孟永宏[1]2003年在《促进植物内生真菌Y_3菌株过量产生紫杉醇的研究》文中指出本文以产紫杉醇植物内生真菌Y_3菌株为出发菌株，对菌体的生长代谢以及碳源，前体(苯丙氨酸、酪氨酸、乙酸铵)和过氧化氢对生物量、紫杉醇含量的影响进行了研究。并对发酵提取物内的紫杉醇用TLC、HPLC、毛细管电泳和MALDI—TOF进行了定性定量分析。结果表明Y_3菌株的最适碳源为葡萄糖；苯丙氨酸的添加浓度为100mg/L，酪氨酸的添加浓度为9mg/L，乙酸铵的添加浓度为20mg/L；过氧化氢对Y_3菌株产紫杉醇有明显的促进作用，当以8h为时间间隔，添加浓度为8mmol/L时，紫杉醇的含量可达700μg/L，比对照提高9倍以上。 另外，对Y_3菌株作了鉴定，经初步鉴定其为国内外首次报道的产紫杉醇少根根霉(Rhizopus arrhizus Fischer)。
承曦[2]2008年在《蛇足石杉内生真菌抗AD症活性的初步研究》文中研究指明阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病,是中老年常见病。目前,世界人口正逐渐迈入老龄化,AD病也日益增多。研究表明,其发病机理是由于一系列级联反应引起的神经元损伤和神经细胞凋亡。其中,乙酰胆碱能系统中的乙酰胆碱酯酶(AChE)、线粒体电子传递链(ETC)中释放出来的活性氧(ROS)以及Aβ可溶性寡聚体的聚集可能在级联反应中处于较为重要的地位。蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)属于石杉属(Huperzia),是一种珍贵的药用蕨类植物。从中分离得到的石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)是国内自主开发的成功治疗和延缓AD病的药物,它以高效可逆抑制AChE为主要作用,多靶点多途径治疗AD病症。但由于蛇足石杉繁殖能力弱,过度采摘造成其野生资源减少,甚至枯竭,但HupA的市场需求量大,因此解决其原料矛盾就是需要另辟新路。植物内生真菌能产生大量新的天然产物,有些内生真菌还可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物,已成为天然产物潜在的重要资源。据此,本研究采用改良体外AChE抑制活性试验以及H_2O_2诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤为筛选模型,对野生蛇足石杉的内生真菌代谢产物进行多活性初筛,逐步聚焦活性菌株。对活性菌株代谢产物进行初步的动力学关系、理化因素稳定性以及急性毒性的研究。最后运用活性检测指导下的靶向跟踪,确定该菌株代谢产物中的活性部位,并做初步的分析。本文为探索性研究,旨在从蛇足石杉内生真菌代谢产物中发现缓解和治疗AD病的活性成分,开拓新的活性筛选方法,为研究新的AD病天然药物提供思路。主要研究内容如下:1、采用改良后的DTNB法对蛇足石杉内生真菌代谢产物进行了体外AChE抑制活性筛选。结果表明:从根部分离得到内生真菌g5、xg、g8具有显着抑制AChE的活性,其IC_(50)分别达到:434.17μg/mL、293.53μg/mL、285.62μg/mL,且初步判断其抑制类型为可逆抑制。HPLC法对g5、xg、g8发酵液进行检测,发现其中不存在HupA。2、采用MTT法检测了蛇足石杉内生真菌g5、xg、g8代谢产物拮抗由H_2O_2诱导的神经细胞氧化应激损伤。检测结果及细胞形态学观察表明,预先给予0.5～5000μg/mL剂量的g5菌株代谢产物醇提液,均能有效的对抗H_2O_2诱导的神经细胞氧化应激损伤,同样剂量下的xg、g8发酵醇提液样品却无保护作用。