白冰[１－２] 贺楠[１] 荆旭[２] 张晨轩[３] 石玉晓[１]
１．山西省临汾市公安局 山西 临汾 ０４１０００;２．中国农业大学理学院应用化学系 北京 １００１９３;３．山西师范大学化材学院 山西 临汾 ０４１０００
【摘要】 以葫芦脲为主体的超分子化学近年来得到了快速发展,目前已成为超分子化学中最为活跃的研究领域之一,许多无荧光或弱荧光物种采用传统的荧光分析方法无法实现荧光测定,因此使之在药代动力学监测和痕量测定方面变得十分困难.近年来,通过建立的新型荧光探针体系葫芦脲－异喹啉类药物使许多无荧光的药物建立了高灵敏度的分析方法.本论文旨在借助这一新型荧光探针体系,采用荧光光谱法、核磁共振波谱法、密度泛函理论等手段从实验和理论两个方面研究了盐酸克伦特罗与葫芦脲主－客体之间的相互作用,确立了这一探针体系与目标分析物的作用机理,建立了无荧光的盐酸克伦特罗的荧光探针新方法. 【关键词】 葫芦[７]脲, 克伦特罗, 荧光滴定法, 荧光探针【Abstract】Inrecentyears,withtherapiddevelopmentofthesupramolecularchemistryofthemainbodyoftheurea,themostactiveresearchfieldsofthesupramolecularchemistryhavebecomeoneofthemostactiveresearchfields．Inrecentyears,anewtypeoffluorescentprobesystemhasbeenestablishedfortheestablishmentofahighsensitivityanalysismethodformanynonfluorescentdrugs．Thisthesisisforthepurposeofusingthisnovelfluorescentprobesystem,clenbuterolandcucurbiturilhostguestinteractionswasstudiedfromtheaspectsofexperimentandtheorybymeansoffluorescencespectroscopy,nuclearmagnetＧicresonancespectroscopy,densityfunctionaltheory,establishthemechanismoftheprobesystemwithatargetanalyte,nofluorescenceofclenbuterolhydrochloＧridefl【uKoeryeswcoerndtsp】robemethodwasestablished． cucurbit[７]uril,clenbuterol,fluorescencetitration,fluorescenceprobe 【中图分类号】R９６【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０４０２－０２
１ 引言葫芦[n]脲(CB[n],n＝５８,１０,图２－１)是由n甘脲２N 亚甲基桥连接的单位组成的一系列新的南瓜形的具空腔化合物.带有疏水空腔和内衬脲羰基的限制性极门户大环的形状酷似空心桶,这些特点意味着CB[n]与各种客体分子在水溶液中能形成明显稳定的包合物[１－６].Megyesi等发现CB[７]和小檗碱包合物的形成导致荧光增敏.Li[７]已经展开了对CB[７]－异喹啉类生物碱包合物的超分子相互作用的研究,并且利用其卓越的光学性能用于分子识别和异喹啉类生物碱和其他药物的测定.利用荧光探针滴定法研究无荧光药物与葫芦脲的相互作用才刚刚起步.葫芦脲与巴马汀组成的荧光探针体系由于具有高的灵敏度和选择性成功地用于多种无荧光药物的测定.
图１ 葫芦[７]脲,巴马汀,克伦特罗的结构Fig．１ThestructuresofCB[７],PAL,CLB 盐酸巴马汀(PAL,图１)是一种天然的异喹啉生物碱.它在水溶液中呈现微弱荧光,然而,加入CB[７]后荧光强度剧烈增敏.盐酸克伦特罗(CLB,图１)是一种β受体激动剂,提高瘦肉和脂肪的比例,增加了饲料的转化效率.盐酸克伦特罗也叫做“瘦肉精”,应用为肉类加工厂的饲料添加剂.然而,一旦动物食用了克伦特罗,它会残留在肉和肝脏等组织中,然而人一旦食用可能产生中枢神经等疾病[８－１０].因此,很多国家包括中国、美国、欧洲在内的很多国家禁止食用克伦特罗作为饲料添加剂.因此快速灵敏的克伦特罗分析方法在食品,药物等领域方面引起了人们持续的兴趣.对于在生物和药物样品的克伦特罗的测定已有一些检测方法报道,包括气相色谱法,高效液相色谱法,电化学传感器等方法.借用没有荧光现象的克伦特罗,再使用荧光探针法进行测定,运用这种比较精、准、快的方法使动物组织中的克伦特罗被测定,得到了令人满意的结果.
