规福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片(2-4μm厚)，取连续切片标本分别进行显色原位杂交（CISH）染色。
1.1.2试剂及辅助材料
(1)试剂盒 （福建泰普生物公司）包括EBER探针、蛋白酶K、一抗、二抗、HRP聚合物（三抗）、DAB及DAB底物、18×18mm杂交用硅化盖玻片等。（注意：EBER探针-20℃，其余4℃储存）(2)辅助试剂 95％酒精、无水酒精、二甲苯、PBS（PH=7.4）、Harris苏木素、0.5％盐酸酒精、Scott＇s液、蒸馏水等。
1.1.3设备及器材
ThermoBrite原位杂交仪、数码温控恒温水浴箱、Eppendorf移液器（1-10ul和10-100ul各一支）、Eppendorf管、立式染缸、染色架数个，冲洗瓶、湿盒、计时器、光学显微镜、60℃恒温干燥箱、37℃隔水式恒温孵育箱
1.2方法
1.2.1组织前处理
（1）脱蜡：4ul厚切片粘附在APES处理载玻片上，60～70℃烘烤1-2h，37℃二甲苯15min×2，无水酒精3min×2，95％酒精3min×2，80％酒精3min×2，蒸馏水冲洗3～5min。（2）蛋白酶K消化：甩干切片，用滤纸吸去周围多余液体，每片组织滴加1×蛋白酶K工作液（蛋白酶原液与PBS 按1:25配成工作液）约50ul。室温孵育5min ，蒸馏水冲洗1～2min，梯度酒精脱水，干燥。
1.2.2变性杂交
（1)滴加探针：每片组织滴加约10-20ul探针，并加盖玻片，避免气泡，用橡胶水泥封固玻片周围。（2）运行杂交仪程序：将玻片放入杂交仪内，运行程序，A组：50℃变性80min， B组：55℃变性80min，C组：60℃变性80min，D组：70℃变性80min，三组共同37℃杂交孵育4-16h。3）去除玻片周围橡胶水泥，置于48℃ PBS（预热），待盖玻片自行脱落，继续浸泡1min，48℃ PBS洗涤浸泡2×5min（轻微震荡染缸）。
1.2.3信号放大和显色
（1）小心擦去组织周围多余液体，滴加适量一抗（约50ul根据组织大小增、减量），水湿盒37℃孵育30min。37℃ PBS洗涤浸泡3×2min（轻微振荡染缸）。（2）小心擦去组织周围多余液体，滴加适量二抗（约50ul根据组织大小增、减量），水湿盒室温孵育20min。室温 PBS洗涤浸泡3×2min（轻微振荡染缸）。（3）小心擦去组织周围多余液体，滴加适量HRP聚合物（约50ul根据组织大小增、减量），水湿盒室温孵育30min。室温 PBS洗涤浸泡3×2min（轻微振荡染缸）。（4）小心擦去组织周围多余液体，滴加适量DAB显色液（约50ul根据组织大小增、减量），水湿盒室温孵育5～10min。最好显微镜下观察显色过程。（5）自来水冲洗，苏木素复染（过深会影响棕色信号观察），盐酸酒精分化，温水返蓝，递度酒精脱水，中性树胶封片，镜检。
2.结果
本实验变量：变性温度分别为A组：50℃、B组：55℃、C组：60℃、D组：70℃、E组75℃，依次递增，A组整体几乎阴性，几张微弱阳性，B组阳性较A组多，强度不稳，整体不均一，C组基本阳性，强度较强，有几例强度偏弱，D组全部阳性，强度强，稳定，均一。E组全部阳性，强度强，背景较深，假阳性率高，特异性降低。见图（1-5）。
3.讨论
EBER是EB病毒编码的小RNA，是EB病毒的表达产物，在EB病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在。检测EB病毒的存在，是通过EBER的特有序列设计的EBER单链DNA探针能特异地与EBER靶序列互补、杂交实现的。
根据原位杂交原理，应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对原则进行特异性结合而形成杂交体，再利用与标记物相应的检测系统进行显示处理，从而达到检测目的。这一技术具有很高的敏感性和特异性。Khan等［1］认为，原位杂交技术是组织学材料中检测EB病毒的金标准，在检测时具有定位作用，能够确定病毒与组织和细胞的关系。在确定与疾病的关系时，原位杂交已成为公认的标准方法［2］。虽然此技术过程比较繁琐，但与蛋白水平检测相比，具有明显的优越性，其关键步骤在于变性杂交过程。
原位杂交实验技术对实验温度、时间、试剂配比、滴加顺序及试剂量有严格的要求，其中对温度的调节尤为重要[3-5]。适当的温度有利于杂过程中探针与底物的结合，利于在清洗过程中将没有杂交上的探针以及组织周围多余的杂交液洗涤得更彻底，以免和后面的抗体产生反应，造成非特异性的背景，温度过高或过低都会影响实验的反应过程。先进的原位杂交仪可以较恒温培养箱更精确地控制稳定杂交温度。变性过程的关键在于控制DNA双链的解链温度，也就是DNA随着变性温度的升高，杂交阳性信号数量及强度均明显增多、增强[6]。研究表明，细胞靶DNA分子解链达50%，特异探针即可与之杂交，但由于双链DNA解链不充分，且探针结合量较少，所以探针携带的标记也少，显色信号强度较弱，但多数靶DNA仍能被检测。随着变性温度的升高，双链解开增多，探针结合量增大，显色也增强[7]。但解链温度过高则会增加探针与底物DNA的非特异性结合，出现假阳性或较深的背景。
综上所述，此次试验通过改变EBER原位杂交变性温度，在一定范围里（55℃≦T≦75℃），随着变性温度的升高，阳性表达的程度效果越强，70℃时最稳定，得到的结果最可靠，75℃时反而出现较深的背景，假阳性率高，特异性降低。
【参考文献】
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[6]李琳，田玉旺，朱红艳等.应用EBER原位杂交检测EB病毒的体会[J].诊断病理学杂志，2011，4(18):311.
[7]吕亚利，张杰.原位杂交变性温度对杂交信号强度的影响[J].中华病理学杂志，1995， 24(1): 62.
论文作者:李佳嘉,徐国祥,何雷,梅晶晶,张伟璇,程姣
论文发表刊物:《医药前沿》2015年12月第35期
论文发表时间:2016/5/6
标签：阳性论文; 原位论文; 探针论文; 温度论文; 组织论文; 强度论文; 显色论文; 《医药前沿》2015年12月第35期论文;