3、对g5菌株做了初步的形态学鉴定,结果表明g5菌株为半知菌目丛梗孢科青霉属褶皱青霉组(Penicillium.rugulosum)。4、对g5菌株代谢产物做了初步的AChE抑制动力学分析,确定其对AChE的抑制作用为混合竞争型可逆抑制。对游离酶抑制常数K_I与对酶底物络合物的抑制常数K_(IS)分别为0.0789mL和1.1352mL。5、对g5菌株代谢产物的理化性质进行了初步的研究,结果表明,代谢产物中抑制AChE的活性物质耐热及耐紫外辐射;急性毒性试验表明,g5菌株发酵液为低毒毒性。6、以活性检测指导下的靶向跟踪为手段,对g5菌株代谢产物进行了系统分离。结果显示,乙醚及乙酸乙酯部位具有显着抑制AChE的活性,且MTT及形态观察结果表明乙醚及乙酸乙酯部位对H_2O_2诱导的神经细胞氧化应激损伤均具有显着的保护作用,但对该损伤无治疗作用。7、对g5菌株代谢产物进行了初步分离及分析。乙酸乙酯萃取g5菌株代谢产物中的活性成分,PTLC分离制备活性组分Y-e,GC-MS初步分析Y-e中含有甲羟戊酸类及烟酸等活性物质,有报道称其具有抗AChE的作用。8、对活性组分Y-e拮抗H_2O_2诱导的神经细胞氧化损伤进行了初步的研究。MTT结果表明503μg·mL~(-1)～50.3ng·mL~(-1)的组分Y-e能有效拮抗由H_2O_2诱导的神经细胞氧化损伤,在一定剂量下的组分Y-e可上调胞内SOD的活性水平及GSH的产生效率,显着降低LDH的胞外漏出量。
张建萍[3]2012年在《除草微生物Ophiobolin A毒素合成相关基因研究》文中指出蛇孢菌素化合物具有除草、抑菌、杀线虫、抗肿瘤细胞等活性，在农业和医药领域都有很好的应用前景。但是由于蛇孢菌素化合物是真菌体内产生的一类次生代谢产物，因此产量极低，限制其商业化生产。因此采用各种手段提高蛇孢菌素的产量，使其达到工业化生产的水平是促进其广泛应用的重要研究方向。为解决蛇孢菌素产量低的问题，从两个方面开展研究：一是对产蛇孢菌素真菌蟋蟀草平脐蠕孢菌（Biopolaris eleusines）转录组进行测序，获得高质量的EST序列，以此为线索，采用RACE技术克隆蟋蟀草平脐蠕孢菌中蛇孢菌素合成途径关键酶基因，为今后利用基因工程手段提高真菌中蛇孢菌素产量奠定基础；二是初步研究了单一化合物茉莉酸甲酯对蟋蟀草平脐蠕孢菌产蛇孢菌素合成相关基因表达的影响。本研究取得如下结果：首次对蟋蟀草平脐蠕孢菌转录组进行测序，研究其基因表达谱，挖掘其功能基因。共获得26,555,560条高质量EST，序列平均长度为559bp。所得序列经聚类合并拼接后得到32,100条高质量的单基因簇（Unigene），数据库中的序列同源性比较表明，其中97.9%（31432条）序列与其它生物的已知基因具有不同程度的同源性。通过BLAST与KEGG Pathway分析获得了可能与萜类化合物合成相关的60条Unigene，分别编码合成途径中17个酶。分析还发现转录因子序列76条。这些基因的发现为二倍半萜类化合物蛇孢菌素生物合成研究奠定基础，同时也为蟋蟀草平脐蠕孢菌转录组研究提供了基础数据。克隆了蟋蟀草平脐蠕孢菌中蛇孢菌素合成途径上第一个限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（BeHMGR, GenBank accession No. JQ780844）的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。该基因全长3906bp，含有一个3474bp的开放阅读框，编码一个具有1157个氨基酸残基的蛋白，BLASTP分析显示，该基因编码的氨基酸与其它真菌的HMGR有较高相似性。