２ 实验部分２．１ 仪器 瑞荧光光谱和强度均在一个带有脉冲灯的澳大利亚安捷伦荧光分光光度计上测定,激发和发射光谱的狭缝宽度均为５nm.所有的测量在１０mm 的石英杯中进行,测量温度２５．０±０．５℃.pH 值调节采用pHS– ３TC型数字酸度计(中国上海雷磁仪器),配有玻璃甘汞复合电极.１H NMR 谱采用瑞士布鲁克公司的DRX－６００ MHz核磁共振波谱仪来测定,使用溶剂为氘代水. ２．２ 试剂 实验所用巴马汀和盐酸克伦特罗均购买自中国药品生物检定所. 使用二次蒸馏水配制克伦特罗储备液１００μgmL– １.使用二次蒸馏水配制巴马汀储备液１．０mM.CB[７]根据最新报道的过程制备,其储备液１．０mM 用水稀释得到.所有的标准储备液在室温下可稳定存在几个星期.所有的化学药品均为分析纯,整个试验过程均使用二次蒸馏水.
２．３ 实验步骤 将０．７mL０．２mM CB[７]溶液置于１０mL的容量瓶中,随后分别加入０．７mL０．２mM 的PAL溶液和１．０mL０．０１M 的盐酸溶液,随之加入适量克伦特罗溶液,用二次水定容至刻度,混合液在室温下充分振摇１５min. 以３４３nm 为激发在４９５nm 处测定荧光强度,同时做试剂空白.
３ 结果与讨论３．１ CLB对CB[７]－PAL包合物荧光的的猝灭 通过光学惰性的主体分子CB７和弱荧光发射的客体分子巴马汀超分子包合物的形成建立了强的荧光探针体系,CB[７]－PAL包合物能发射强的荧光,在向PAL－CB[７]包合物加入克伦特罗后导致了强烈的荧光猝灭.图２－２显示了加入不同浓度克伦特罗后PAL－CB[７]包合物的荧光光谱图.随着克伦特罗浓度的增大,荧光强度明显减弱,这可能归因于克伦特罗与巴马汀对CB[７]空腔的的竞争.克伦特罗将部分巴马汀分子从葫芦脲空腔中挤出,因此由于克伦特罗与CB[７]形成了一种新的包合物使得PAL－CB[７]的荧光强度减弱.
图１ 在CB[７]－PAL的１．０mM HCl的溶液体系中加入CLB的荧光光谱图,其中ex＝３４３nm,CLB 的浓度为(μgmL–１):(a)０;(b)０．８;(c)１．６;(d)２．４;(e)３．２;(f)４．０;CCB[７]＝ CPAL ＝１４．０μΜFig．２FluorescencespectraofCB[７]－PALinthepresenceofCLBin１．０mMHClaqueoussolutionwithex＝ ３４３nm．TheconcentrationsofCLB (μgmL –１):(a)０;(b)０．８;(c)１．６;(d)２．４;(e)３．２;(f)４．０．CCB[７]＝ CPAL ＝１４．０μΜ ３．２ CLB浓度对CB[７]－PAL包合物荧光强度的影响 研究了PAL浓度对CB[７]/PAL包合物荧光强度的影响.CB[７]/PAL体系从１．０到２０．０ 变化PAL的浓度.随着PAL浓度的增加,CB[７]/PAL包合物的荧光强度逐渐增强,直到CB[７]饱和时的最大包合平衡.本文中,PAL作为一个荧光探针,它的浓度的选择是非常关键的.如果选择的PAL的浓度很低,探针的灵敏度将会很低,另一方面,一个很高的浓度将不利于分析物得到一个最优的检测限.综合考虑以上所述,PAL最佳浓度为１４．０.
３．３ pH 的影响 在pH１．０– １２．０值范围内,研究了pH 值对ΔF的作用. 实验结果表明,在pH 值１－７范围内ΔF值最大且没有明显变化.但随着pH 的增大,ΔF值剧烈减小.这是由于在碱性介质中,碱阳离子很容易与CB[７]的羰基作用,碱阳离子的结合减小了有机客体进入的速率常数[１０].我们的研究结果表明,在碱性介质中钠盐的存在不仅使PAL 结合到CB[７]的平衡常数减少,而且也减小了荧光量子产率.因此,用盐酸来固定本实验的pH 为３．０. ３．４ 温度和反应时间的影响 本实验考察了温度在１０– ８０℃值范围内对此分析方法灵敏度的影响.当温度高于４０℃时,高温会破坏探针体系,包合物的解体导致了荧光发射信号突然降低,加入麻黄碱水溶液后的荧光信号变化值将会减小,最终影响方法的灵敏度.当温度在１０– ３５℃范围内,荧光发射信号没有发生明显变化,因此选择室温２５℃进行实验.本实验还考察了时间对拟肾上腺素药麻黄碱的影响,当加入麻黄碱组成三元混合溶液后,实时监测溶液的荧光发射信号,三元混合溶液在５min时信号达到稳定,并且在５h内不发生明显变化,因此在加入麻黄碱５min后便可进行测定.