其中与小麦黄斑叶枯病原真菌(Pyrenophora tritici-repentis)有93%相似性和86％一致性。荧光定量PCR分析发现，BeHMGR基因的表达受茉莉酸甲酯诱导。克隆了蟋蟀草平脐蠕孢菌中蛇孢菌素合成途径上重要前体物异戊烯基焦磷酸异构酶基因（BeIPPI, GenBank accession No. JQ780840）的全长cDNA序列，该基因全长1059bp，含有一个672bp的开放阅读框，编码一个具有223个氨基酸残基的蛋白，BLASTP分析显示，该基因编码的氨基酸与其它真菌的IPPI保守结构域以及催化活性位点的氨基酸残基都完全一致，但是在C端比其它蛋白缺失40个左右的氨基酸残基，该基因是否是一个有功能的IPPI基因还有待于下一步基因功能验证。克隆了蟋蟀草平脐蠕孢菌中蛇孢菌素合成途径上关键酶法尼基焦磷酸合成酶基因（BeFPPS, GenBank accession No. JQ780841）的全长cDNA序列，该基因全长1186bp，含有一个1044bp的开放阅读框，编码一个具有347个氨基酸残基的蛋白。BLASTP分析显示，BeFPPS基因编码的氨基酸与其它真菌的FPPS有较高相似性，其中亲缘关系最近的是大麦网斑病菌（Pyrenophora teres f. teres），氨基酸序列一致性达89%。克隆了蟋蟀草平脐蠕孢菌中蛇孢菌素合成途径上关键酶香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因（BeGGPPS, GenBank accession No. JQ780842）的全长cDNA序列，该基因全长1666bp，含有一个1305bp的开放阅读框，编码一个具有434个氨基酸残基的蛋白。蛋白质序列多重比对结果表明，BeGGPPS与其它真菌来源的GGPPS具有较高同源性，BeGGPPS含有典型的异戊烯基转移酶5个氨基酸保守区（I－V），BeGGPPS系统发育树分析表明，BeGGPPS与小麦黄斑叶枯病菌（P. tritici-repentis）中GGPPS蛋白有更近的亲缘关系。初步研究了茉莉酸甲酯对蟋蟀草平脐蠕孢菌蛇孢菌素A相关基因表达的影响。研究发现茉莉酸甲酯处理后能诱导蛇孢菌素A合成途径上BeHMGR, BeIPPI, BeFPPS和BeGGPPS基因的高表达。本研究测定了蟋蟀草平脐蠕孢菌转录组序列，首次从该菌中分离克隆了4个蛇孢菌素生物合成关键酶基因，初步研究了茉莉酸甲酯对蛇孢菌素合成基因表达水平的影响。这些研究结果为深入阐明蛇孢菌素生物合成的分子机制奠定了重要基础，也为蛇孢菌素的代谢工程提供了更多可能的调控靶点，具有重要的理论意义和应用价值。
冉茜[4]2009年在《基于响应面方法优化截短侧耳素发酵产量》文中指出截短侧耳素(Pleuromutilin)是从伞菌科北凤菌(Pleurotus mutilus)和Pleurotuspasseckerianus Pilat中分离到的二萜化合物,具有独特的抗菌机理——选择性的结合于原核生物的核糖体50S亚基,抑制肽键形成,不影响真核生物及哺乳动物的蛋白质合成。截短侧耳素在临床应用上有良好的安全性,而且对多种多耐药菌有很好的治疗效果,其衍生物作为兽用或人用抗生素都有广阔的市场前景。不断增加的市场需求,迫切需要提高作为合成前体的截断侧耳素发酵水平和产量,由此来满足医疗卫生事业的需要。本实验采用响应面方法优化发酵培养基,获得最佳培养条件,以期最大程度的提高截短侧耳素的发酵单位产量。主要研究内容包括以下几个方面:对pH、二级种子液种龄、接种量以及装液量等培养条件进行优化的单因素实验,采用PB(Placken-Burmen design,PB)实验筛选对响应值具有显着影响的因素,通过中心组合设计(Central Composite Design,CCD)实验进行响应面优化,将获得的摇瓶发酵最优配方,并在50L发酵罐开展验证实验。