３．５ 荧光探针的机理 巴马汀在水溶液中表现出微弱的荧光发射,因为巴马汀的异喹啉环和苯环不在同一平面上,这种结构阻止了共轭的形成.当葫芦脲加入到巴马汀的水溶液中,巴马汀的异喹啉环和苯环近乎处于同一平面,导致巴马汀分子荧光增强.诱导了巴马汀的氮正离子和葫芦脲的羰基静电作用.巴马汀的非极性部分进入到葫芦脲的空腔.在葫芦脲空腔中,巴马汀的分子自由运动减小,因此也减小了非辐射越迁的可能性.同时,可以防止在水猝灭巴马汀的单线态. 分子模型通过高斯０３B３LYP/６－３１G(d)密度泛函理论计算.所以克伦特罗当加入到CB[７]－PAL体系后,巴马汀和克伦特罗竞争与葫芦脲结合.一些巴马汀随着克伦特罗的加入被挤出葫芦脲的空腔.葫芦脲与克伦特罗的能量最小化模型如图３所示,无论是叔丁基还是苯环包结进了葫芦脲空腔,N 原子都临近羰基的端口.巴马汀的光学性质主要依赖于它所处的微环境.克伦特罗的加入导致了巴马汀离开了CB[７]的空腔,因此减小了巴马汀的荧光.
图３ 能量最小化结构CB[７]－CLB的配合物. 颜色代码:CLB,紫色;CB[７],蓝色Fig．３Energy－minimizedstructureofCB[７]－CLBcomplexes．Colorcodes:CLB,purple;CB[７],blue 图４表示在CB[７]－CLB包合物核磁共振图谱.核磁共振结果与理论计算得出的结构相符.与图７A 的没有结合的克伦特罗核磁共振比较,结合了的图７B克伦特罗Ha,Hc的信号同时向高场和低场移动,高场移动表明部分分子进入葫芦脲空腔,低场移动表明分子位于葫芦脲端口的羰基边缘.如果叔丁基进入葫芦脲空腔,Ha信号移向高场Ha’信号处,Hc信号移向低场Hc’ 信号处.相反,如果苯环进入葫芦脲空腔,Hc信号移向高场Hc’’信号处,Ha 信号移向低场Ha’’信号处.这些发现表明巴马汀分子由于CLB的加入被挤出葫芦脲的空腔.这样的结果符合前面的讨论.
图４ 在氘化水中溶解的CB[７]－CLB 饱和体系(A),CLB(B)的核磁共振图谱Fig．４１H NMRspectra(６００ MHz)ofCB[７]－CLBcomplex(A),CLB(B)inD２O． 总之,巴马汀和克伦特罗与CB[７]空腔的疏水结合,N＋和葫芦脲羰基端口的电子偶极相互作用和氢键决定了主客体络合物的结构.由于克伦特罗极好的大小和尺寸匹配,它比巴马汀与CB结合的更紧密.
３．６ 干扰物质的影响在应用这个荧光方法测定实际样品之前,猪肉中脂肪、蛋白质、淀粉、胆固醇等物质的影响在克伦特罗０．２gmL–１的浓度下测定.３０００倍克伦特罗的物质先进行测定,如果产生干扰,减小比例直到干扰消失.判断的标准定为误差±５％.结果表明常见辅药对测定没有干扰.在测定药物制剂实际样品的时候,没有其他辅药干扰物的结构类似克伦特罗.所以,背景没有干扰,表明测定动物组织中的克伦特罗具有很高的选择性. ３．７ 校准曲线和灵敏度 在所描述的最佳条件下,克伦特罗标准曲线F随着克伦特罗浓度变化作图,线性范围是０．０１１– ４．２μgmL– １.克伦特罗的相关系数分别是０．９９９７,检出限是０．００４μgmL– １.线性方程是ΔF ＝ ９３．１C＋１．１. ３．８ 分析应用 这个设想的方法已经应用于测定猪肉组织中的克伦特罗. 取１５g的猪肉匀浆,转移到５０mL的离心管,加入一定量的克伦特罗和醋酸铵缓冲液,斡旋震荡３min,取上清液,加入２０mL正己烷斡旋提取,重复操作.浓缩后用二次水转移到比色管中,进行分析,回收率为见表１,回收率和准确性令人满意.
表１猪肉样品中CLB的测定(N＝５)Table１．DeterminationofCLBinspikedporcinemuscle(n ＝５)
４ 结论葫芦[７]与巴马汀的新的荧光体系可用于测定克伦特罗.由于克伦特罗存在下强烈的猝灭作用,这种荧光方法测定水溶液中克伦特罗的具有高度的灵敏度和选择性.这个方法的灵敏度高于文献的其他光谱方法.另外,这种方法已成功应用于测定动物组织中的克伦特罗.该方法也可作为无荧光和弱荧光的荧光物质的传感器.有关研究正在进行中.同时,相互作用模型通过理论计算得到确定.荧光探针和克伦特罗的作用机理被核磁共振证实.
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论文作者:白冰[１－２] 贺楠[１] 荆旭[２] 张晨轩[３] 石玉晓
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/3
标签：巴马论文; 荧光论文; 克伦论文; 葫芦论文; 空腔论文; 探针论文; 浓度论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;