通过单因子筛选实验确定了以二级种子液培养时间为60h,接种量为10%(v/v)、并确定发酵培养基消前pH为6.7;应用PB实验进行七因素两水平筛选出显着因子的,通过对实验数据进行统计分析得知:葡萄糖、玉米浆和黄豆饼粉P均小于0.05,对截短侧耳素的产量影响显着,并得到确定因子R~2为0.90的一阶线性回归方程Y(g/L)=3.762+0.189X_1+0.413X_2-0.446X_3+0.248X_4+0.579X_5-0.002X_6+0.203X_7;运用叁因素五水平的中心组合实验对这叁个显着因素进行实验设计,并对数据进行拟合得到确定因子R~2为0.91的二阶回归方程Y(g/L)=6.03+0.453X_2+0.293X_3+0.551X_5-0.16X_2×X3-0.147X_2×X_5+0.106X_3×X_5-0.595X_2~2-0.25X_3~2-0.498x_5~2。各因素的最佳培养基组成为(g/L):豆油,20;黄豆饼粉,25;玉米浆,5;可溶性淀粉,10;葡萄糖,70;MgSO_4·7H_2O,0.5;CaCO_3,0.9。叁轮模型产量验证Y1=6.12±0.31g/L,Y2=6.10±0.29g/L和Y3=6.11±0.02 g/L与预测产量Y=6.05±0.37g/L相近,验证实验确定了模型的稳定性;并在此基础上确定发酵终点和通气量等工艺参数,使产量得到进一步提高。进行了50L发酵罐优化培养基验证实验,通过在线控制和调控pH值(补碱)、氨基氮、还原糖、溶氧量、转速、菌体量等过程参数的观察,发现发酵过程中菌体生长和合成产物的规律,使截短侧耳素的产量得到显着增加。我们发现从12h到48h是一个菌体迅速积累的过程,菌体量从12%积累到56%;从发酵12h开始溶氧量出现大幅下降,根据前期实验以15%作为临界溶氧量,通过调整转速和空气流量来维持发酵过程中对溶氧量的要求:氨基氮含量在0h到36h期间从165.2 mg/100mL下降到61.6 mg/100mL,60h到168h维持在117.6 mg/100mL左右,168h后开始上升至126 mg/100mL;整个发酵过程中pH是一个变化的过程,0到24h pH下降,从24h开始pH开始上升96h时达到最大值7.07,从96h到180h是一个pH下降的过程,伴随这个下降过程,截短侧耳素的开始大量积累,由于发酵末期的到来180h到192hpH出现上升趋势,并且菌体量开始下降,菌体开始自溶。原始培养基发酵180小时单位产量为3.29±0.33g/L,通过响应面方法优化后180小时发酵单位产量达到6.06±0.04g/L;对优化后摇瓶配方再进行发酵终点和通气量工艺改进,192小时发酵单位产量达到6.67±0.21g/L,与优化前相比单位产量(180小时)提高了102.64%;在发酵摇瓶模型建立和验证完毕后进行50L发酵罐放大生产,发酵罐192小时发酵单位产量达到了10.06±1.09g/L,是优化后(192小时)摇瓶产量的165.9%,未进行优化(180小时)单位产量的305.8%;在摇瓶模型验证的过程且放大过程中产量与预测值模型稳定性良好,达到了实验的预期目的。
参考文献：
[1]. 促进植物内生真菌Y_3菌株过量产生紫杉醇的研究[D]. 孟永宏. 西北大学. 2003
[2]. 蛇足石杉内生真菌抗AD症活性的初步研究[D]. 承曦. 江苏大学. 2008
[3]. 除草微生物Ophiobolin A毒素合成相关基因研究[D]. 张建萍. 中国农业科学院. 2012
[4]. 基于响应面方法优化截短侧耳素发酵产量[D]. 冉茜. 西南大学. 2009